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均腐土（Isohumisols）是中国土壤系统分类（CST）体系中提出并使用的土纲级分类单元，指具暗沃表层、均腐殖质特性和土体盐基饱和度≥ 50%的一类土壤，其中均腐殖质特性（Isohumic property，Ihp）是最早由法国发生土壤学及土壤制图委员会提出并用于土纲级的划分，CST引入并在高级分类研究阶段采用了这个指标，并限定Ihp土表至20 cm与土表至100 cm土层腐殖质储量比值≤ 0.4。 Isohumosols检索应首先具有暗沃表层，因此可以理解Isohumosols与美国的Mollisols有大致相似的特点，但因诊断特性Ihp的引入，使Mollisols中大部分不具备Ihp的Albolls很难实现均腐土土纲级的检索，致使均腐土与Mollisols以及世界土壤资源参比基础的Phaeozems、俄罗斯的Chernozems、中国土壤发生分类（GSGC）的Black soil有很大的不同， 同时，均腐土又是我国重要的土壤类型[1]，在东北平原多有分布。CST将均腐土分为干润均腐土、 湿润均腐土和岩性均腐土3 个亚纲[2-3]，其中岩性均腐土分布在中国南海诸岛[1]，而东北平原因其独特的气候环境和地理位置主要发育干润均腐土和湿润均腐土两个亚纲，并成为均腐土的主要类型。在均腐殖质特性的环境中生存的细菌形成了特有的结构和机能，而均腐土不同亚纲典型土系的土壤组分可能成为驱动土壤细菌差异的重要因素。近年来，我国学者对于CST体系下均腐土的研究较少且集中于理化指标、土壤质量评价等方面[4-5]，对于均腐土生物学性质的变化情况还未涉及。
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土壤微生物是生态系统的重要组成部分，在土壤有机质的分解、腐殖质的形成及土壤养分的转化和循环等生物化学过程中发挥着重要作用[6-9]。 土壤微生物对土壤条件变化非常敏感，能在较短时间内发生大幅度变化，因而土壤微生物量的变化通常作为土壤质量演变的重要依据[10-12]。土壤微生物是否存在与植物和动物等大型生物相似或不同的地理分布格局，以及哪些因素驱动着这种格局的存在是当前学者们研究的交叉热点课题之一。GSGC体系下土壤微生物群落结构地理分布规律与化学性质关系及其驱动因素已有研究而结果不尽相同[13-16]，同时，以往的研究均以固定的土壤深度为对比单元，忽略了成土过程和成土条件对土壤性质的影响，很难与土壤本质属性结合分析。土壤细菌占土壤微生物总量的70%～ 90%， 是土壤最活跃的因素[17]。尽管已有土壤细菌群落结构与化学性质关系及驱动因素的研究，但对于Isohumisols典型土系的研究却尚未报道，特别是对发生层内部土壤微生物群落结构与理化性质间的关联性了解极为有限。本研究采用高通量测序技术，研究CST体系下的均腐土不同亚纲典型土系腐殖质层（Ah层）化学性质及土壤细菌群落结构的变化，分析细菌群落结构与环境因子的关系，进一步阐明均腐土中驱动Ah层细菌群落结构的主要环境因子，为均腐土的科学保护利用提供理论基础和依据。
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1 材料与方法
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1.1 样品采集
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于2018 年10 月确定8 个土系的样点位置[主要分布在46.619 57°N～ 48.967 35ºN及124.608 10ºE～ 131.860 50ºE（表1）]，并采集土样。土壤样品采集时按1 m宽、2 m长、2 m深挖掘土壤剖面，确定土系及发生层后，按发生层厚度采集土壤，本研究只针对8 个典型土系的Ah层土样进行分析，每个样点3 次重复（n=24），样点具体概况见表1 所示。将采集的土样去除植物根系和杂草，混匀，分装两份，一份风干研磨后过2 mm筛，用于土壤化学性质测定， 一份直接过2 mm筛， 放-80℃冰箱保存，用于土壤细菌群落多样性的测定。
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1.2 土壤化学性质的测定
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土壤化学性质的测定采用常规方法[18]：有机碳（SOC）采用重铬酸钾容量法测定；全氮（TN） 采用凯式定氮法测定；全磷（TP）采用HF—硝酸混合消煮，钼锑抗比色法测定；全钾（TK）采用HF—硝酸混合消煮，AAS法测定；pH采用电位法测定（水土比2.5∶1）；阳离子交换量（CEC） 采用乙酸铵—EDTA交换法测定；交换性钾（EXK）、交换性钠（EX-Na）、交换性钙（EX-Ga）、交换性镁（EX-Mg）采用乙酸铵交换-AAS法测定。
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1.3 DNA提取、PCR扩增和Illumina HiSeq测序
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使用mobio土壤微生物DNA强力提取试剂盒（PowerSoil® DNA Isolation Kit） 提取土壤微生物DNA，用NanoDrop 2000 分光光度计检测DNA浓度。
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根据文献[19] 的方法对细菌16S rRNA基因（V3+V4） 区域的PCR进行扩增。338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’） 为正向引物， 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 为反向引物。目标区域PCR扩增反应条件为95℃ 预变性5 min，15 个循环（95℃，1 min，50℃，1 min，72℃，1 min），72℃，7 min，然后将样品与磁珠按照1∶1.5 混匀后进行磁珠筛选片段，纯化完后进行SolexaPCR，反应条件为98℃，30 s，10 个循环（98℃，10 s，65℃，30 s，72℃，30 s）， 72℃，5 min，然后进行磁珠纯化，将纯化后的产物进行Nanodrop2000 定量后，按照质量比1∶1 进行混样，通过1.8%的琼脂糖凝胶，120V，40 min电泳后，切目的片段，并回收。每个样品做3 次重复，送至北京百迈克生物科技有限公司，利用Illumina Hiseq 2500 平台进行测序。
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1.4 测序数据处理
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对原始数据进行拼接（FLASH[20]，version 1.2.11），将拼接得到的序列进行质量过滤（Trimmomatic[21]，version 0.33），并去除嵌合体（UCHIME[22]， version 8.1），得到高质量的Tags序列。
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在相似性97%的水平上对序列进行聚类（USEARCH[23]，version 10.0），以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[24]。采用RDP Classifier（version 2.2）基于Sliva（细菌，Release 132）分类学数据库对OTU进行分类学注释，置信度阈值为0.8[25]。
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1.5 数据分析
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Alpha多样性分析， 包括群落丰富度指数（Chao1 和ACE）、群落多样性指数（香农Shannon和辛普森Simpson），使用Mothur（version 1.30）软件，对样品Alpha多样性指数进行评估[26]。
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数据采用Excel 2016 和SPSS 21.0、SigmaPlot 12.5 进行整理和分析，数据分析使用单因素方差分析，多重比较运用Duncan检验（P <0.05，n=24）。 具体制图运用北京百迈克生物科技有限公司的BMKCloud云平台分析。
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2 结果与分析
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2.1 均腐土典型土系化学性质分析
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均腐土不同亚纲8 个典型土系pH值为5.85 ～ 8.25，由低到高依次为裴德系、卫星农场系、大西江系、富牧西系、新发北系、保国系、明水系、春雷南系，其中干润均腐土高于湿润均腐土。土壤SOC总体差异较大，大西江系的SOC含量最高，达46.24 g/kg，而富牧西系含量最低，仅12.11 g/kg。8 种土系中TK、EX-Ga均为干润均腐土高于湿润均腐土。均腐土的土壤化学性质指标普遍较高，其中，大西江系土壤10 种化学性质指标，除TP、 CEC、EX-Na外均显著（P<0.05）高于其他7 种土系（表2）。
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注：不同小写英文字母表示土系间差异显著（P<0.05），下同。
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2.2 均腐土典型土系细菌 α-多样性
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表3 显示，均腐土的覆盖率均为99%以上， 说明该样品测序已趋于饱和，表明Hiseq测序结果中含盖了大多数微生物种群，可以真实反映均腐土微生物的群落结构组成。均腐土24 个样品8 个土系测序共获得1 674 634 条Clean tags，各样品的Clean tags在65 242 ～ 73 156 之间（表3），有效序列在63 749 ～ 72 842 之间。8 个土系中有效序列的数量差异较小。干润均腐土中春雷南系检测出的OTU最少，保国系的OTU较高。春雷南系Clean tags检测出的数量最高，但辛普森指数、Ace指数、Chao1 指数均较小，表明春雷南系细菌丰度和多样性比其他7 种土系低。均腐土各土系的Ace指数、Chao1 指数较为接近，表明均腐土8 个土系的菌群丰度趋于相似。除春雷南系外，香农指数均表现为干润均腐土> 湿润均腐土。辛普森指数表现为富牧西系与裴德系相同， 春雷南系与明水系相同，保国系与大西江系、新发北系、卫星农场系相同，说明其群落多样性相似。总体来看，在本研究中，均腐土8 个土系中，干润均腐土的细菌群落多样性高于湿润均腐土（表4）。
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2.3 均腐土典型土系细菌类群
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图1 为均腐土不同亚纲8 个土系细菌OTU的数量和组成。 在OTU水平上，8 个土系共检出2 204 个OTU，其中，干润均腐土共有OTU为528 个，占总OTU的23.96%，特有OTU分别为富牧西系13、春雷南系11、保国系43、明水系22 个，分别占干润均腐土共有OTU的2.5%、2.1%、8.1%、 4.2%（ 图1a）； 湿润均腐土共有OTU为372 个， 占总OTU的16.88%，特有OTU分别为大西江系40、新发北系47、卫星农场系17、裴德系6 个， 分别占湿润均腐土共有OTU的10.75%、12.63%、 4.5%、1.6%（图1b）；将24 个样品的3 个重复合并后发现，均腐土共有OTU为628 个，占总OTU数量的28.5%。8 个土系仅富牧西系、春雷南系、 明水系、新发北系、卫星农场系检出特有的OTU， 分别为3、1、1、21、1 个， 其中新发北系特有OTU数量最多，为21 个，保国系、大西江系、裴德系未检出特有OTU（图1c）。
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图1 细菌OTU分布水平上的Venn图
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2.4 均腐土典型土系细菌群落组成
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均腐土不同亚纲8 个土系共检测到25 个细菌门， 不同土系间细菌群落的差异较大。在门水平下，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、 酸杆菌门（Acidobacteria）为富牧西系、春雷南系、 保国系、大西江系、新发北系、卫星农场系、裴德系7 种土系中均拥有较高的相对丰度，其总相对丰度超过了50%（图2），这3 种菌群为7 种均腐土系的优势菌群，但在组成比例上有一定的差异。与其他7 种土系相比，明水系细菌群落中绿湾菌门（Chloroflexi） 相对丰度达9.67%，与变形菌门、放线菌门为该土系的主要优势菌群；而酸杆菌门在明水系中的群落相对丰度仅为5.48%，在其他7 类均腐土系中均超过8%， 最高达28.57%。变形菌门在春雷南系中的相对丰度最高，达45.78%。放线菌门在明水系中的相对丰度达24.58%，而在大西江系中只有12.48%。总体来看， 均腐土8 个土系细菌门主要优势菌群仅变形菌门表现为干润均腐土高于湿润均腐土。
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图2 均腐土细菌群落在门水平上的组成和相对丰度
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注：不同字母代表差异显著（P<0.05）。下同。
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对于属水平下细菌的分类组成和丰度分析能更好地为细菌门类提供完整信息，在属水平下（图3），共检测到497 个不同细菌属，其中检出丰度前10 的细菌属中，除未知菌属外主要存在5 种主要优势菌属：鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、 RB41、 节杆菌属（Arthrobacter）、 芽单胞菌属（Gemmatimonas）、 念珠菌属（Candidatus_Udaeobacter）。均腐土8 个土系中，富牧西系鞘氨醇单胞菌属、RB41 的相对丰度均大于5%，但其他细菌属均较低。春雷南系鞘氨醇单胞菌属的相对丰度达到12.25%。保国系鞘氨醇单胞菌属、RB41 的相对丰度分别达到11.13%和6.64%。明水系鞘氨醇单胞菌属达10.44%。大西江系鞘氨醇单胞菌属、节杆菌属分别达到5.77%和7.96%。新发北系各细菌属均较低。卫星农场系鞘氨醇单胞菌属的丰度达7.64%，裴德系达14.27%。对比土系间细菌属水平相对丰度关系发现，上述优势菌群中各土系间均呈现显著差异；总体来看，均腐土8 个土系鞘氨醇单胞菌属、RB41 均表现为干润均腐土高于湿润均腐土。
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图3 均腐土细菌群落在属水平上的组成和相对丰度
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将24 个样品的3 个重复合并后，基于braycurtis距离均腐土不同亚纲8 个土系细菌群落结构变化的样品热图分析如图4 所示。均腐土不同亚纲分别聚为一类，其中干润均腐土聚为一类，湿润均腐土聚为一类。说明不同亚纲细菌群落结构差异显著。
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图4 均腐土细菌样品丰度热图
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2.5 均腐土细菌群落与环境因子的关系
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均腐土的细菌群落不仅受生物性质的影响，对于土壤环境因子的影响也至关重要。利用Mental test分析发现，pH、EX-Ca、EX-Mg、TP、 CEC、SOC与均腐土细菌群落结构组成显著相关（P<0.05），因此，为了进一步了解驱动均腐土细菌群落发生变化的主要影响因素，利用RDA分析发现，土壤pH值为细菌群落结构的主要影响因子， 其中，EX-Ca、pH、CEC为驱动干润均腐土细菌群落结构发生变化的主要影响因素，EX-Mg、SOC、 TP为驱动湿润均腐土细菌群落发生变化的主要影响因素。
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注：黑体加粗字体为显著相关（P<0.05）。
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图5 均腐土样品细菌群落与化学性质的RDA分析
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3 讨论
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道库恰耶夫认为，土壤的成土过程总是由母质、气候、时间、生物等因素相互作用而形成的， 其中生物因素在土壤的成土过程中起着至关重要的作用。而威廉斯却认为，土壤的五大成土因素中， 土壤化学性质为主要影响因素[27]。本研究中，均腐土不同亚纲的化学性质有明显差异，这可能与均腐土不同的母质与成土条件所处的环境有关，具体的研究还需深入进行。不同的土壤类型也会对土壤微生物造成影响。唐杰等[28]对不同若尔盖湿地4 种不同土壤类型细菌多样性的研究表明，微生物数量总体上随着土壤类型的变化而变化。张崇邦等[29]对天台山8 种土壤类型的微生物区系研究也表明，微生物数量、细菌群落的组成和多样性与土壤类型密切相关。Xu等[30]对不同土壤类型大豆根际细菌群落影响研究表明，大豆根际土壤细菌群落的多样性由土壤类型决定。本研究中，均腐土不同亚纲8 个土系的 α-多样性不同，细菌类群多样性均表现为干润均腐土高于湿润均腐土，表明不同的土壤类型能够影响土壤微生物群落。
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本研究对均腐土不同亚纲8 个土系的细菌群落组成在门、属和OTU水平进行了分析，在8 个土系中均存在较为一致的优势菌群。而细菌菌群丰度相对较低的在均腐土中所占的比例和种类均表现出一定的差异。通过对门水平细菌群落组成研究发现，在不同亚纲8 个土系的群落组成中丰度较高的有变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿湾菌门（Chloroflexi），这4 类细菌为大多数均腐土纲中的优势菌群[31-32]。刘红梅等[32]研究发现变形菌门、 放线菌门、酸杆菌门、绿湾菌门大量出现在暗栗钙土（在中国土壤系统分类中也属于均腐土纲）中， 这也与本研究结果类似，说明类似的均腐土生境中细菌群落的分布特征也具有一定的相似性，同时表明此类细菌群落在均腐土土壤生境中至关重要，对保持土壤生态系统的稳定性有重要作用。此外，通过属水平的群落组成研究发现，在不同亚纲8 个土系的群落组成中具有降解土壤有毒物质的鞘氨醇单胞菌属、RB41、节杆菌属，具有土壤污染物降解功能的芽单胞菌属、念珠菌属相对丰度较高，说明均腐土中存在一些对土壤修复有特殊功能的菌属，但这尚需进一步的研究。另外，对不同亚纲样品热图分析发现，干润均腐土和湿润均腐土在聚类图谱中被分别单独聚为一类，表明即使是同一土纲下的土壤类型，不同亚纲细菌群落的组成也发生了明显分异。
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近年来，关于土壤化学性质在细菌群落结构形成中的驱动作用得到了充分论证[33-34]。如张小青[35]对荒漠土壤细菌群落研究表明，pH、TN和TC是影响细菌群落结构的主导因子，侯建伟等[36] 对贵州黄壤的细菌群落研究表明，土壤全氮、C/N、pH、有效磷和CEC对细菌群落结构变化贡献较大，且TN与pH为主导环境因子，Shen等[37] 和Zhang等[38]对不同海拔梯度土壤细菌群落研究表明，土壤pH为决定土壤细菌群落结构的主要影响因素。本研究发现，pH、EX-Ca、EX-Mg、TP、 CEC、SOC是均腐土细菌群落结构发生变化的主要影响因子，且pH值为影响均腐土细菌群落结构的主导因子，这与前人的研究结果相同[38]。其中，pH、EX-Ca、CEC为驱动干润均腐土细菌群落结构发生变化的主要影响因素，EX-Mg、SOC、 TP为驱动湿润均腐土细菌群落发生变化的主要影响因素，说明不同土壤类型土壤化学性质的变化是引起土壤细菌群落结构组成发生分异的主要驱动因素。
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4 结论
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本研究的结果表明，干润均腐土细菌多样性均高于湿润均腐土；同时，通过对均腐土不同亚纲8 个土系细菌群落组成的分析发现，在门水平上变形菌门（Proteobacteria）、 放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）为富牧西系、春雷南系、保国系、大西江系、新发北系、卫星农场系、裴德系7 种均腐土系的优势菌群。明水系以绿湾菌门、变形菌门、放线菌门为主要优势菌群。属水平上，均腐土各土系的群落差异较大。均腐土不同亚纲8 个土系土壤细菌群落主要分为两类，干润均腐土为一类，湿润均腐土为一类；对细菌群落与环境因子相关分析发现， pH、EX-Ca、EX-Mg、TP、CEC、SOC是均腐土细菌群落结构发生变化的主要影响因子；此外，RDA分析发现，pH值为影响均腐土细菌群落结构的主导因子。而pH、EX-Ca、CEC为驱动干润均腐土细菌群落结构发生变化的主要影响因素，EX-Mg、 SOC、TP为驱动湿润均腐土细菌群落发生变化的主要影响因素。
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摘要
为研究中国土壤系统分类（CST）体系下均腐土不同亚纲土壤细菌群落结构的多样性，以 4 个干润均腐土［富牧西系（DFm）、春雷南系（DCl）、保国系（DBg）、明水系（DMs）］和 4 个湿润均腐土［大西江系 （MDx）、新发北系（MXf）、卫星农场系（MWx）、裴德系（MPd）］的腐殖质层（Ah 层）为研究对象，采用高通量测序技术研究细菌群落多样性，分析细菌群落结构与环境因子间的关系，以探讨影响均腐土不同亚纲群落结构的主要环境因子。结果表明：均腐土 8 个土系样品共获得 1674634 条基因序列，Shannon 指数和 Chao1 指数表现为：干润均腐土 > 湿润均腐土。均腐土 8 个土系细菌群落主要包括 10 个门类，其中变形菌门（Proteobacteria）、 放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）为富牧西系、春雷南系、保国系、大西江系、新发北系、卫星农场系、裴德系优势菌门，明水系以绿湾菌门（Chloroflexi）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门 （Actinobacteria）为优势菌门；属水平上，均腐土各土系的群落差异较大。样品热图分析将 8 个土系细菌群落聚为 2 类，其中干润均腐土聚为一类，湿润均腐土聚为一类。pH、交换性 Ca、CEC、交换性 Mg、SOC 和 TP 是影响均腐土细菌群落结构发生变化的主要因子（P <0.05）。此外，RDA 分析发现，土壤 pH 为影响均腐土细菌群落结构的主导因子，而 pH、交换性 Ca、CEC 为驱动干润均腐土细菌群落结构发生变化的主要影响因素，交换性 Mg、 SOC、TP 为驱动湿润均腐土细菌群落发生变化的主要影响因素。
Abstract
In order to study the diversity of Isohumisols bacterial community structure in different subclass of the Chinese soil system classification（CST）system，the humus layer（Ah）of the 4 Dry Isohumisols［Fumuxi Series（DFm），Chunleinan Series（DCl），Baoguo Series（DBg），Mingshui Series（DMs）］and 4 Moist Isohumisols［Daxijiang Series（MDx）， Xinfabei Series（MXf），Weixingnongchang Series（MWx），Peide Series（MPd）］were used as the research objects. The high-throughput sequencing technology was used to study the diversity of bacterial communities，and the relationship between bacterial community structure and environmental factors was analyzed to explore the main environmental factors affecting the different sub-family community structures of homogeneous mulch. The results showed that the 1674634 gene sequences were obtained from the Isohumisols. The Shannon and Chao1 indexes showed as：Dry Isohumisols>Mosit Isohumisols. In this study， the 8 soil series of Isohumisols was mainly comprised of 10 phylum. The dominant bacterial phylum were the Proteobacteria， Actinobacteria and Acidobacteria in Fumuxi Series，Chunleinan Series，Baoguo Series，Daxijiang Series，Xinfabei Series， Weixingnongchang Series，Peide Series. The Chloroflexi，Proteobacteria，and Actinobacteria were the dominant populations in Mingshui Series. At the genus level，the composition of Isohumisols bacterial communities was different from each other. According to the sample heat map analysis，the bacterial communities of 8 soil systems were grouped into 2 groups，the Dry Isohumisols was grouped into 1 group，and the Moist Isohumisols was grouped into 1 group. pH，EX-Ca，CEC，EX-Mg， SOC and TP were the main factors affecting the changes of bacterial community structure in the Isohumisols（P<0.05）. In addition，the RDA analysis found that soil pH was the leading factor affecting the community structure of Isohumisoils，while pH，EX-Ca and CEC were the main factors driving the change of the bacterial community structure of Dry Isohumisols，and EX-Mg，SOC and TP were the main factors driving the change of the bacterial community of Moist Isohumisols.