土传病害严重影响作物生长发育和产质量形成，长期以来给农业生产带来了巨大的经济损失^[1-3]。 现已明确，土传病害的发生与土壤环境密切相关， 其中土壤理化特性和微生物群落在与土传病原菌相互作用中扮演重要角色^[4-6]。近年来土壤微生物对植物健康影响的相关研究备受关注，大量研究表明，土壤微生物特别是根际微生物组成、结构、多样性和生态网络关系与植物土传病害的发生具有密切联系^[7-9]。前人在对烟草青枯病和土壤微生物群落结构研究得出，烟株的健康与土壤微生物多样性有关，更为复杂的土壤生态网络可能有利于抑制病原菌的侵染^[10]。同时有研究发现，感染青枯病菌土壤和健康土壤微生物的组成和多样性存在显著差异，健康土壤拥有更高的土壤微生物多样性^[11]。 尽管如此，以往研究更多集中在健康和感病土壤之间的比较^[12-13]，而对植株不同发病程度条件下土壤环境因子变化趋势较少涉及，但其对进一步解释土壤环境的动态变化-病原菌侵染-植株感病三者的相关响应关系具有重要意义。

烟草黑胫病（Phytophora parasitica var．nicotiana）是烟草上普遍发生的土传性真菌病害^[14]。近年来，由于我国耕地面积逐渐减少，烟田连作种植模式不断扩展，加上各植烟区外来优势烤烟品种的频繁引进，烟草黑胫病有愈演愈烈之势，在某些病害严重的地块，烟草黑胫病的发生率高达75%以上，甚至造成绝收，严重影响了烟草产量和品质的提高，给我国烟草产业带来重大威胁^[15]。基于此，本研究选择云南烟区烟草黑胫病发病典型地区，筛选不同发病程度烟株，系统比较不同发病程度烟株根际土壤细菌群落与土壤酶活性的差异，分析其与发病程度的相关性，以期进一步丰富烟株感病机理，并为今后防治黑胫病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验概况

1.1.1 取样烟田背景

选定烟草黑胫病危害较为严重的3个区域进行定点监测（烟田种植情况如表1 所示），即云南省石林县板桥镇（北纬24°41′28″、东经103°15′28″，海拔1670 m），云南省昌宁县珠街镇（北纬25°8′7″、东经99°53′42″，海拔1950 m）和云南省昌宁县耇街镇（北纬25°0′35″、东经99°50′14″，海拔1690 m）。各区域定点一块烟田进行跟踪监测，供试土壤均为红壤，品种为红花大金元，供试田块施肥措施及田间管理一致。

1.1.2 取样处理设定

参照烟草病虫害分级及调查方法^[16]对烟株进行黑胫病等级划分并基于病情指数调查结果将烟株划分为不同发病程度烟株（图1），即正常烟株： 全株无病；轻度发病烟株：茎部病斑不超过茎围的1/2，或半数以下叶片出现轻度凋萎及下部少数叶片出现病斑；中度发病烟株：茎部病斑超过茎围的1/2，或半数以上叶片出现轻度凋萎及少数叶片出现病斑；重度发病烟株：茎部病斑环绕茎围，或2/3 以上叶片出现凋萎。

1.1.3 取样方法

于移栽后40 ～ 45 d（进入旺长期）进行烟株发病情况调查和取样，取各发病情况烟株2 ～ 3 株，用抖根法采集根系土壤，混匀后将土壤分成2 部分，放入自封袋保存。取保山耇街根际土壤放入液氮罐保存待测土壤微生物，采用五点取样法，取田间未植烟土壤做基础土样。

1.2 土壤酶活性测定

依据梅守荣^[17]的方法测定土壤酶活性。过氧化氢酶活性采用KMnO₄ 滴定法测定，脲酶活性利用靛酚蓝比色法进行测量；蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法进行测定；酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法进行测量。

1.3 土壤细菌群落结构测定

1.3.1 基因组DNA的提取和PCR扩增

利用CTAB法提取各处理样本的基因组DNA， 然后利用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的纯度和浓度。取适量样品放在离心管中，用无菌水稀释样品至浓度为1 ng/μL。以稀释处理后的基因组DNA为模板，依据细菌和真菌测序区域的选择，利用带Barcode的特异引物（New England Biolabs公司的Phusion^® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）和高效高保真酶进行PCR扩增。

1.3.2 引物对应区域

515F和806R（16S V4 区引物）用于鉴定细菌多样性。

1.3.3 PCR产物的混样和纯化

应用2%浓度的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，依据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物， 对得出的目的条带进行拍照记录，一次电泳条带不清晰的目的条带进行二次电泳直至条带清晰可用为准，之后使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒对目的条带产物进行回收。

1.3.4 文库构建和上机测序

使用建库试剂盒（TruSeq^® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit）进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量检测确定文库是否合格。

1.3.5 土壤细菌基因组DNA信息分析

（1）测序数据处理

首先从Illumina HiSeq测序平台得到的下机数据中分离出样品数据，使用FLASH^[18]拼接截去Barcode和引物序列后的样品reads，得到Raw Tags，Raw Tags经过过滤处理^[19] 后得到Clean Tags。然后按照Tags质量控制流程^[20] 通过数据库Gold database与UCHIME Algorithm^[21] 比对后将Clean Tags进行检测和去除嵌合体序列^[22]的处理，最终得到可用于后续分析的有效数据Effective Tags。

（2）OTU聚类和物种注释

利用Uparse软件^[23]对各处理样品Effective Tags进行聚类。默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，同时选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs代表序列进行物种注释， 用Mothur方法与SILVA^[24] 的SSUrRNA数据库^[25] 进行物种注释分析（设定阈值为0.8 ～ 1）。获得分类学信息并分别在各个分类水平： 界（kingdom）， 门（phylum）， 纲（class）， 目（order）， 科（family）， 属（genus），种（species）统计各样本的群落组成。最后对样品的数据均一化处理，以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理。

（3）样品多样性分析（Alpha Diversity）

使用Qiime软件（Version 1.7.0）计算各处理样本的Observed-species，Chao1（the Chao1 estimator）， ACE（the ACE estimator），Shannon（the Shannon index），Simpson（the Simpson index），Goods-coverage（the Good’s coverage）指数，Alpha多样性指数的具体应用为：Chao和ACE指数用于分析菌群丰富度（Community richness），Shannon和Simpson指数用于分析菌群多样性（Community diversity）， Coverage用于分析测序深度。

1.4 数据处理

试验数据利用Microsoft Office 2016 初步处理和作图，并采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同发病程度烟株土壤酶活性变化特征分析

由图2 可以看出，各试验点土壤过氧化氢酶活性随发病程度呈下降趋势，但不同发病程度间无显著差异。各试验点不同发病程度间烟株根际土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性变化存在一定差异， 但总体趋势均表现为随发病程度增加，酶活性逐渐降低。不同试验点中，珠街点较其他两点不同发病程度烟株土壤酶活性变化较大，其根际土壤脲酶、 酸性磷酸酶、蔗糖酶活性均显著低于正常植烟土壤。

2.2 不同发病程度烟株土壤微生物变化特征分析

2.2.1 不同发病程度黑胫病土壤细菌群落在门水平上的差异

植烟根际土壤细菌菌落优势门类相似（图3）， 相对丰度较大的4 个门类均为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes），但是以上各门类随发病程度呈现规律存在一定差异。随发病程度加重，变形菌门和拟杆菌门随着发病程度的加重呈先下降再上升趋势；放线菌门随发病程度呈下降趋势，而酸杆菌门则呈现上升趋势。以上分析表明，随发病程度加重，土壤中细菌门类出现一定的趋向性变化。

注：不同小写字母表示相同指标不同发病程度之间在0.05 水平上有显著差异，下同。

注：GJ、G0、G1、G2、G3 分别为基础、正常、轻度发病、中度发病、重度发病土样。下同。

2.2.2 不同发病程度黑胫病土壤细菌群落 α 多样性指数变化特征比较

不同发病程度烟株根际土壤细菌群落 α 多样性指数均不同程度低于健康根际土壤（图4），且随发病程度加重呈现一致的先下降后上升趋势。不图4 不同黑胫病发病程度土壤细菌群落 α 多样性指数变化特征比较同发病程度间均以轻度发病烟株根际土壤细菌 α 多样性指数最低，其中shannon和simpson轻度发病烟株显著低于健康烟株。以上分析说明，随发病程度加重，土壤中细菌群落 α 多样性指数降低， 其中以轻度发病时最低。

2.2.3 不同发病程度黑胫病土壤属水平相对丰富度比较

从31 个相对丰富度大于0.002 的属中选择差异显著的16 个属进行比较（表2）。正常烟株土壤鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）显著低于未植烟土壤。随着发病程度加重，鞘氨醇单胞菌属、芽单胞菌属、Rhizomicrobium属呈先上升后下降的趋势，且在烟株轻度发病的条件下占比最大，随后呈下降趋势。甾体杆菌属（Steroidobacter）、Gaiella属、阿达尔杆菌属（Adhaeribacter）、杜氏杆菌属（Tumebacillus）随发病程度的增加，呈先下降后上升的趋势，且在轻度发病条件下最低，unidentified_Acidobacteria属随发病程度的增加持续增加，重度发病程度下显著大于正常、轻度发病植株。Adhaeribacter属、Variibacter属呈现持续下降趋势。以上结果表明，植烟及黑胫病发病程度的加重均会导致土壤微生物群落结构的改变，烟株轻度发病时，对土壤细菌群落影响最大。

2.2.4 基于weighted Unifrac距离PCoA分析

Unifrac分析得到的距离矩阵通过PCoA分析， 可以直观显示不同样品中微生物的相似性及差异性。从图5 可以看出，第一和第二主成分分别可以解释28.25%和22.42%的原有变量。不同发病程度烟株土壤细菌群落出现了明显分离，其中沿第一主成分坐标分析，轻度发病、中度发病烟株与正常烟株、重度发病烟株土壤群落结构分离； 沿第二主成分坐标分析，随发病程度加重，土壤细菌群落结构逐步分离，且分离程度随发病程度加重而增大。以上分析表明，不同发病烟株土壤细菌群落结构存在差异，且这种变化与发病程度相关。

注：不同小写字母表示差异达5%显著性水平

3 讨论

土传病害的发生与土壤主要环境因子及其相关性具有密切联系^[26]，其中土壤酶活性和微生物群落在植物与土传病原菌相互作用中扮演重要角色^[27-28]。本研究在对田间自然发病烟株根际土壤酶活性和微生物群落分析发现，不同发病程度根际土壤酶活性和微生物群落特征存在明显差异，且随发病程度呈一定的趋向性改变。这些结果对于进一步明确土壤主要环境因子与土传病害发生的相关性，丰富土传病害致病机理具有一定的理论意义。

土壤酶反应土壤生化反应的强度和方向，在土壤物质和能量转化过程中扮演重要角色，是土壤生态系统的重要组分^[29-30]。蔗糖酶是表征土壤肥力的重要指标，与土壤碳代谢密切相关；脲酶与土壤中氮素的循环和转化有关，是表征土壤氮素水平的重要指标；磷酸酶的作用是促进磷素的循环和转化，表征土壤磷素的水平^[31]。本研究中，各调查点不同发病程度烟株根际土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶活性随发病程度增加均呈下降趋势。其他一些研究者在不同的研究中也得出相似的结论，如寻路路等^[32]、何川等^[33]、姜飞等^[34]、游春梅等^[35]及廖梓良等^[36]的报道。说明脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶这4 种酶与植物土传病害的响应规律具有普遍性，在不同植物上都是相同的。李成江等^[37]指出，根区微生物对糖类、氨基酸类、羧酸类、多聚物类、胺类和酚酸类的利用愈高，土传病害发生越轻，与此相对应，土传病害发病程度越高，也可能造成烤烟利用根区附近营养物质能力降低，阻碍土壤营养元素的流动与循环^[38-39]。

土壤微生物在维持土壤健康上具有重要作用， 土壤微生物群落结构越丰富，物种越均匀，表明土壤微生态系统较为稳定和平衡，利于作物的生长和抵御病害^[40-41]，而土壤中病原微生物的富集不利于土壤微生物种群的平衡^[13]。本研究中，不同发病程度根际土壤细菌门类水平优势群落组成相似， 但随发病程度放线菌门相对丰度呈下降趋势，而酸杆菌门（Acidobacteria）呈上升趋势。这可能是因为植物根际土壤中的放线菌具有抵御病原菌侵染的功能，且其中部分根际放线菌还具有促进植物生长的能力^[42]，烟株受黑胫病侵染后，放线菌减少， 根际土壤抗菌能力下降，进而导致病原菌大量滋生，病害加重。而酸杆菌门具有降解植物残体多聚物的功能^[43]，受黑胫病侵染的植株随发病状态的加重土壤根系受损，致使土壤中残体增多，最终导致酸杆菌门的增加。

细菌群落丰富度用Chao1 指数和ACE指数表示，其值越高表明群落物种的丰富度越高^[44]； shannon指数反映样品的多样性程度，其值越高表明群落物种的多样性越高；simpson指数反映了物种的优势度^[45]。试验结果表明，不同发病程度之间土壤微生物丰富度并不存在显著变化，但黑胫病初步发病植株的土壤微生物多样性与优势度最低，均显著低于未发病烟株，随着发病程度的加重，shannon指数与simpson指数却逐渐增加，这说明黑胫病初步发病时，细菌群落均匀性最差，此时黑胫病菌在根际环境中大量繁殖，抑制了其他微生物生长和代谢，生物群落结构趋于单一，益菌种类减少或代谢降低，微生物区系从“正常生理组合” 向“病理组合”转化，最终导致感病品种迅速感病^[3，46-47]。但随着发病程度的加重，细菌的均匀性却逐渐恢复，其原因有待进一步深入研究。根据基于weighted Unifrac距离PCoA分析结果，我们发现未植烟土壤与正常植烟土壤之间相对较为接近，随着发病程度的加深，土壤情况逐步分离，这可能是由于与黑胫病病原菌对土壤微生物的影响较小，而随着黑胫病发病程度的加重，黑胫病病原菌在土壤中不断富集，致使土壤微生物群落结构改变。

4 结论

健康烟株土壤脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶与蔗糖酶活性均高于未植烟土壤与黑胫病发病烟株土壤酶活性，同时随着黑胫病发病程度的加重会导致植烟根际土壤中蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶活性降低。不同发病程度黑胫病发病植烟土壤菌落组成较为相似。正常植烟土壤细菌的shannon指数、chao1 指数、simpson指数与ACE指数均高于未植烟土壤，随着黑胫病发病程度的加重， shannon、chao1、simpson、ACE指数均呈现先下降再上升趋势，并且均表现为黑胫病初步发病时细菌的 α 多样性最低。综上所述，植烟及黑胫病发病程度的加重均会导致植烟根际土壤细菌群落结构的改变，烟株轻度发病时，对植烟根际土壤细菌群落影响最大。

参考文献