水分胁迫是指土壤缺水而明显抑制植物生长的现象^[1]。伴随着全球气候变化而来的极端干旱和降水事件发生的频率及强度不断加剧^[2]，必将导致大范围的土壤水分剧烈变化。根际是连接植物根系与土壤的活跃界面，是植物-土壤-微生物相互作用的场所^[3]，也是植物最先感应到外界环境胁迫的土壤区域。已有研究证实，土壤水分变化对根际土壤过程和生态系统功能的影响主要取决于地上的植被类型和地下的微生物群落^[4]。水分胁迫改变作物叶绿素含量，破坏作物光合器官，阻碍作物代谢过程和根系生长^[5]；而作物生长中不断释放的分泌物为微生物提供了养料并刺激酶活性^[6]。因此，水分与作物之间动态而复杂的相互作用共同塑造着根际微生物群^[7]。

微生物和酶是土壤元素循环、作物养分供应的重要调控者，也是最敏感和最具潜力的土壤生物学指标^[8]，它们对水分胁迫和作物品种均有明显的响应^[8-9]。冯帅等^[3]发现，玉米根际土中细菌数量在水分充足条件下均显著高于干旱条件。水分胁迫使玉米等作物根际微生物群落组成和结构发生明显变化^[3，9-10]。刘方春等^[10]发现，一定强度的干旱可以提高根际土壤微生物群落多样性，过度干旱则会导致其多样性降低。Song等^[11]研究表明，水分胁迫增加了苗期玉米根际土壤蛋白酶活性，但在拔节期、抽穗期和灌浆期其活性却降低，且水分胁迫对各时期的脲酶活性均无显著影响；同一作物在不同品种间根际土壤微生物数量、结构和多样性差异显著^[12-13]；熊淑萍等^[14]发现，不同冬小麦的根际土壤脲酶活性差异明显；张旭龙等^[12]也发现，不同油葵品种间根际土壤脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性不同。可见，水分胁迫下作物根际土壤微生物群落和酶活性的改变会因水分胁迫程度和作物品种的不同而有所差异。

然而，以往多是研究不同的耕作和管理措施 （覆膜、施肥、深耕等）造成的土壤水分变化对根际土壤微生物和酶活性的影响；探究水分胁迫和不同作物品种共同作用下根际土壤微生物和酶响应的研究仍欠缺。而且，探讨不同生育期内微生物和酶活性对水分胁迫的响应对确定土壤水分对作物的胁迫时间具有重要意义。鉴于此，本研究以玉米根际土壤为研究对象，比较在2种水分条件（水分胁迫和正常供水）下2个玉米品种（“郑单958” 和“农华101”）对3个生育期的根际土壤微生物组成及酶活性的影响，以期明确土壤水分、作物品种、微生物和酶活性之间的内在联系。这不仅有助于解析土壤微生物应对不同水分条件和作物品种的生态响应规律，也可为水资源集约利用、抗旱玉米品种选育和应对干旱对农业生产的挑战提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验土壤和玉米品种

试验所用土壤采自河南省封丘县（35°04′N， 113°10′E）典型潮土耕层（0～20cm）。土壤风干，碾碎，过2mm筛，混匀备用。土壤初始性质为：pH 8.07，有机质含量12.40g·kg^-1，全氮含量0.69g·kg^-1，全磷含量0.77g·kg^-1，全钾含量18.58g·kg^-1，砂壤质地。试验选种的是“郑单958”（P1）和“农华101”（P2）这2个在黄淮海平原大面积种植的高产玉米品种，且这2个品种在抗旱性状上差异较大^[15]。

1.2 试验设计

盆栽试验始于2016年6月18日。根据国家农业旱情等级标准，0～40cm土层的含水量低于田间持水量的60%、50%和40%时，分别表示农业上轻度、中度和重度干旱发生^[16]。据此，试验共设4个处理，即在水分胁迫（W1，土壤含水量占田间持水量40%）和正常水分（W2，土壤含水量占田间持水量80%）条件下分别种植玉米“郑单958”（P1）和“农华101”（P2）。每个处理重复3次，分3个生育期采样，共36盆。每盆（上直径34cm，下直径26cm，高26cm）装土12kg，播种4粒种子，待发芽后间苗至每盆2株。试验用化肥为尿素、重过磷酸钙、硫酸钾，分别以N 240mg·kg^-1、P₂O₅ 90mg·kg^-1 和K₂O 270mg·kg^-1 作底肥一次施用。于苗期（2016年7月1日）过后开始控水，每隔3d称重法补充水分，维持土壤含水量在设定水平。盆栽平时露天放置，下雨时移至温室中。

1.3 根际土壤样品采集及酶活性测定

分别于玉米大喇叭口期（2016年7月29日）、灌浆期（2016年9月1日）、成熟期（2016年10月5日）采用抖落法破坏性采集根际土样，每盆中2株玉米的根际土充分混匀作为一个样品。土样挑除植物残体，过2mm筛，保存在-20℃冰箱中用于测定微生物群落组成和酶活性。土壤中蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶和脱氢酶活性分别采用3， 5-二硝基水杨酸比色法^[17]、靛酚蓝比色法^[17]、 Tabatabai等^[18]的方法和三苯基四唑氯化物比色法测定^[17]，其活性分别以单位质量烘干土在37℃恒温下培养24h后产生的葡萄糖、铵态氮、硝基酚和甲臜数量表示。

1.4 根际土壤微生物群落PLFAs测定

微生物群落结构采用磷脂脂肪酸（PLFA）生物标记法测定^[19]。用修正的Bligh和Dyer提取液 （柠檬酸缓冲液∶甲醇∶氯仿体积比为0.8∶2∶1）振荡提取磷脂，提取2次。合并2次提取液，加入氯仿-柠檬酸缓冲液（体积比为1∶1）静置过夜。提取混合液中的氯仿相，氮气吹干。再用氯仿溶解氮气干燥的样品，转移至硅胶柱（Waters公司， Massachusetts，美国）中，依次采用氯仿、丙酮和甲醇洗脱硅胶柱，收集甲醇相，氮气吹干。甲醇相磷脂用氢氧化钾-甲醇溶液皂化得到磷脂脂肪酸甲酯，然后用氮气吹干，-20℃冷冻保存。用正己烷将样品溶出，加入正十九烷酸甲酯作为内标物质，用气相色谱仪（Agilent 6850，美国）测定。进样量为2 μL，分流比为100∶1。程序升温：初始温度为170℃，然后以5℃·min^-1 升至260℃，后以40℃·min^-1 升至310℃，保持1.5min。色谱峰鉴定及峰面积采用MIDI（MIDI公司，Newark， DE，美国）计算。所用溶剂均为色谱纯，采用Frostegård等^[20] 的方法进行PLFA的系统命名。单个PLFA的丰度（nmol·g^-1）计算方法详见文献^[21]。根据各PLFA所表征的微生物类群^[19-20] （表1），统计某一类群的脂肪酸含量，并以此作为该类群的丰度。

1.5 数据统计分析

采用Shannon-Wiener多样性指数（H）、Pielou均匀度指数（J），PLFAs丰富度（S）来评价微生物群落α 多样性。计算公式如下^[21]：

式中，S 表示样品中PLFA生物标记的数目，即丰富度，P_i 表示第 i 个PLFA的丰度比例。

采用双因素方差分析分别检验不同水分条件和玉米品种处理间微生物类群丰度、群落α 多样性指标和酶活性的差异。基于Bray-Curtis距离对4个处理间微生物群落进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）。置换多元方差分析（Permutational Multivariate Analysis of Variance，PERMA NOVA）判断水分、品种及二者交互作用对微生物群落结构的影响。Pearson相关系数用于表征微生物类群丰度、α 多样性指标与4种酶活性的关系。 PCA分析采用STAMP（2.1.3）进行，微生物群落 α 多样性指标计算和PERMANOVA采用R（4.0.1） 中的“vegan”程序包完成；其余统计分析均采用SPSS 24.0完成。

2 结果与分析

2.1 水分胁迫和玉米品种对微生物群落组成的影响

3个生育期内，玉米根际土壤微生物群落组成均以细菌（平均占55.5%～68.5%）为主，放线菌（ 平均占6.4%～12.4%） 和真菌（ 平均占6.6%～9.3%）相对较低（表2）。双因素方差分析发现，玉米大喇叭口期，与正常水分相比，水分胁迫下根际土壤PLFA总量、革兰氏阴性细菌（G-）、丛枝菌根（AM）真菌丰度均显著降低 （P<0.05，表2），种植P1和P2它们的丰度分别降低了20.7%和13.4%、15.9%和16.6%、55.5%和4 0.2%。玉米灌浆期，水分胁迫使G-细菌、AM真菌丰度显著降低，种植P1和P2其丰度分别降低了13.4%和11.9%、59.4%和75.7%（P<0.05，表2）。玉米成熟期，水分胁迫显著降低了PLFA总量、细菌、普通细菌、革兰氏阳性细菌（G+）、革兰氏阴性细菌（G-）、AM真菌的丰度（P<0.05，表2），种植P1和P2它们的丰度分别降低了8.2%和23.2%、9.5%和21.5%、7.6%和15.9%、7.5%和24.2%、13.0%和25.1%、31.8%和80.6%（P<0.05，表2）。

两个玉米品种间只有灌浆期的AM真菌丰度存在显著差异（P<0.05，表2），W1和W2条件下种植P2比种植P1其丰度分别提高了5.6%和76.3%。水分与品种的交互作用显著影响了灌浆期放线菌和AM真菌的丰度以及成熟期AM真菌的丰度 （P<0.05，表2）。

2.2 水分胁迫和玉米品种对微生物群落多样性的影响

与正常水分相比，大喇叭口期，水分胁迫下根际土壤微生物群落的多样性指数和均匀度指数均显著升高，物种丰富度却显著降低（P<0.05，表3）。灌浆期和成熟期，水分胁迫下群落的均匀度指数均显著升高（P<0.05，表3）。两个玉米品种间，只有灌浆期微生物群落的多样性指数和均匀度指数存在显著差异。灌浆期，种植P2比种植P1根际土中微生物群落多样性指数和均匀度指数更低（P<0.05，表3）。水分与品种的交互作用对群落的α 多样性影响并不显著（P>0.05，表3）。

注：表中数据为平均值 ± 标准差，* 表示 P<0.05，** 表示 P<0.01，NS表示 P>0.05，差异不显著。下同。

2.3 水分胁迫和玉米品种对微生物群落结构的影响

主成分分析显示，PC1和PC2共可解释3个生育期土壤微生物群落的89.2%、89.1%和82.6%的变异（图1）。在玉米3个生育期，两种水分条件处理的样方群落均表现出明显的分异（图1）。进一步的置换多元方差分析表明，3个生育期水分胁迫下根际土壤微生物群落结构发生明显的改变 （P<0.01，表4），而两个玉米品种间的微生物群落结构相似（P>0.05，表4）；水分与品种的交互作用也对微生物群落结构有显著影响（P<0.05，表4）。

注：* 表示 P<0.05，** 表示 P<0.01。

2.4 水分胁迫和玉米品种对根际土壤酶活性的影响

与正常水分相比，水分胁迫显著降低了灌浆期根际土中脱氢酶活性（P1和P2根际分别降低30.8%和18.2%）和成熟期其碱性磷酸酶（P1和P2根际分别降低18.4%和23.1%）、脱氢酶活性 （P1和P2根际分别降低25.6%和22.2%），显著提高了成熟期其蔗糖酶活性（P1和P2根际分别提高75.6%和53.4%）（P<0.05，表5）。而种植P2比种植P1更能提高灌浆期根际土中的脱氢酶活性（W1和W2下分别提高了33.3%和12.8%，表5）。3个生育期，水分与品种的交互作用对4种酶活性均无显著影响（P>0.05，表5）。

2.5 水分和品种影响下的根际土壤微生物与酶活性的关系

Pearson相关分析（表6）发现，不同生育期，与碳、氮、磷转化有关的4种酶活性相关的微生物类群和群落α 多样性指标不同。玉米大喇叭口期群落的多样性指数、均匀度指数与碱性磷酸酶活性显著负相关；均匀度指数与脱氢酶活性显著负相关（表6）。灌浆期G+ 细菌丰度与蔗糖酶活性显著正相关；G-细菌丰度、物种丰富度与碱性磷酸酶活性显著正相关，放线菌丰度与碱性磷酸酶活性显著负相关；AM真菌丰度与脱氢酶活性显著正相关，群落多样性指数、均匀度指数与脱氢酶活性显著负相关（表6）。成熟期，G-细菌、AM真菌丰度与蔗糖酶活性显著负相关，均匀度指数与蔗糖酶活性显著正相关；普通细菌、G+ 细菌、 G-细菌、AM真菌丰度均与碱性磷酸酶丰度显著正相关，而群落均匀度指数与碱性磷酸酶丰度显著负相关（表6）。3个生育期，各微生物类群丰度和群落α 多样性各指标与脲酶活性相关性均不显著。

注：蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶活性的单位是mg·g^-1·24h^-1，脱氢酶活性的单位是μg·g^-1·24h^-1。

注：* 表示 P<0.05，** 表示 P<0.01。

3 讨论

3.1 水分和品种对根际土壤微生物的影响

本研究发现，从玉米大喇叭口期到成熟期，水分胁迫下，革兰氏阴性细菌和丛枝菌根真菌丰度始终保持下降；水分胁迫时间延长至成熟期，普通细菌和革兰氏阳性细菌丰度才开始下降；而真菌丰度未发生显著变化（表2）。这与以往的研究结果一致^{[3，9-10，22]}。已有研究表明，细菌丰度易受到水分胁迫的抑制，而真菌群落稳定性更高^[22]。革兰氏阴性细菌比革兰氏阳性细菌对土壤水分的变化更敏感^[7]，丛枝菌根真菌比真菌更敏感^[23]。分析其原因，各类微生物对水分胁迫的不同响应主要与它们对碳源的获取能力和生理构造上的差异有关^[9]。与革兰氏阴性细菌相比，革兰氏阳性细菌的细胞壁更厚更致密，其抗旱能力更强^[7]。丛枝菌根真菌具有庞大的菌丝结构，菌丝体网不仅影响土壤水气状况，还能促进作物对营养的吸收，因此，其对水分变化相对比较灵敏^[23]。而真菌比细菌对水分胁迫的耐受性更强，是因为真菌菌丝可延伸至根系外获取营养和水分，缓解水分胁迫带来的压力^[9]。

3个生育期，水分胁迫下微生物群落的均匀度指数均提高（表3），微生物群落结构发生了明显改变（图1，表4）。均匀度指数通常反映群落中全部物种个体数目的分配状况；如果各个物种都拥有相同数量，则物种均匀度高；反之，某些物种个体数量多，而另一些物种个体非常少，则物种均匀度低^[24]。水分胁迫下微生物均匀度的提高可能是因为在根际区域内，各物种的共同资源主要是水；物种间一旦为水发生相互争夺，必然导致一些物种在竞争中被淘汰，而保留下来的物种可能在数量上更趋于势均力敌，从而导致物种丰富度降低，而均匀度变大。这一点也可以从3个生育期相较于正常水分条件，水分胁迫处理的物种丰富度较低得到证实 （表3）。此外，丰度相对低的微生物类群对维持根际微生物群落功能至关重要^[25]。本研究中水分胁迫下微生物群落结构发生明显改变，可能是由含量相对较低的革兰氏阴性细菌和丛枝菌根真菌丰度的变化主导的。Lynch等^[26]发现，响应土壤水分变化的机会型微生物大多属于低丰度的稀有微生物类群，其丰度的改变主导了微生物群落结构的变化。比如，丛枝菌根真菌受到水分胁迫时不仅能增加渗透调节物质^[27]，还可将光合产物通过菌丝体以渗出液的形式传入土壤，并通过与其它微生物的协同作用而平衡微生物群落结构^[9]。

本研究发现，玉米品种对微生物丰度和多样性的影响因生育期不同而异。两个玉米品种间只有灌浆期的丛枝菌根真菌丰度、群落多样性指数和均匀度指数存在显著差异（表2，表3）。多项研究证实，作物品种不同，根际丛枝菌根真菌的丰度和微生物多样性存在差异^[6，28]。究其原因，可能是因为品种的差异直接决定根际分泌物的多样性和数量，而分泌物的多样性和数量是根际微生物区系建立的先决条件，在一定程度上主宰着根际微生物种群格局的变化^[29]。根系分泌物不仅为微生物提供能量，又可改变根际环境（比如土壤pH和氧化还原状况），从而直接或间接地影响了根际微生物^[6]。由于菌根真菌可通过增强或加速植物根或根毛的生长，调节植物相关基因来增强宿主植物抗旱性^[30]，因此，灌浆期“农华101”根际丛枝菌根丰度远比“郑单958”高（表2），也说明“农华101”可能更耐旱。

值得注意的是，水分与品种的交互作用显著影响了灌浆期的放线菌和丛枝菌根真菌丰度、成熟期的丛枝菌根真菌丰度（表2）和3个生育期的微生物群落结构（图1，表4），这也间接说明在作物特定的生育阶段，根际放线菌和丛枝菌根真菌的丰度可能同时受到水分和作物品种的双重调节作用。水分胁迫措施可能会刺激作物对特定的菌群作出选择，并与之建立联系以抵御环境变化^[31]。

3.2 水分和品种对根际土壤酶活性的影响

根际土壤酶既源于植物根系和微生物的分泌，也源于动植物残体的分解释放^[17]。本研究发现，水分胁迫降低了灌浆期的根际土中脱氢酶活性和成熟期碱性磷酸酶、脱氢酶活性，提高了成熟期蔗糖酶活性；而两个品种间只有灌浆期的根际土中脱氢酶活性存在显著差异（表5）。可见，水分、品种对酶活性的影响因作物生育期和酶类型不同而异。同时，也暗示着水分胁迫可能减缓了玉米灌浆期和成熟期根际土壤中磷的转化，但却有助于成熟期土壤中碳的循环，而对土壤中氮的周转影响较小。通常情况下，土壤水分增加可提高酶活性，直至土壤变为厌氧环境，底物扩散和氧气含量的限制使酶活性受到抑制^[32]。当土壤中水分降低到某一阈值形成水分胁迫时，也会抑制酶活性^[33]。Sardans等^[34]发现，土壤含水量减少10%～20%在很大程度上降低了脲酶和蔗糖酶活性。一般认为，水分通过影响土壤理化性质、有机质的有效性及扩散运输等改变土壤微生物丰度和群落结构，从而影响土壤酶的生产和活性^[35]。而在作物不同的发育阶段，品种间在根系状况、根分泌物种类和数量、微生物丰度和多样性方面的差异均可能会导致酶活性发生变化^[36]。这些可从本研究中水分或品种引起的土壤微生物丰度与多样性指标的变化，大多与酶活性之间存在显著相关关系得到验证（表6）。

4 结论

水分胁迫下，玉米3个生育期内根际土壤的革兰氏阴性细菌和丛枝菌根真菌的丰度以及成熟期的普通细菌和革兰氏阳性细菌丰度均受到抑制。水分胁迫提高了根际土壤微生物群落的物种均匀度并使群落结构发生明显改变，同时降低了灌浆期根际土中脱氢酶活性和成熟期碱性磷酸酶和脱氢酶活性；提高了成熟期蔗糖酶活性。2个品种间根际土中微生物类群丰度和酶活性差异相对较小，仅在灌浆期，种植“农华101”比种植“郑单958”根际土中丛枝菌根真菌丰度和脱氢酶活性更高，但其微生物多样性和均匀度却较低。水分与品种的交互作用显著影响灌浆期根际土中放线菌和丛枝菌根真菌丰度、成熟期的丛枝菌根真菌丰度和3个生育期的微生物群落结构。水分与品种引起的土壤微生物丰度、多样性变化与酶活性的变化之间存在显著相关性。

参考文献