氮素是作物生长的重要营养元素之一,在生命体乃至整个生态系统都起着重要作用^[1-2]｡土壤中氮素总量反映着土壤氮循环的状况,是衡量土壤基础肥力､评价土壤资源的一项重要指标^[3]｡土壤中氮素分为有机氮和无机氮,其中绝大部分为有机结合形态的氮,无机形态的氮一般仅占全氮的1%~5%^[4]｡土壤中全氮量的检测是土壤分析的常规项目,掌握合理方法准确测定出土壤中全氮的含量,对合理施用氮肥具有重要意义｡

土壤中全氮的分析方法主要有凯氏定氮法､红外光谱技术和杜马斯燃烧法^[5]｡其中,凯氏定氮法是测定土壤中全氮的标准方法^[6-8],原理是试样土壤在加催化剂的条件下用浓硫酸高温消煮,将土壤中的有机氮转化为NH₄ ⁺ 与硫酸结合为硫酸铵,通过氢氧化钠强碱蒸馏出NH₃,最后用标准酸溶液滴定NH₃ 量来确定全氮含量｡但其测得的氮并不包括NO₂ ^--N和NO₃ ^--N,因一般土壤中NO₂ ^--N和NO₃ ^--N含量不超过全氮量的1%,故忽略不计｡如遇含有显著数量NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的土壤,需要将样品中的NO₂ ^--N氧化为NO₃ ^--N,再用还原剂将NO₃ ^--N还原为NH₄ ⁺-N^[9]｡使用凯氏定氮法时,由于消煮时间过长,操作过程繁琐危险,且需要大量化学试剂(如浓硫酸､氢氧化钠溶液和硼酸溶液等),不仅加大了检测成本,且严重污染环境,对实验员健康存在潜在危害^[10-11]｡相比之下,杜马斯燃烧法具有环保､高效的优势,已被欧美､日本等发达国家在多个行业采用^[12-13],其测定原理是试样在纯氧(≥ 99.99%)环境中高温燃烧,燃烧过程中产生混合气体,其中的碳､硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收,氮氧化物被全部还原成氮气, 形成的氮气气流通过热导检测器(TCD)进行检测得出试样中的全氮含量^[14]｡与凯氏定氮法相比, 杜马斯燃烧法测得的氮转化效率更高,全氮更完全^[5]｡

目前,国内外学者利用杜马斯燃烧法测定土壤中全氮含量的文献已有不少^[15-19]｡王忻昱等^[15]采用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法分别对农田､茶园､ 林地和草地土壤样品的全氮含量进行测定,结果发现两种方法的检测结果无明显差异,且相对标准偏差均小于5%｡张薇等^[16]采用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法对10 种土壤有效态成分分析标准物质的全氮含量进行检测,结果表明对于硝态氮和亚硝态氮含量较低的样品,两种方法均可采用;杜马斯燃烧法更适用于大批量样品的检测;低氮含量的样品采用凯氏定氮法测定结果更加准确｡Dhaliwal等^[19] 采用改进的凯氏定氮法(水杨酸-硫代硫酸铵-硫酸来消煮土壤样品)测定土壤的全氮含量(包含NO₂ ^--N和NO₃ ^--N),但测定结果仍低于杜马斯燃烧法的测定结果｡国内现行的测定土壤全氮含量的标准方法多采用的是凯氏定氮法^[6-7,20],仅在LY/T 1228-2015 森林土壤氮的测定中采用了元素分析仪法(杜马斯燃烧法)｡可见,杜马斯燃烧法还没有完全取代凯氏定氮法成为测定土壤全氮含量的标准方法,其测定结果与凯氏定氮法存在哪些差异, 是急需探索的｡

本试验将采用传统的凯氏定氮法和杜马斯燃烧法对不同梯度全氮含量的土壤样品(全氮含量梯度为0%~0.06%､0.06%~0.1%､0.1%~0.2%､ 0.2%~0.3%､0.3%~0.4%和0.4%~0.5%) 进行检测,比较两种方法在测定结果的精密度､准确度及相关性和检测成本方面的差异性,探讨杜马斯燃烧法用于土壤全氮检测的可行性,以期为准确快速测定土壤全氮含量提供方法参考和理论依据｡

1 材料与方法

1.1 样品采集与制备

供试土壤样品为6 组不同梯度全氮含量的土壤样品(全氮含量梯度为0%~0.06%､0.06%~0.1%､ 0.1%~0.2%､0.2%~0.3%､0.3%~0.4%和0.4%~0.5%),每个梯度10 个样品,由农业农村部食品质量监督检验测试中心(成都)提供; 供试土壤有效态成分分析标准物质由国家标准物质研究中心研制,共4 份,分别为华北平原土壤(GBW07427)､四川盆地土壤(GBW07428)､新疆灰钙土(GBW07459)和陕西黄绵土(GBW07460)｡

所有的供试样品需经风干,挑去石块､块茎等杂物,过2 mm筛后进一步研磨,使其全部通过0.149 mm筛后装入广口瓶备用｡供试土壤标准物质均置于65℃干燥箱内干燥24 h,待测｡

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

rapid MAX N EXCEED型元素分析仪( 德国Elementar公司);FOSS2400 全自动凯氏定氮仪､消化炉(瑞典FOSS公司);AUY 220 电子天平(日本岛津公司,精度为0.1 mg)｡

1.2.2 试剂与气体

浓硫酸;催化剂(K₂SO₄ ∶CuSO₄·5H₂O=10∶1); 10 g·L^-1 硼酸溶液;400 g·L^-1 氢氧化钠溶液;0.05 mol· L^-1 盐酸标准滴定溶液(按照GB/T 601-2016 《化学试剂标准滴定溶液的制备》规定配制并标定);0.1%甲基红乙醇溶液;0.1%溴甲酚绿乙醇溶液;氧化铜和Pt催化剂;ESA-REGAINER;氧化铝;五氧化二磷;氧气(纯度≥ 99.99%);氦气(纯度≥ 99.99%);标准品:硫酸铵(N:21.21%,纯度≥ 99.99%,天津市光复精细化工研究所生产); 天冬氨酸[N:10.52%,纯度≥ 98%,SIGMA公司生产]｡

1.3 测定方法

1.3.1 凯氏定氮法

称取待测样品约1 g(准确至0.0001 g)于消化管中,加入5 g催化剂(K₂SO₄∶CuSO₄·5H₂O=10∶1)和浓硫酸10 mL,摇匀,在消化炉上420℃ 消化约1 h,待消煮液呈亮绿色并澄清透明后,取下放冷,缓慢加入约20 mL水｡待液体冷却后,置于FOSS2400 全自动凯氏定氮仪上进行加碱蒸馏3.5 min,将试样中的氨通过冷凝由硼酸溶液直接吸收, 并用盐酸标准溶液滴定硼酸吸收液,记录盐酸滴定体积,计算样品中全氮含量｡每个样品做3 次重复测定,同时做5 份空白测定｡称取硫酸铵标准品20.0､30.0､40.0､50.0 和60.0 mg,进行蒸馏滴定, 得标准曲线｡

1.3.2 杜马斯燃烧法

采用rapid MAX N EXCEED型元素分析仪进行测定｡称取待测样品约1 g(准确至0.0001 g) 于坩埚中,置于自动进样盘内,在燃烧炉温度达900℃以上､次级燃烧管温度达900℃以上､还原管温度达600℃以上､氧气(纯度≥ 99.99%)压力达0.25 MPa､氦气(纯度≥ 99.99%)压力达0.38 MPa,仪器自动进样检测,加氧时间为120 s,加氧流速为300 mL·min^-1｡每个样品做3 次重复测定,同时做5 份空白测定｡称取天冬氨酸标准物质50.0､100.0､150.0､200.0 和250.0 mg,上机检测, 得标准曲线｡

1.4 统计分析

采用DPS 7.05 统计软件对数据进行方差分析和多重比较,采用Excel 2007 软件进行线性回归分析,P<0.05认为统计学检验有显著性差异｡

2 结果与分析

2.1 杜马斯燃烧法与凯氏定氮法的精密度及质量控制比较

凯氏定氮法测定土壤全氮含量时,称取不同质量硫酸铵标准品,以称样量为横坐标､总氮含量为纵坐标建立标准曲线｡总氮含量范围为4.11~12.5 mg,标准曲线(图1)为y=0.2104x0.072,R²=0.9998｡采用杜马斯燃烧法时,称取天冬氨酸标准物质,以总氮含量为横坐标,峰面积为纵坐标建立标准曲线｡总氮含量范围为5~25 mg, 标准曲线(图2)为y=2638.9x+299.3,R²=1｡由此可见,两种方法测定标准品时,方法稳定,且回收率较高｡

分别用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定了4 份土壤有效态成分分析标准物质的全氮含量,每个样品重复测定6 次,结果见表1｡可看出,两种方法测定结果都接近于真实值｡比较两种方法的相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)值,可确定杜马斯燃烧法精密度更高,且准确度更好｡

2.2 杜马斯燃烧法与凯氏定氮法测定土壤全氮含量结果分析

分别用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定6 组不同梯度全氮含量的土壤样品(全氮含量分别为0%~0.06%､0.06%~0.1%､0.1%~0.2%､ 0.2%~0.3%､0.3%~0.4%和0.4%~0.5%), 每个梯度10 个样品,结果见表2｡6 组不同梯度全氮含量的土壤样品,两种方法的测定值之比(D/K)的范围分别为0.692~0.965､0.940~1.104､ 0.993~1.079､0.995~1.058､1.008~1.057 和1.000~1.092｡对于含氮量范围为0%~0.06%的样品,两种方法的测定值间差异较大,凯氏定氮法的测定结果均高于杜马斯燃烧法;含氮量范围为0.06%~0.3%的样品,两种方法的测定结果表现出一致性;含氮量0.3%~0.5%的样品,两种方法间差异较大,杜马斯燃烧法的测定结果均高于凯氏定氮法｡对两组数据进行单因素方差分析,可以看出含氮量范围为0%~0.06%､0.3%~0.4%和0.4%~0.5%的30 个样品中,有21 个样品两种方法的测定结果间存在显著性差异｡可见,不同含氮量的土壤样品应选择合适的方法才能保证其测定的准确度｡对于低氮含量(0%~0.06%)的土壤样品,凯氏定氮法测定结果准确度更高,主要是因

表1 凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定4 份土壤有效态成分分析标准物质的全氮含量(n=6)(%)

续表

注:土壤全氮含量测定值为平均值 ± 标准差(n=3),数据后不同字母表示同一行数据在0.05 水平上差异显著;D/K指杜马斯燃烧法和凯氏定氮法测定值的比值｡

为含氮量极低的土壤中,其NO₂ ^--N和NO₃ ^--N含量一般也较低,半微量的凯氏法更加适用,与张薇等^[16]的研究结果一致;其次,杜马斯燃烧法测得的含氮量是通过换算样品在燃烧后形成的氮气气流量的峰面积得出,当样品含氮量极低时,通过计算峰面积的积分值来换算含氮量,准确度会降低｡而对于含氮量(0.3%~0.4%和0.4%~0.5%) 较高的土壤样品,杜马斯燃烧法的测定结果更加准确,主要是因为其测得的全氮包括了NO₂ ^--N和  NO₃ ^--N,全氮更完全,因而测定结果高于凯氏定氮法｡

由图3 可看出,当含氮量范围为0%~0.06%时,杜马斯燃烧法测定结果的变异系数为0.00%~9.96%;当含氮量大于0.06%时,其变异系数均小于5%,且大多数样品测定值的变异系数比凯氏定氮法测定的低｡而用凯氏定氮法对6 组不同梯度含氮量的土壤样品进行检测,其变异系数均小于5%｡ 相比较而言,当土壤样品含氮量大于0.06%时,选用杜马斯燃烧法进行全氮含量检测更为合适｡

2.3 两种方法的相关性分析

在对杜马斯燃烧法与凯氏定氮法测定土壤样品的全氮含量进行比较之后,对两种方法测定结果的相关性进行分析｡如图4､5 所示,含氮量范围为0%~0.06%的样品,两种方法的测定值之比(D/K) 为0.692~0.965,且杜马斯燃烧法测定结果的变异系数为0.00%~9.96%,测定结果不稳定,两种方法的测定值间存在显著的线性相关,但R² 仅为0.9049｡ 含氮量大于0.06%的土壤样品,两种方法的测定结果间存在显著的线性相关(R²=0.9979)｡

图5 杜马斯燃烧法和凯氏定氮法测定土壤全氮含量的相关关系(含氮量为0.06%~0.5%)

2.4 两种方法的检测成本对比

检测成本是除精密度和准确度之外,评价一项检测方法可行性的重要指标｡因此,本文对两种方法的检测成本做了对比,分别对本试验中所有样品和标准品所需的试剂､时间､人力成本和仪器成本,以及排废情况等进行比较(表3)｡两种方法的土壤样品测定次数为60×3=180,标准品测定次数为4×6=24;凯氏定氮法的硫酸铵测定次数为5,杜马斯燃烧法的天冬氨酸测定次数为5;空白测定次数为5｡

杜马斯燃烧法检测前仅需根据需要填充ESA REGAINER和更换干燥剂后,称样就可上机检测, 且试剂耗材不用配制;而凯氏定氮法检测前需要配制大量化学试剂,需要消煮样品,且消煮过程繁琐费时,蒸馏滴定时使用的酸碱对试验人员和环境都有较大危害｡由表3 可看出,完成本试验中所有样品的检测,杜马斯燃烧法仅需22.3 h,且1 名实验员就可完成;而凯氏定氮法需45.7 h,需2 名实验员,时间､人力和耗电量都约是杜马斯燃烧法的两倍｡虽然杜马斯燃烧法仪器成本和试剂成本高于凯氏定氮法,但基于降低时间､人工成本和环保的角度来说,杜马斯燃烧法更具有优越性｡

3 结论

杜马斯燃烧法和凯氏定氮法测定土壤有效态成分分析标准物质的全氮含量,两种方法测定结果都接近于真实值｡比较两种方法的RSD和RE值,可确定杜马斯燃烧法精密度更高,且准确度更好;对于含氮量范围为0%~0.06%的样品,两种方法的测定值之比(D/K)为0.692~0.965,且杜马斯燃烧法测定结果的变异系数为0.00%~9.96%,测定结果不稳定,两种方法的测定值间存在显著的线性相关,但R² 仅为0.9049;而含氮量大于0.06%的样品,两种方法的测定结果表现出一致性,其测定值之比(D/K)为0.940~1.104,变异系数均小于5%,测定结果间存在显著的线性相关(R²=  0.9979)｡在检测成本方面,完成本试验中所有样品的检测,杜马斯燃烧法所需时间和人力都约是凯氏定氮法的1/2,上机检测前,免去了消煮､配制试剂等诸多繁琐程序｡在环境保护方面,杜马斯燃烧法不使用强酸强碱,不污染环境,不危害人体健康,是一种环保､高效检测方法｡综上所述,对于含氮量范围为0%~0.06%的土壤样品, 凯氏定氮法的测定结果更接近于真实值,而对于含氮量大于0.06%的土壤样品,杜马斯燃烧法更加适用｡

参考文献