土壤盐渍化是干旱半干旱地区一个重要的土地退化问题^[1]。内蒙古河套灌区位于我国西北干旱地区，该地区耕地盐渍化面积约为3.94×10⁵ hm²，占总耕地面积的68.65%^[2]。近年来，种植向日葵已经成为河套地区当地农民主要经济来源之一^[3]。但是由于河套地区春季土壤表层盐分过高，向日葵作物常出现出苗难、减产甚至绝产的现象^[4]。在耐盐碱植物根际，蕴藏着大量有益微生物资源，有些菌株本身具有较高的耐盐能力，同时可显著提高植物的耐盐能力，并具有促生、防病、抗衰老等作用，应用于植物根际可大幅度提高作物的耐盐、抗旱性和生物产量，从而达到改善和利用盐碱地的目的^[5]。微生物菌剂是从土壤或植物体内经筛选、分离后得到的一类菌群，再经过发酵等一系列工业化处理将这些微生物扩增培养后加工成一种液态或固态的活菌制剂，将其应用到农作物上，能够实现绿色无污染的现代化农业生产模式^[6]。因此，开展盐碱地高效微生物菌剂筛选与应用研究在河套灌区具有十分重要的现实意义。

有研究表明施用微生物菌剂能够降低土壤的pH，增加土壤的速效养分含量^[7-9]，并且施入微生物菌肥有利于改善土壤的微生物结构，增加土壤细菌、放线菌的数量，但会降低真菌的数量^[10]。此外植物根际促生菌也被广泛应用于优化土壤环境，其中芽孢杆菌属（Bacillus）、黄杆菌属（Flavobacterium）是现在常用植物根际促生菌菌株中的两类^[11]。芽孢杆菌具有存活期长和抗逆性强等特点，广泛分布在不同的土壤和植物根际中，有的也可以侵入植物组织内部，该属中的许多菌株以其固氮能力、对致病菌的抗性和对植物的促生作用而受到研究者的广泛关注^[12-13]。其中，解淀粉芽孢杆菌不仅能够分泌吲哚乙酸、抗菌蛋白、酶或多肽等活性物质，还具有较高的溶磷功能，降低土壤pH，提高作物抗盐碱胁迫的能力，促进植物生长，防治植物真菌病害等^[14-15]。而特基拉芽孢杆菌（Bacillustequilensis） 不仅可耐受5%盐度，分泌吲哚乙酸、细胞分裂素、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（ACCD）和嗜铁素等，还具有降解有机磷、拮抗腐霉菌功能^[5]。此外，Verma等^[16]还证实了特基拉芽孢杆菌可以作为铁载体生产剂。黄杆菌功能菌是从土壤中筛选的，具有与植物共生的优势，并能够分泌吲哚乙酸促进植物生长，适应盐碱土的不利生长环境^[6]。

总的来看，目前有关芽孢杆菌属、黄杆菌属微生物菌剂对盐碱地向日葵作物生长、土壤微生物群落等影响的报道较少。因此，本研究通过盆栽试验，利用配制的功能微生物菌剂在重度盐碱化土壤开展向日葵生长及土壤微生物影响效果的对比试验，以期为河套灌区盐碱化土壤向日葵专用的微生物菌剂的生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

该试验所需的土壤取自内蒙古五原县隆兴昌镇向日葵农田土壤，采样深度为0～40cm，土壤质地为粉砂壤。土壤平均含盐量6.7g·kg^-1，pH 8.5，全氮0.55g·kg^-1、全磷0.70g·kg^-1、全钾18.30g·kg^-1、碱解氮31.89mg·kg^-1、有效磷6.93mg·kg^-1、速效钾113.76mg·kg^-1，有机质9.21g·kg^-1。该试验供试向日葵品种为TF9041。

该试验采用的编号为ACCC19743、ACCC19833的菌株均由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供，分别对应的菌株名称为 Bacillus amyloliquefaciens （解淀粉芽孢杆菌）、Bacillus tequilensi（特基拉芽孢杆菌）。ACCC19743菌株具有分泌吲哚乙酸、产铁载体的功能，ACCC19833菌株具有产铁载体的功能^[6]。

菌剂的制作过程：配制150mL TSB液体培养基置于250mL摇瓶中，高温灭菌后冷却至室温，然后将平板交叉实验中的2株功能菌株从各自生长良好的TSA固体培养基上挑选单菌落接种于TSB液体培养基中，在28℃、175r·min^-1 摇床中培养3～5d，即可得到种子菌液。将促生且安全性能较好的ACCC19743、ACCC19833菌液（有效活菌数>10×10⁸ CFU·mL^-1）分别用草炭吸附，即获得微生物菌剂（有效活菌数>5×10⁸ ·g^-1，含水量30%）。

1.2 试验设计

盆栽试验在中国农业科学院控制温室内进行，试验期间温室气温为25～29℃。试验所用塑料盆上开口下封底，盆高12cm，直径15cm，每个盆装1.3kg土。ACCC19833、ACCC19743两种微生物菌剂的施用方法：分别将两种0.6g固体菌剂与1.3kg土搅拌混匀后进行装盆，然后均匀灌水500mL淋洗盐分，以不施菌剂为对照（CK）。试验期间在第1对真叶出来后每4d等量浇水1次，每次浇水量为200mL，共灌溉18次。试验材料于11月1日播种，每盆点播4穴，每穴1颗，穴距6cm，3次重复。第2对真叶出来后定苗，每盆留3棵苗，培养72d至向日葵现蕾期时试验结束。

1.3 取样方法与数据测定

1.3.1 土壤pH测定

试验结束后，在两株向日葵中间取土，带回实验室自然风干，磨碎，过2mm筛，以1∶5的土水比提取土壤溶液上清液，用pH计（FE20）测定土壤pH。

1.3.2 向日葵株高、地上部干物质量测定

试验结束时对每盆中的向日葵测量株高取平均值，植株地上部于105℃恒温箱中杀青30min，而后将温度降至80℃烘干至恒重，计算地上部干物质量。

1.3.3 向日葵叶面积、SPAD值的测定

分别量取每片叶片的长和宽，采用公式计算得到叶面积，计算公式：叶面积=长 × 宽 × 系数。利用SPAD-502便携式叶绿素仪在向日葵现蕾期分别进行向日葵叶片SPAD值的测定。每盆选择一株具有代表性的植株，在每棵植株的相同部位选取生长正常的功能叶，于9：00～11：00进行测定，每次测定3个重复数据。

1.3.4 根际土壤样品细菌群落测定

在试验结束后，拔出向日葵根部，轻轻抖落掉根周围松散的土壤，然后用刷子刷取黏附在根际表面的土样，将土样放入牛皮纸袋并迅速保存于4℃冷藏箱中，带回实验室进行土壤细菌群落的测定。称取约0.5g经冷冻干燥处理的土壤样品，采用Fast DNA Spin Kit for Soil DNA抽提试剂盒（MP Biomedicals，USA），参照其使用说明提取样品中的总DNA。并用1%凝胶电泳（电压5V·cm^-1，时间为20min）检测提取的DNA质量，同时用Nano Drop 2000UV-Vis Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific，USA）测定浓度。

细菌使用16S rRNA基因通用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）进行目的基因扩增。PCR反应参数：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共27个循环，最后在72℃下延伸10min。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。通过Miseq PE300平台（Illumina， USA）进行测序。

原始序列使用Fastp（V 0.20.0）进行质控，再用Flash（V 1.2.7）进行拼接，最终得到有效序列数据。使用Uparse对97%相似水平上进行操作分类单元（OTUs）聚类，根据OTUs聚类结果，对每个OTUs的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的相对丰度分布情况，同时，对OTUs进行相对丰度、Alpha多样性计算等分析，得到样品内物种丰富度和均匀度信息、不同样品或分组间的共有和特有OTUs信息等。

1.4 数据处理

采用Excel2016进行数据处理与图表制作，使用SPSS 22.0进行数据的方差比较，LSD法进行差异显著性检验（P<0.05）。图表数据均为3次重复的平均值 ± 标准误。

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂对土壤pH、含盐量的影响

向日葵收获后不同处理土壤pH、含盐量的变化如图1所示，ACCC19743处理土壤pH较CK处理显著下降了0.17个单位（图1a），ACCC19833处理土壤pH与CK处理间无显著差异。说明施用ACCC19743微生物菌剂能明显缓解土壤的酸化程度。但施用微生物菌剂处理与CK处理间土壤含盐量无统计学差异（图1b）。

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。下同。

2.2 微生物菌剂对向日葵SPAD值的影响

由图2可知，ACCC19743处理下向日葵叶片SPAD值显著高于CK处理，平均比CK处理提高了8.72%（P<0.05）；ACCC19833处理平均比CK降低了4.05%，但与CK处理差异不显著。这表明施用ACCC19743菌剂处理能显著提高向日葵SPAD值，有利于向日葵进行光合作用，进而促进向日葵更好的生长发育。

2.3 微生物菌剂对向日葵农艺性状的影响

各处理向日葵农艺性状变化如表1所示，微生物菌剂处理下向日葵叶面积、株高、地上部干物质量均显著高于CK处理。与CK处理相比， ACCC19743处理下向日葵叶面积、株高、地上部干物质量均最大，分别显著提高了7.52%、57.67%、 46.51%（P<0.05）；ACCC19833处理下分别显著提高了5.35%、46.67%、27.91%。并且ACCC19743与ACCC19833处理在向日葵叶面积、株高、地上部干物质量指标差异均达显著性水平。说明盐碱地施用微生物菌剂明显提高了向日葵叶面积、株高、地上部干物质量，其中ACCC19743处理优势更明显。

注：表中数值为平均值 ± 标准误，同列数值后不同小写字母表示不同处理间差异达显著性水平（P<0.05）。下同。

2.4 微生物菌剂对土壤微生物群落丰富度和多样性的影响

土壤微生物多样性影响土壤生态系统的结构、功能及过程，是土壤生态系统最重要的控制因子，也是维持土壤生产力的重要组分^[17]。通过对不同处理细菌群落多样性和丰富度分析发现，施用不同微生物菌剂对土壤微生物多样性和丰富度指数均未产生显著性影响（表2）。

2.5 门水平上土壤细菌群落组成

不同处理在门分类水平上土壤细菌群落组成如图3所示，其中变形菌门（Proteobacteria）相对丰度最高，占54.61%～57.68%，平均为56.06%；其次为拟杆菌门（Bacteroidetes），占15.31%～17.28%，平均为16.49%，随后依次为放线菌门（Actinobacteria， 3.84%～6.66%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes， 4.50%～5.86%）、绿弯菌门（Chloroflexi，3.56%～4.29%）、厚壁菌门（Firmicutes，2.80%～3.88%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，1.65%～2.50%）、酸杆菌门（Acidobacteria，1.59%～2.21%）、Parcubacteria （0.83%～1.91%）、浮霉菌门（Planctomycetes，0.83%～1.08%）、蓝藻门（Cyanobacteria，0.37%～2.50%）、螺旋体菌门（Saccharibacteria，0.76%～1.68%）。不同处理下门水平优势微生物均为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门，CK处理中变形菌门的相对丰度均低于其他2个处理，其中ACCC19743处理的变形菌门的相对丰度最大，较CK处理提高了3.07%，而其余菌门的相对丰度在ACCC19743和ACCC19833处理下的响应不同。具体表现为：ACCC1974处理有利于拟杆菌门、Parcubacteria的相对丰度， ACCC19833处理有利于拟杆菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门的相对丰度。说明在细菌群落组成前十的菌门中，ACCC19743处理增加了相对丰度较大的变形菌门、拟杆菌门和相对丰度较小的Parcubacteria菌门；而ACCC19833处理增加了相对丰度第二的拟杆菌门和相对丰度居中的芽单胞菌门和厚壁菌门。

3 讨论

在农业生产中，微生物制剂的应用越来越广泛，我国利用具有特殊功能微生物制成的多种微生物制剂在农业上取得了较好的效果，大量研究显示其能够促进盐碱地作物生长发育和提高产量^[10]。王婧等^[18]对微生物菌剂和微生物菌肥在盐渍土向日葵上的应用效果研究得出，施用微生物菌剂和菌肥均可降低耕作层土壤盐分，显著提高向日葵产量，且菌剂与无机肥配施增产效果较好。本试验中，在盐碱土中施用微生物菌剂后不同程度地提高了向日葵叶面积、株高、地上部干物质量及SPAD值，其中ACCC19743菌剂处理优势更明显。一方面可能是由于微生物菌剂施入后，与作物产生根际效应，刺激微生物活性，促进土壤养分转化，提高土壤养分含量^[19]；另一方面可能是由于ACCC19743菌剂不仅能够产吲哚乙酸等诱导性物质，还具有产铁载体的功能，而铁元素是植物叶绿素合成、氧化还原反应等一些重要生理活动所必需的^[20]，因此提高了向日葵叶片叶绿素含量和光合作用效率，并阻止根系周围病原微生物的繁殖^[20]。

土壤pH能够反映盐碱土壤改良状况，与土壤微生物的活性、土壤养分的释放与固定、有机质的分解等密切相关^[21]。施用微生物菌剂可以提高土壤脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶等活性，通过酶活等代谢活动降低土壤pH^[19]。本研究发现，ACCC19743处理下土壤pH最低，较CK处理显著下降了0.14个单位，这可能是由于施用ACCC19743菌剂后产生的各种有机酸、硝酸等酸性代谢产物以及铁载体，使其周围环境酸化引起的^[6]。有研究表明，在碱性土壤中溶解的三价铁离子较少^[20]，而施用ACCC19743菌剂后土壤pH显著低于ACCC19833菌剂处理，并且ACCC19833菌剂产铁载体能力低于ACCC19743菌剂，造成产生的铁载体-铁复合物较ACCC19743菌剂少，因此ACCC19833菌剂处理下叶片SPAD值较ACCC19743菌剂低。土壤含盐量过高会引起土壤渗透势增加，水分和养分有效性降低，从而阻碍作物生长，降低其生产力^[22]。本试验中施用ACCC19743、ACCC19833微生物菌剂处理与CK处理间土壤含盐量均无显著差异。这可能是由于向日葵本身耐盐性较强，加上根系活动引起的扩散作用以及植物蒸腾作用引起离子质流造成一部分盐离子进入植株体内，但本盆栽试验向日葵植株对盐离子的吸收有限，故各菌剂处理间无显著差异。土壤微生物中细菌的种类和数量最多^[23]，并能分解各种有机物质，本研究中各处理在土壤细菌群落多样性 （Shannon指数和Simpson指数）和丰富度（ACE指数和Chao1指数）的差异均未达到显著性水平，这与张慧敏等^[23] 发现盐分胁迫对土壤细菌群落α-多样性Shannon指数和Simpson指数无显著影响的结果相似，这一方面可能是因为细菌对盐胁迫环境有较快的适应能力，另一方面可能与土壤本身的特征以及微生物菌剂有关^[24]。

通过对各处理中土壤细菌群落组成分析发现，各处理中门水平优势微生物均为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门，占所有菌门的76%以上，说明这三大优势菌门能够适应盐胁迫环境，生存能力较强，其中，变形菌门占所有菌门的54%以上。本研究发现2个微生物菌剂处理下的变形菌门相对丰度均高于CK处理，其中ACCC19743处理最高，说明菌剂的添加能够增加变形菌门的相对丰度， ACCC19743处理增幅最大，这与大部分研究^[25-26] 发现变形菌门在盐胁迫环境下相对丰度最高相一致，说明变形菌门的耐盐能力较强^[27]，而且有研究表明，变形菌门相对丰度与土壤全碳、全氮呈正相关^[28]，这是因为变形菌门下的根瘤菌能够与植物组成共生固氮系统，增加微生物活性，提高土壤养分含量^[29]。有研究发现拟杆菌门属于中度嗜盐菌，是盐碱土中的优势种群，与土壤盐分呈显著正相关^[21]，但对土壤全碳、全氮以及有效磷等无显著影响^[30]。本研究中拟杆菌门是仅次于变形菌门的第二大优势菌门，尤其是施用ACCC19743菌剂后，拟杆菌门相对丰度较CK提高了2.0%，说明添加菌剂能够增加拟杆菌门的相对丰度，进而增强其对盐碱的抗性。这与张慧敏等^[23]研究表明在盐碱胁迫下，拟杆菌门显著增加相类似。

4 结论

施用微生物菌剂后能不同程度地提高向日葵的叶面积、株高、地上部干物质量及SPAD值，其中ACCC19743处理优势更明显。

施用ACCC19743微生物菌剂可以显著降低土壤pH，在一定程度上调节土壤酸碱度；高通量测序分析结果表明，不同处理门水平相对丰度及组成发生了一定的变化，其中ACCC19743处理显著增加了变形菌门、拟杆菌门的相对丰度。

综合考虑，施用功能微生物菌剂后对土壤pH、向日葵生长以及优势菌群的影响，推荐在河套灌区重度盐碱地施用ACCC19743菌剂。

参考文献