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玉米是甘肃省种植面积最广泛的粮饲兼用作物。随着草牧业的发展，玉米种植面积逐渐扩大，不利于轮作倒茬，致使土壤也缺少休养生息的机会。目前的种植模式以连作为主，长期连作会出现植株矮小、叶片褐色斑点、叶缘枯焦、植株发育缓慢、节间变短、叶片条纹状失绿等症状[1]。尽管玉米是耐连作的作物，但长期连作对玉米的高产稳产仍然存在潜在风险[2]。集约化种植会引起农业化学污染、加速土地退化和高抗性害虫的传播等缺点[3]，亟待科学、高效、绿色的解决措施，为粮食生产、农业可持续发展提供坚实的保障。
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生物多样性的维持对生态系统的长期可持续发展至关重要，土壤微生物群落的组成和丰富程度在生态系统中起着关键作用，可以预测多种生态系统功能，例如植物多样性和生产力、土壤碳同化和养分循环等[4]。土壤生物多样性随时间的推移保持更多和更少可变的生态系统功能，从而稳定多种生态系统功能，并在集约化管理土壤中，土壤生物多样性正迅速下降，其中四分之一的土壤现已退化，导致生物生产力降低[5]。
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利用植物促生菌（PGPB）作为生物制剂促进植物生长、改善植物健康和生产力，并缓解连作障碍等已有大量的报道[6-8]，PGPB在解决土壤因过量施用化肥所引起的生态环境污染问题具有重要作用[9]。PGPB对植物的促生作用通过多种机制以各种直接和间接的方式促进植物的生长发育。大量研究表明微生物能合成植物激素[10]，吲哚乙酸（IAA）是最重要的植物激素之一，可改善根部表面积，根、根毛和侧根的形成和伸长，增加养分和水分的吸收，从而影响植物的整体生长发育[11]。土壤中的磷大多不能直接被植物吸收利用，能将土壤中难以吸收利用的磷转化为植物可吸收利用的磷，溶磷细菌具有重要作用[12]。研究表明，甘肃水砂田玉米土壤有效磷含量自1983年以来呈逐渐升高的趋势，但磷素仍中度短缺[13]，与全国相比，河西地区土壤磷素属中等偏下水平[14]。氮素对生物生存十分重要，土壤中微生物的固氮作用是土壤氮素的主要来源之一，固氮微生物具有将氮气转化成氨的能力[15]。PGPB资源丰富，具有多功能促生的PGPB菌属也已有大量报道[16]。万兵兵等[17]在砂质潮土中分离的5株玉米PGPB中筛选出1株具固氮、解磷、解钾及产IAA的 Bacillus 属菌株。You等[18]从玉米根系筛选出1株具溶解无机磷和解钾能力的 Burkholderia cenocepacia CR318，发现能显著促进玉米植株和根系的生长。
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从不同连作年限土壤中分离细菌已有大量研究，但全面地从玉米短期连作不同年限分离并筛选具促生肥效功能细菌的研究报道较少。本试验在常规的连作耕作方式下，选取甘肃7年连作玉米，从土壤分别分离并筛选出具有产IAA、溶磷、固氮等促生功能的细菌，挖掘出更多的当地微生物资源，筛选出与当地玉米长期种植品种相匹配，竞争性强的高效促生菌，为后期开展促生菌株及促生组合菌株与玉米植株互作影响的研究以及为高效复合微生物接种菌剂的研发和应用奠定坚实的理论基础和实践依据。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料
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1.1.1 土壤样品
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2019年12月采自甘肃省张掖市民乐县六坝镇玉米不同连作年限的土壤，连作年限分别为1、2、 3、6、7年，分别编号为C1、C2、C3、C6、C7。
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1.1.2 培养基与试剂
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牛肉膏蛋白胨培养基（NA）[19]用于细菌的分离纯化与保藏，PKO（Pikovaskaias）无机磷培养基[19]用于溶无机磷能力的测定，孟金娜有机磷培养基[19] 用于溶有机磷能力的测定，阿须贝 （Ashby）培养基[17] 用于固氮菌的分离纯化与保藏，无氮培养基[19]用于固氮菌的固氮酶活性的测定，具体配方见相应参考文献。
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1.2 试验方法
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1.2.1 玉米不同连作年限土壤样品细菌的分离
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使用NA固体培养基和Ashby固体培养基梯度稀释法处理各连作年限土壤样品[19]。置于30℃的恒温培养箱培养3～5d后，挑选颜色、形态不同的菌落进行连续划线分离纯化。
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1.2.2 细菌16S rRNA
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纯化后菌株进行16S rRNA提取，PCR扩增产物送至北京博迈德基因技术有限公司进行测序，测序结果提交到http：//ezbiocloud.net/数据库进行比对。用MEGA 7.0进行邻近法聚类分析，并构建系统发育树，Bootstrap值为1000。
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1.2.3 产IAA能力的测定
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从NA培养基分离纯化得到的细菌参照Libbert等[20]的方法初步筛选产IAA菌株，测定单位体积发酵液中IAA的含量。
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1.2.4 溶磷能力的测定
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将从NA培养基分离纯化的细菌接种于有机磷和无机磷培养基，于30℃中培养7d，观察有无溶磷圈的出现。对阳性菌株再次培养，根据菌株形成的溶磷圈直径（D）/菌落直径（d）确定各菌株溶解有机磷和无机磷能力的大小[21]。
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1.2.5 固氮能力的筛选及固氮酶活性的测定
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从Ashby培养基分离中纯化的细菌用相同培养方法连续传代3次筛选，将生长良好的菌株视为具有固氮能力的菌株。参照舒健虹等[22]的方法，采用青岛科创质量检测有限公司的固氮酶（NITS）酶联免疫分析试剂盒测定。通过标准曲线计算样品中NITS的活性，其中回归方程为Y=100.723x-6.1694， R2=0.9994。
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1.3 数据处理
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采用Excel 2016和SPSS 26.0对数据进行统计和多样性分析，用单因素方差分析和多重比较进行差异显著性检验，方差齐性检验用Turkey检验法， P<0.05代表有显著性差异。
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2 结果与分析
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2.1 玉米连作7 年土壤中细菌的分离与初步鉴定
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从所有样品分离获得了共224株细菌，不同种属的细菌共200株，隶属于56个属（图1、2）。其中NA培养基分离得到163株，从Ashby培养基分离得到37株。所筛菌属中丰度最高的为 Pseudomonas，占总菌株的18.50%。此外 Bacillus 菌属18株、Arthrobacter 菌属15株、Microbacterium 菌属10株、Streptomyces 菌属10株。不同连作年限土壤样品分离细菌中，C1有50株，属于31个属；C2有33株，属于17个属；C3有31株，属于18个属；C6有38株，属于21个属；C7有48株，属于25个属。各连作年限分离到细菌丰度最高的属均为 Pseudomonas， C1有6株细菌、C2有8株细菌、C3有5株细菌、 C6有7株细菌、C7有11株细菌。此外，优势菌属还包含 Bacillus、Microbacterium、Arthrobacter、 Pseudarthrobacter、Paenarthrobacter、Streptomyces、 Agrobacterium、Luteimonas、Ensifer、Pseudoxanthomonas、 Agrococcus、Rhodococcus、Pararhizobium、Pseudoclavibacter、Lysobacter、Paeniglutamicibacter、Kocuria、 Aeromicrobium、Brevundimonas、Paenibacillus、 Staphylococcus、Dietzia、Neorhizobium、Cytobacillus、 Tenotrophomonas、Brevibacterium、Azotobacter 27个属。其中，Pseudomonas 与上述前16个菌属在至少3个年份都被分离到。
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图1 各连作年限可培养细菌代表菌株16S rRNA基因序列基于邻近法的系统进化发育树
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图2 各连作年限可培养细菌属分类信息
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2.2 菌株产IAA功能评价
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NA培养基分离出的173株菌中有34株细菌具有产IAA的能力，分布于15个菌属，其中 Pseudomonas 为丰度最高的菌属（15株）。各连作年限中C7（7个属）产IAA菌株的丰富度及多样性最高，其他依次为C2、C1、C6、C3。各菌株分泌IAA能力的试验结果表明：供试菌株产IAA的能力有很大差异，分泌量在（1.28±0.05）～（3.80±0.33）mg/L之间，菌株 Glutamicibacter sp.NC75分泌IAA的能力最强，分泌量为（3.80±0.33）mg/L，Brebacillus sp.NC77分泌IAA的能力次之，为（3.68±0.41）mg/L （表1）。
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2.3 不同连作年限细菌溶磷能力功能评价
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溶解有机磷试验结果表明：上述供试细菌共筛选出25株具溶解有机磷能力的菌株，分布于7个菌属，Pseudomonas 为丰度最高的菌属（15株）。研究表明，菌株溶磷圈直径与菌落直径比值（D/d）范围在1.00～2.00之间则表明该菌株溶磷能力中等，NC716、NC349、NC226、NC235、 NC213、NC642、NC751、NC155共8株溶解有机磷的能力高于中等值，且均属于 Pseudomonas。各连作年限中溶解有机磷能力菌株的丰富度及多样性为C7>C2>C6>C1>C3。溶解有机磷能力试验结果表明，供试菌株溶解有机磷的能力有明显差异，溶磷率在（1.07±0.03）～（3.14±0.15） 之间，菌株 Pseudomonas sp.NC716溶解有机磷能力最强，为 （3.14±0.15），Pseudomonas sp.NC349溶解有机磷能力次之，为（3.00±0.37）（表2），其溶解有机磷的效果见图3a。
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注：“+”表示阳性结果，依据溶磷率不同分为4个等级：1～1.5为 +-；1.5～2.5为 +；2.5～3为 ++；3～3.5为 +++。
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溶解无机磷的试验结果表明：上述供试细菌共筛选出19株具有溶解无机磷能力的菌株，分布于8个菌属，Pseudomonas 为丰度最高的菌属（12株）。溶解无机磷能力菌株的丰富度及多样性为C6>C7>C2>C1>C3。菌株溶解无机磷能力试验表明，供试菌株溶解无机磷的能力有较大差异，溶磷率在（1.03±0.4）～（2.00±0.17）之间，其中菌株 Pseudomonas sp.NC213溶解无机磷能力最强，为（2.00±0.17），Pseudomonas sp.NC645溶解无机磷能力次之，为（1.77±0.46）（ 表2）。NC213、 NC28溶无机磷效果见图3b。综上结果可知，菌株 Pseudomonas sp.NC213、Pseudomonas sp.NC226、Pseudomonas sp.NC645、Microbacterium sp.NC76和 Pseudomonas sp.NC716共5株菌均有产IAA、溶解有机磷和无机磷的能力。
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2.4 不同连作年限细菌固氮能力的情况
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Ashby培养基分离出51株固氮菌，经16S rRNA鉴定，各连作年限不同菌属有37株，分布于17个属。经无氮液体培养基筛选出26株优势固氮菌。以本实验室分离的1株具固氮能力的 Bacillus sp.LB6-1为阳性对照，对优势固氮菌测定固氮酶活性表明，Ensifer（4株）和 Pseudomonas（3株） 为丰度最高的菌属。各连作年限中固氮菌株的丰富度及多样性为C6>C2>C7>C1>C3。菌株固氮能力试验结果表明：供试菌株固氮能力有很大差异，固氮酶活性在（22.52±0.53）～（38.96±0.64）U/g之间。菌株 Azotobacter sp.AC21固氮酶活性最高，为 （38.96±0.64）U/g，Agrobacterium sp.AC13固氮酶活性次之，为（38.53±0.28）U/g（表3）。AC220、AC21固氮效果见图3c。
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注：“+”表示阳性结果，依固氮酶活性分为3个等级：20.00～30.00U/g为 +；30.00～35.00U/g为 ++；35.00～40.00U/g为 +++。
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图3 部分菌株溶解有机磷、溶解无机磷和固氮能力效果
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2.5 可培养细菌与促生功能菌株分析
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综上所述，可培养细菌的分离在种植第1年较高，随连作年限的增加，其多样性与丰富度在第2年下降后一直呈上升的趋势；促生功能筛选试验共对224株供试菌测定产IAA、溶无机磷、溶有机磷、固氮的能力，共筛选出81株具有上述功能的细菌，其中55株具产IAA、溶无机磷和有机磷的功能，26株为优势固氮菌。具促生功能细菌的丰富度及多样性随连作年限的增加呈上升的趋势，具体表现为先增加，于第3年下降再增加（图4）。
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图4 各连作年限分离细菌与筛选促生功能细菌数量
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3 讨论与结论
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微生物的多样性与土壤健康及作物产量等息息相关，高微生物多样性和生态系统多功能性存在显著的正相关关系[23]。研究表明，微生物多样性降低是玉米长期连作（几十年）最显著的表现之一，土壤生物多样性丧失和土壤群落组成单一化会损害和抑制植物多样性、养分保持和养分吸收等多种生态系统功能[4-5]。本试验从玉米7年连作土壤中共分离出隶属于56个属的细菌224株。不同连作年限分离细菌的丰富度及多样性为C1>C7>C6>C3>C2，筛选肥效功能细菌为C7>C6>C2>C1>C3，二者的丰富度及多样性相协同变化，均在C3降低后随连作年限的延长呈上升趋势，表明7年连作可明显影响玉米土壤细菌群落，但产生的连作障碍问题有待进一步研究。也有研究长期连作会使土壤由细菌型转为真菌型，仅通过可培养分离细菌的方法并不能表明7年内连作玉米不产生连作障碍，应结合土壤中真菌的丰度和产量等因素辩证说明。本试验各连作年限及肥效功能细菌的优势菌属均为 Pseudomonas，其丰富度及多样性也随连作年限的增加而上升，分析认为这与 Pseudomonas 在土壤中的重要地位及施肥方式等息息相关[24-25]。此外，以 Pseudomonas 为首的17个优势菌属在至少3个年份中都存在，推测7年连作对此类菌属的影响较小，是土壤中可稳定存在的类群。细菌及肥效细菌的多样性和丰富度随连作年限的变化，推测是由于荒土环境中，随玉米生长与连作等耕作措施下，打破了荒土原有稳定的微生物群落结构，通过植物-土壤-微生物不间断的相互作用，以 Pseudomonas 为主的微生物类群重建，适于玉米生长的微生物群落结构的过程。这可能与玉米是耐连作作物密切相关，由此推测也可能是玉米初期连作对土壤的影响相对耐连作作物较低的原因之一。本试验中分离得到的 Bergeyella、Moheibacter、 Cytobacillus、Lacisediminihabitans、Neobacillus、Serinibacter 等属较少被报道，增加了土壤可培养细菌的范畴。
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绝大多数已被报道的高产IAA、溶磷菌株主要属于 Pseudomonas、Bacillus、Azotobacter、Bradyrhizobium、Burkholderia、Rhizobium、Azospirrulam 和 Rhizobia 等[26-27]。许多能够通过共生或非共生固氮的菌株，大部分属于 Alphaproteobacteria、 Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Firmicutes 和 Cyanobacteria[28]。本试验分别筛选出具有产IAA、溶解有机磷、溶解无机磷和固氮能力的菌株各34、25、19和26株，具有以上各肥效功能细菌的丰富度及多样性随连作年限的增加均呈上升的趋势，与耐连作药用植物怀牛膝的结果一致[29]；并且优势菌属均为 Pseudomonas，与Tilak等[30]结果一致，其作为目前促生菌中研究较多的细菌，是重要的菌种资源；此外，Ensifer 在固氮功能的筛选丰度与 Pseudomonas 并列。本实验中不同肥效功能菌株的能力及多样性也具有差异：产IAA能力较高的菌属依次是 Glutamicibacter、Brevibacillus、 Ensi fer、Pseudomonas 等，研究发现 Glutamicibacter 可促进平菇生长并提高其产量[31]，有耐盐的能力[32]。因此，本试验 Glutamicibacter sp.NC75菌株可能有耐盐潜力；溶解有机磷能力高于中等值的8株菌中丰度最高的为 Pseudomonas，并且其与 Microbacterium、Pseudarthrobacter、Dietzia 等4个属均有溶解有机磷和无机磷的能力；固氮酶活性中较高的依次是 Azotobacter、Agrobacterium、Pseudomonas、Ensifer、 Lysobacter 5个属，研究发现在谷物、豆类等经济作物生长发育中根系会积极招募固氮微生物[33-34]， van Deynze等[35]发现玉米气生根分泌物可高效固氮。此外，Pusillimonas 具有产IAA的能力及Dietzia和 Moheibacter 在溶磷功能上研究较少，扩充了土壤可培养细菌肥效功能的资源。本试验与舒建虹等[22]均用NITS酶联免疫分析试剂盒测定菌株的固氮酶活性，也有研究表明能否高产胞外多糖也是固氮菌筛选的一项指标[36]，只检测菌株并不足以表明菌株的固氮能力。因此，仅通过上述测定方法判断固氮酶活性并不严谨，但本试验筛选的固氮菌仍有固氮能力的潜力，需要进一步进行试验验证。
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微生物促进植物生长的机制有多种，而且可兼具多种促生机制[6]。本试验筛选出5株可同时产IAA、溶解有机磷和无机磷功能的细菌。各连作年限中，具多功能肥效细菌的丰富度及多样性与连作年限的增加呈正比。经鉴定具有2种以上功能的19株菌，隶属于5个属，其中 Pseudomonas 为优势菌属。张广志等[37]从多年栽培菜地土壤分离筛选出20株兼具解磷和反硝化活性的细菌，其中高效解磷细菌中具显著反硝化活性的有10株均属于 Pseudomonas。因此，本试验筛选出的5株多功能细菌可为微生物肥料生产菌株的潜在多功能菌种，是否具有生防功能也值得深入研究，相比外源微生物，其在甘肃玉米农业实践中作为生物修复剂或生物防治剂更有竞争力，可在后期进行盆栽及大田试验并追踪监测。
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摘要
为深入了解饲用玉米连作对土壤微生物多样性的影响，对甘肃区采集的连续 7 年种植玉米土壤中可培养细菌的多样性和促生细菌资源进行全面地分析和挖掘。分别利用富营养（NA）和选择性（Ashby）培养基进行可培养细菌的分离，对获得菌株进行 16S rRNA 基因测序和比对分析，评价其产植物生长素（IAA）、溶磷、固氮等能力。自不同年份土壤中共分离得到各类细菌 224 株。菌株功能评价结果表明，34 株具有产 IAA 的能力，25 株具溶解有机磷的能力，19 株具溶解无机磷的能力，27 株具有较高的固氮酶活性，有 5 株可同时具有产 IAA 和溶磷的功能。可培养细菌分离信息分析结果表明，种植玉米土壤的细菌及肥效菌株的丰富度及多样性随着连作年限的增加呈逐渐上升趋势，优势菌属均为 Pseudomonas，广泛分布于各年份的土壤中，且表现出优秀的产 IAA、溶磷及固氮的能力。研究表明，玉米 7 年连作可明显影响土壤菌群结构，土壤中蕴藏着丰富的有益功能细菌资源。分离的功能菌株为研制适用于甘肃玉米绿色生产的微生物肥料提供信息与优良菌种支撑。
Abstract
The purpose of this study was to understand the effects of continuous cropping of forage maize on the diversity of soil culturable bacteria resources and the growth-promoting bacteria，which were obtained from the soil with 7 consecutive years of maize planting in Gansu and comprehensively analyzed．In this study，the culturable bacteria were isolated using eutrophic medium（NA）and selective medium（Ashby），and 16S rRNA gene sequencing and comparative analysis were performed on the obtained strains，the ability of producing plant growth hormone（IAA），dissolving phosphorus and fixing nitrogen was evaluated．A total of 224 strains of bacteria were isolated from soil of different continuous cropping years．The results of functional evaluation of microbial strains showed that 34 strains had the IAA production ability，25 strains had the organic phosphorus dissolving ability 19 strains had the inorganic phosphorus dissolving ability，27 strains showed high nitrogenase activity，and 5 strains had both IAA production and phosphorus dissolving ability．The results of information analysis of culturable microorganisms showed that the bacterial richness and diversity of soil under maize cultivation and fertile strains increased with the increase of continuous cropping years．The dominant genus of culturable bacteria was Pseudomonas，which was widely distributed in the soil with different continuous cropping years and showed excellent ability of producing IAA，dissolved organic phosphorus，inorganic phosphorus and nitrogen fixation．This study shows that 7-year continuous cropping of maize can significantly affect the structure of soil flora，and the soil contains abundant resources of growth-promoting bacteria．The isolated functional strains can provide information for the development of microbial fertilizer suitable for production of green maize and growth-promoting strains support in Gansu Province.
Keywords
silage corn ； continuous cropping ； bacteria ； microbial fertilizer