烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种细菌性的土传病害^[1]，在高温高湿的条件下，容易大面积爆发，造成烟区烟叶产量和质量下降，甚至绝收^[2]。以往对烟草青枯病的防控措施主要有抗病品种的选育^[3]、化学药剂防控^[4]及改善栽培管理^[5]等方面，然而，这些防控措施也存在着抗病品种选育周期长，需要大量人力物力，化学药剂破坏环境，轮作方式受土地限制等诸多问题^[6]。

石灰氮作为肥料使用已经有超过百年的历史，由于其转化过程的中间和最终产物都会对作物产生毒害作用，其推广应用受到了一定影响^[7]。随着技术进步和研究的深入，石灰氮作为一种具有补充Ca、Mg等中量元素、改良土壤和土壤杀菌等多种功效的氮素肥料再次进入了农业的使用范围^[8]。石灰氮在土壤中缓慢水解，生成氢氧化钙和氰氨，氰氨对土壤微生物具有较强的杀灭作用，并逐渐水解形成尿素或氨，直接被植物吸收^[9]。以往的研究表明施用石灰氮能有效改善土壤理化性状和防治土传病害^[10]，但石灰氮施用对土壤微生物群落结构等产生的影响方面研究较少。因此，本试验通过高通量测序技术研究了施用石灰氮对烟株根际微生物区系和烟草青枯病发病率的影响，旨在为合理施用石灰氮以实现防控烟草青枯病的目的。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验于2018 年2 ～ 8 月在福建省邵武市沿山镇烟草基地（26°55′～ 27°35′N，117°2′～ 117°52′E） 进行。邵武市属于中亚热带季风气候区，气候温和湿润、日照充足、雨量充沛，常年平均降水量1800 mm左右，年平均气温18℃。试验地点海拔200 ～ 250 m，试验期间平均气温28.5℃，降水量较大。

1.2 烟田常规施肥管理

供试烤烟品种为K326，试验地前茬作物均为水稻，对往年病害情况进行统计并选取青枯病发病率相近的地块进行试验。供试烟田土壤为砂质壤土，土壤pH值5.3，有机质含量24.5 g/kg，碱解氮含量119.6 mg/kg，速效钾含量204.3 mg/kg，有效磷含量217.8 mg/kg。移栽前以条沟方式施用腐熟牛粪有机肥1500 kg/hm² 和钙镁磷肥（P₂O₅ 16%） 450 kg/hm² 后起垄并覆盖地膜。移栽时施烟叶专用肥465 kg/hm²，有效百分比为N∶P₂O₅ ∶（K₂O）=12.5 ∶ 8 ∶ 22.5，团棵期追施硝酸钾300 kg/hm²，旺长期追施硫酸钾345 kg/hm²。

1.3 试验处理

试验设置两个处理，每个处理小区面积为666.7 m²。处理1（T1）为空白对照，即烟株移栽前施用腐熟牛粪有机肥、钙镁磷肥，起垄后及时覆盖塑料膜，烟株移栽时再施用常规烟叶专用肥；处理2（T2）在移栽前施用腐熟牛粪有机肥和675 kg/hm² 的石灰氮，起垄后及时覆盖塑料膜。通过石灰氮施入的N量完全替代移栽时烟叶专用肥的N素，不足的磷、钾肥在烟苗移栽时以单质肥料形式补足。两处理均于团棵期追施硝酸钾和旺长期追施硫酸钾的数量相同。每个处理设置3 次重复。试验用石灰氮为灰白色粉未，N素含量约20%，CaO含量约为35%，pH为11.5。该肥料在土壤中养分释放相对缓慢，因而肥效高。

1.4 测定内容及方法

1.4.1 土样采集

分别在烟株移栽前（编号YZ）、团棵期（移栽后40 d，编号TK）、旺长期（移栽后70 d，编号WZ）和成熟期（移栽后100 d，编号CS），采用S型五点取样法采取烟株根际土壤。取样时首先去除烟株根部表层土壤，于烟株茎部为中心直径10 cm左右、深10 cm左右处的土壤进行取样。取样后用密封袋低温封存，用15 mL离心管装满立即送往上海美吉生物医药科技有限公司对微生物进行基因测序。

1.4.2 微生物基因测序

土壤冷冻样品微生物（包括细菌和真菌）测序采用第二代高通量测序技术，对烟株不同生长时期的土壤样本进行细菌（16S rDNA）和真菌（18S rDNA）序列检测。

DNA抽提和PCR扩增：根据E.Z.N.A.^® soil试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用Nano Drop 2000 进行检测，利用1%琼脂糖凝胶泳检测DNA的提取质量；细菌16S用338F（5’-ACTCCTACG GGAGGCAGCAG-3’） 和806R（5’-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3’）引物对V3-V4 可变区进行PCR扩增；真菌18S用SSU081F（5’-TTAGCATG GAATAATRRAATAGGA-3’）和1196R（5’-TCTG GACCTGGTGAGTTTCC-3’）引物对V5-V7 可变区进行PCR扩增。

Illumina Miseq测序：使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用Quanti Fluor^TM-ST（Promega，USA）进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台（Illumina，San Diego， USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建文库，16S为PE2*300 文库，18S为PE2*250 文库。用Illumina公司的Miseq PE300 平台进行测序。原始数据上传至NCBI数据库中。

数据处理：原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接，使用的UPARSE软件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/） 对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。

1.4.3 病情指数测定

为了评估石灰氮对烟草青枯病的防治效果，在烟株移栽后每隔l0 d记载发病情况，统计病情，计算青枯病的发病率、病情指数和防控率。青枯病病情指数的分级调查按照《GB/T23222-2008 烟草病虫害分级及调查方法》进行。

发病率（%）=（发病株数/总株数）×100；

病情指数（%）=（Σ 各级病株数或叶数 × 该病级值）/调查总株数或叶数 × 最高级值）×100；

防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数 ×100

1.5 数据计算与统计分析

微生物数量采用Excel2010 进行数据处理，显著性分析和主成份分析采用SPSS 20.0。测序数据在I-Sanger生物信息分析云平台进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 石灰氮对土壤微生物区系的影响

2.1.1 石灰氮对土壤细菌群落组成的影响

如图1 所示，在门水平上共列出12 种在样本中占比大于1%的物种，如果将相对丰度>10%的细菌划分为优势类群，则样本中共有5 种优势物种，其相对丰度占样本总量的80%以上。对优势类群在各个时期进行分析的结果表明，移栽前3 个平行样本菌落结构无明显差异。变形菌门（Proteobacteria）在整个烟株生长过程中表现出先减少后增多的趋势，处理组略低于对照。绿弯菌门（Chloroflexin）在团棵期对照、处理组中的相对丰度分别为20.3%、23.2%，在旺长期对照、处理组中的相对丰度分别为16.1%、19.1%，在成熟期对照与处理组中差异不明显。放线菌门（Actinobacteria）在移栽前的土壤样本中相对丰度较少，进入团棵期后相对丰度增加，成熟期处理组略低于对照。酸杆菌门（Acidobacteria）在移栽前的土壤样品中相对丰度较高，进入团棵期后明显减少，进入旺长期后表现为处理组略高于对照。厚壁菌门（Firmictes） 在整个烟株生长时期内在土壤样本中的相对丰度先增加后减少，团棵期对照、处理组中的相对丰度分别为9.0%、7.7%，旺长期对照、处理组中的相对丰度分别为11.4%、6.8%，成熟期差异不显著。非优势菌种中，值得注意的是硝化螺旋菌门（Nitrospirae）在整个烟株生长过程中均表现为处理组明显高于对照，团棵期对照、处理组中的相对丰度分别为0.60%、0.93%，旺长期对照、处理组中的相对丰度分别为0.70%、1.29%（P<0.05）。试验表明，施用石灰氮在团棵期与旺长期对烟株根际土壤细菌菌落结构影响较大，且能明显增加烟株根际土壤中硝化螺旋菌门（Nitrospirae）的相对丰度。

2.1.2 石灰氮对真菌群落组成的影响

如图2 所示，在真菌门水平上共列出7 种在样本中占比大于1%的物种，其中子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）为优势物种，占样本总量的95%以上。其中子囊菌门（Ascomycota）在整个烟株生长时期内表现为处理组显著低于对照，团棵期在对照、处理组中的相对丰度分别为76.7%、61.2%，旺长期分别为78.7%、 73.0%，成熟期分别为79.2%、68.6%。担子菌门（Basidiomycota）在整个烟株生长时期内表现为处理组显著高于对照，团棵期在对照、处理组中的相对丰度分别为17.9%、36.8%，旺长期分别为11.5%、 22.9%（P<0.05），成熟期分别为12.3%、23.1%。各非优势物种在团棵期与旺长期均表现为处理组明显低于对照。试验表明施用石灰氮降低了烟株根际土壤中子囊菌门（Ascomycota）的相对丰度，增加了担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度，且在团棵期与旺长期明显改变了烟株根际土壤真菌菌落结构。

2.1.3 石灰氮对烟株根际土壤微生物Alpha多样性的影响

细菌Alpha多样性如表1 所示，环境中微生物的多样性分析可以反映微生物群落的相对丰度和多样性变化。Coverage指数是指各样本文库的覆盖率，其数值越高则样本中序列被测出的概率越高。本试验中各样本细菌的Coverage指数都在94%以上，表明本次测序结果能够代表样本中微生物的真实情况。Sobs指数表示丰富度实际观测值，既OTU数目，可表示样本中物种数量的多少，其在移栽前为最高，在整个烟株生长时期均表现为处理组高于对照，旺长期差异最为显著，对照、处理组中分别为2941、3127。Shannon指数能反映群落多样性，其指数值越大说明群落多样性越高，其在旺长期开始表现出显著差异，在对照、处理组中分别为6.75、 6.96，成熟期在对照、处理组中分别为6.77、6.84。 Chao指数反映群落丰富度，指数越大群落丰富度越高，其仅在旺长期表现为处理组略高于对照。表明施用石灰氮增加了烟株根际土壤中细菌的数量和群落多样性。

真菌Alpha多样性如表2 所示，Sobs指数在团棵期的对照、处理组中分别为257、230，进入旺长期后差异减小，但均表现为处理组低于对照。 Shannon指数仅在旺长期表现为处理组高于对照，其余时期均表现为处理组略低于对照。Chao指数在整个烟株生长时期均表现出处理组低于对照。表明施用石灰氮降低了烟株根际土壤中细菌的数量和群落丰富度。

2.1.4 石灰氮对烟株根际土壤微生物Beta多样性的影响

PCA主成分分析能够反映不同调控措施下烟株根际土壤微生物区系的变化情况，样本相似度越高，在图像中表现越聚集。图3a为细菌属水平PCA图，移栽前未施用石灰氮，3 样本为平行样，可以很好地聚集说明细菌群落相似度较高，团棵期对照与处理之间开始表现出差别，对照与处理之间平行样本各自聚集且区别明显，表明施用石灰氮明显改变了烟株根际细菌的群落结构。随着烟株生长其根际细菌群落结构的差异进一步增大，表明石灰氮的施用改变了烟株根际土壤中细菌群落结构的演化方向。图3b为真菌PCA图，可以看出，随着烟株生长其根际真菌群落在朝着一定的方向演化，这点与细菌相似，但处理组与对照差异不明显，表明施用石灰氮对烟株根际真菌群落结构的影响程度弱于细菌。

2.1.5 石灰氮对烟株根际土壤微生物区系及物种差异的影响

为了找出处理组与对照之间的差异物种，将对照与处理组在4 个时期微生物的群落相对丰度数据分别整合成T1、T2 两组，运用统计学方法检测不同组（样本）微生物群落中表现出的丰富度差异的物种，进行假设性检验，评估观察到的差异显著性，从而得到具有显著差异的物种。细菌在属水平上共列出15 种差异物种（图4a），其中鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、黄杆菌属（Flavisolibacte）等7 种物种表现为处理组显著高于对照，其余则表现为处理组显著低于对照，这3 种菌均能参与土壤氮循环与转化，表明施用石灰氮可以显著改变土壤中某些功能菌的相对丰度。而真菌（图4b）在属水平共有7 种在物种相对丰度上表现出显著差异的物种，其中假霉样真菌属（Pseudallescheria）、norank_k__Fungi、unclassified_k__Fungi、酵母菌目下的属（unclassifiedo__Saccharomycetales）、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）表现为处理组显著低于对照。

注：纵坐标表示属分类水平下的物种名，横坐标表示该样本的某一物种相对丰度的百分数数值，不同颜色表示不同分组。最右边为 P 值，* 表示0.01<P ≤ 0.05，** 表示0.001<P ≤ 0.01，*** 表示 P ≤ 0.001。

2.2 施用石灰氮对烟叶产量及发病率的影响

2.2.1 石灰氮对烟叶产量与品质的影响

如表3 所示，施用石灰氮的处理组与对照相比产量提高了11.7%，均价提高了4.3%，中上等烟比例提高了8.7%，表明石灰氮达到防控青枯病及改变烟株根际土壤微生物区系的同时也达到了增产和增值的效果。

注：同列不同小写字母表示不同处理差异显著（P<0.05）。下同。

2.2.2 烟株发病情况统计

如表4 所示，在对照中发病率为75.3%，施用石灰氮后青枯病的发病率显著降低，在处理组中发病率为41.2%，其防控效果分别为49.9%，表明施用石灰氮能对烟草青枯病有较好的防控效果。

3 结论与讨论

石灰氮施用在土壤后，Alpha多样性表明石灰氮不仅减少了烟株根际土壤微生物的数量，同时降低了其群落多样性与丰富度，物种组成分析表明，绿弯菌门（Chloroflexin）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）等优势菌种在该时期表现出差异，说明施用石灰氮在前期改变了烟株根际土壤微生物的群落结构。这主要是石灰氮遇水分解后所生成的液体氰胺与气体氰胺，对土壤中的真菌、细菌等有害生物具有广谱性的杀灭作用，而起垄后覆盖地膜，在日光照射下可以提高土壤温度，经过热力灭菌作用，达到杀死土壤有害生物的目的^[10]。

而根据黄国峰等^[11]的研究结果表明，施用石灰氮后的前期对土壤中的微生物数量抑制效果显著，但施用石灰氮对土壤微生物数量冲击比较柔和，各菌种在定殖20 d后其数量可恢复到正常水平。旺长期根际土壤细菌的各物种多样性指数均表现为处理组显著高于对照，PCA分析显示此时处理组烟株根际土壤微生物区系结构与对照明显不同。推测其原因可能是：施用石灰氮虽灭杀了大量的土壤微生物，但也提供了许多土壤微生物生态位^[12]，旺长期烟株根系大量可溶性的分泌物为细菌提供了足够的有效性碳源^[13]，而植物主要是通过根际分泌物影响土壤微生物群落组成^[14]。石灰氮分解也为微生物提供了氮源，创造了土壤微生物定殖的条件，同时也增加了鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、黄杆菌属（Flavisolibacte）等与土壤氮循环有关的功能菌的相对丰度。鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）是土壤主要有益菌之一，可促进烟株根际吸收营养，抵抗多种病原菌，还有研究表明，鞘脂单胞菌属中某些菌株具有固氮和脱氢特性，在维持土壤氮平衡方面起着重要作用^[15]；硝化螺旋菌属（Nitrospira）可以将硝化菌氧化土壤氨生成的亚硝酸继续氧化成硝酸盐，而硝酸盐是土壤中作物易吸收的氮源形式，因此土壤中硝化螺旋菌的增加可以间接地增加土壤氮肥力^[16]，虽然石灰氮的中间产物在前期会对硝化细菌产生抑制作用，但随着烟株生长其中间产物会在土壤中分解或被其他土壤微生物转化，在后期石灰氮分解产生的氨为硝化细菌大量定殖创造了条件；另外根据梁志婷^[17]的研究结果表明，黄杆菌属（Flavisolibacte）被认为参与了土壤氮代谢过程。这些因素共同作用使处理组烟株根际微生物区系结构朝不同的方向演化，进而在成熟期的烟株根际逐渐形成具有更高物种多样性及丰富度的微生物群落。而高水平的微生物多样性能够抑制土传病害的发生，提高土壤质量^[18-20]，最终达到降低青枯病发病率、提高烟叶产量与品质的目的。由于施用石灰氮对烟株根际微生物的杀灭作用具有广泛性，所以在杀灭病原菌的同时也会杀灭益生菌。在施用石灰氮一段时间后如团棵期或旺长期，在土壤中施加益生菌，其对烟株根际土壤微生物区系结构的影响有待进一步探究。

参考文献