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烟草是我国重要的经济作物，但是长期以来由于连作和大量化肥的施用，导致土传病害发生严重，烟区土壤质量退化，烟叶品质逐年下降[1]。烟草黑胫病是由烟草致病疫霉（Phytophthora nicotiana） 引起的一类土传真菌病害[2]。该病常致烟草矮化、萎焉、叶片发黄、根和茎基部坏死，是烟草生产中为害最重的病害之一。由于烟草的特殊性，化学农药防治受到很大限制，也不能满足绿色生态发展的需求。通过研制兼具土壤营养调控和防病促生的微生物制剂，改善烟田土壤化学和生物性状，调控土壤养分的供给和利用率，控制病害发生发展是实现烟草农业绿色防控、提质增效的重要手段。在最近的研究中，李倩等[3]报道了一种微生物制剂的使用可以显著增加土壤细菌、放线菌、自生固氮菌、无机磷细菌和钾细菌的数量，从而提高了土壤脱氢酶、脲酶和蔗糖酶活性，并对烟草土传病害有一定防效。另一项研究表明，施用复合微生物菌剂、腐熟剂和溶磷剂能显著提高烤烟的农艺性状，上等烟比例、亩产量、亩产值均显著增加，其中产值增加可达32%以上[4]。在其他作物中，复合微生物制剂也同样起到了显著效果。麻耀华等[5]对不同生育时期的黄瓜施入复合微生物制剂，根际土壤细菌和放线菌的数量明显增加，土壤脲酶、蔗糖酶、中性磷酸酶活性提高了一倍以上。由此可见，筛选和开发复合微生物制剂是一种行之有效的措施。本研究前期已筛选了大量烟草根际微生物，现通过对效果良好的菌株进行复合筛选和评价，以期获得兼具土壤调节和防病促生的复合微生物制剂。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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1.1.1 烟草品种
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采用生产主栽品种云烟99。
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1.1.2 微生物菌种
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采用实验室从北京、云南等地分离保存的根际益生菌芽孢杆菌S711（Bacillus sp.）、假单胞菌S1130（Pseudomonas sp.）、鞘氨醇菌S1191（Sphingobium sp.）和不动杆菌S1063（Acinetobacter sp.）。由S711、 S1130、S1063 制备复合微生物制剂T1，由S711、 S1130、S11191 制备复合微生物制剂T2，活菌含量均为1×109 cfu/mL。
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1.1.3 拮抗、解磷、解钾、产酶和生长素检测
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对烟草致病疫霉（Phytophthora nicotiana）的拮抗采用对峙培养法[6]。其他功能检测参考文献[7-10]。
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1.1.4 试验设计
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试验设3 个处理，每个处理3 个重复，分别施用复合微生物制剂T1、T2 为处理组，每盆加入终浓度为1×108 cfu/g的复合微生物制剂，搅拌均匀，以不施入复合微生物制剂为对照（CK）。移入烟草苗，待4 周后伤根接种10 mL 1×106 cfu/mL的烟草致病疫霉，15 d后检测记录结果。
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1.2 测定方法
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1.2.1 土壤酶活性测定
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土壤酶活性测定方法参考已发表论文并作部分改进[11-14]。土壤脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定，以每克土24 h产生的NH3-N毫克数表示；蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，以每克土24 h产生的葡萄糖毫克数表示。过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，以每克土消耗0.1 mol/L KMnO4 毫升数表示。根际土壤呼吸强度由便携式土壤呼吸分析仪SRS-SD1000 测定。采用氯仿熏蒸浸提法提取土壤微生物量碳和微生物量氮，采用K2Cr2O7 氧化法测定浸提液中的微生物量碳，采用凯氏定氮法测定微生物生物量氮。利用土壤微生物基础呼吸与微生物量碳的比值计算土壤微生物代谢熵（qCO2）。
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1.2.2 病情指数与防治效果
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参照烟草病虫害分级及调查方法[15]，计算病情指数和防治效果。
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病情指数＝ 100×Σ（各级病叶数 × 各级代表值）/（调查总叶数 × 最高级代表值）
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防治效果（%）＝（对照病情指数-处理组病情指数）/对照病情指数 ×100
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1.3 数据统计
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采用SPSS 23.0 软件进行统计分析，Duncan’s进行差异显著性分析，不同处理间显著差异水平为 P<0.05。
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2 结果与分析
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2.1 供试菌株的有益生物学功能
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首先对供试菌株进行全面的有益功能检测，结果如表1 所示。S711 与S1130 均对烟草致病疫霉具有显著的抑制作用，而S1191 与S1063 无此功能。S711 无解有机、无机磷、产嗜铁素和生长素的能力，但是该菌株具有很强的产氨、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力。S1130 与S711 相比，虽不产酶但其解钾、产嗜铁素和生长素能力显著，并具有一定的有机磷分解能力。S1063 与其他菌株相比具有突出的分解有机磷的能力，而S1191 表现出多种功能，如分解有机磷、无机磷、解钾、产嗜铁素、产氨和生长素以及蛋白酶等特性。由此可见，本研究所采用的菌株具有功能多样性，各自具有独特的有益功能，可以作为复合微生物制剂的备选。
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注：+ 代表具有拮抗或产酶活性，-代表无相关活性。
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2.2 土壤酶活性
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两种复合微生物制剂（T1、T2）的施用不同程度上影响了根际土壤脱氢酶、脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的活性（表2）。复合微生物制剂T1 虽然对土壤酶活性有一定提高，但其作用显著低于复合制剂T2。尤其过氧化氢酶的活性，T2 处理后显著高于对照和T1，而T1 对土壤过氧化氢酶无显著影响。复合微生物制剂T2 的施用对脲酶和蔗糖酶活性的提高最为显著，其值分别达到1.68 和30.32 mg/（g·d）。由此说明制剂T2 对调节土壤营养供给具有显著效果。
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注：表中数据为平均值 ± 标准差。小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。下同。
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2.3 土壤微生物活性
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由于复合微生物制剂的施用提高了土壤酶活性，因此推测土壤微生物的活性可能也受到了影响。从图1 来看，T1 和T2 均显著提高了土壤微生物量碳、氮和土壤呼吸强度。且T2 对土壤微生物活性的影响显著高于T1。从微生物代谢熵值可以发现，T1 处理没有显著变化，而T2 显著降低了土壤微生物代谢熵。由此推断复合微生物制剂改善了烟株根际土壤环境，微生物生长与代谢增强。
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图1 复合微生物制剂对土壤微生物活性的影响
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注：小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。
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2.4 黑胫病防治效果
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本研究所选用的有益微生物具有多种生防特性，由此检测了各复合制剂对烟草黑胫病的防治效果。接种烟草致病疫霉后15 d，对照病情指数达到了73.2%，而施用复合微生物制剂的处理均显著降低了发病率。复合微生物制剂T1 处理的烟草黑胫病指数为56.6%，防效仅为22.7%；制剂T2 处理后黑胫病指数低于20%，仅为17.3%，防效显著高于T1，达到76.4%，且经过3 次独立重复后防效稳定。因此，复合微生物制剂T2 具有明显的烟草黑胫病防治功能。
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3 讨论与结论
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土壤是植物生长的根基，土壤质量是植物健康生长的重要保证。良好的土壤环境可以增强微生物代谢活动，提高呼吸强度，降低代谢熵，促进碳氮源的利用率。许多土壤有益微生物可通过分泌土壤酶、参与有机质降解和驱动养分循环，改善土壤的理化及生物学性质，并通过拮抗、寄生及溶菌等作用抑制有害病原菌的侵染和繁殖，促进植物健康生长，进而提升作物产量和品质[16-19]。本研究采用了能够拮抗病原菌、产酶、解磷、解钾、产嗜铁素和生长素的菌株，通过对优良菌株的组合使用，改善了土壤环境，降低了烟草黑胫病的发生，实现了多功能互补。
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拮抗作用是目前病害生防菌筛选中的首选指标，也是次生代谢产物中抑制病原菌生长最直观、最简便、最有效的因素[20]。本研究中的S711 和S1130 均具有非常强的抑制烟草致病疫霉的作用，因此在两种复合微生物制剂中均同时使用了这两株菌。其中S711 属于芽孢杆菌，此类菌代谢广泛，可产生多种抗生素、抗菌肽和水解酶，其根部定殖和环境适应性强，是农业生产中生物农药和微生物肥料的主成分。S711 菌株具备芽孢杆菌特有的拮抗病原菌的能力，以及产氨、产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力。S1130 属于假单胞菌，这类细菌营养需求简单，在自然界中广泛存在。尤其在植物根际部分，所筛选到的具有生防活性的细菌绝大部分属于假单胞菌属，代表菌株如 P.aureofaciens 30-84，P.fluorescens CHA0，P.kilonensis F113， P.fluorescens Q2-87，P．fluorescens Pf-5 等[21-23]。假单胞菌作为生防菌有其自身的优势，它所产生的次生代谢产物种类较多，在植物根围中可以被植物选择性的利用。另外，假单胞菌具有很强的根部定殖能力，很多菌株可产生刺激植物生长的激素，本研究中S1130 即可产生植物生长素。复合微生物制剂T1 和T2 的区别在于第3 个菌株的选择，T1 选用了S1063，而T2 选用了S1191。S1063 属于不动杆菌，该菌株具有显著的降解有机磷的能力，以及一定的无机磷降解和产氨、产嗜铁素的能力。 S1191 属于鞘醇属，除了具备S1063 的有益功能外，还具有显著的产嗜铁素、蛋白酶和生长素的能力。嗜铁素是一种低分子量但对三价铁高亲和性的螯合物，可以将铁运输到细菌细胞内。嗜铁素造成的铁缺乏环境会阻止真菌孢子的萌发，这种有效的铁吸收机制可能是这些菌株能够与其它微生物竞争而在植物根部有效定殖的重要原因[24]。复合微生物制剂T2 中所特有的产水解酶和生长素特性也可能是其改善土壤环境、防治病害的重要因素。已有研究表明，有益微生物产生的蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶等真菌细胞壁水解酶在与病原菌相互作用中发挥重要的作用，可对病原菌孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长有强烈的抑制作用[25-26]。
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综上所述，利用复合微生物制剂可以达到改善土壤性质和防治病害的目的。本研究通过对有益微生物筛选和组合后创制的复合微生物制剂T2 显著提高了土壤酶和微生物活性，降低了烟草黑胫病的发病率和病情指数，具有潜在改良土壤和防治土传病害的开发价值。
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摘要
烟草是我国重要的经济作物，利用微生物制剂改善土壤性质，防治烟草土传病害是实现绿色防控的重要途径。利用实验室已筛选的多功能有益微生物进行复配，研究了两种复合微生物制剂 T1（芽孢杆菌、假单胞菌、 不动杆菌）和 T2（芽孢杆菌、假单胞菌、鞘氨醇菌）对土壤理化性质的影响以及对烟草黑胫病的防治效果。结果表明，与未施用微生物制剂的对照相比，T1 和 T2 均显著提高了土壤脱氢酶、脲酶和蔗糖酶活性，同时也显著提高了土壤微生物量碳、微生物量氮和土壤呼吸强度，且 T2 与 T1 相比效果更为突出。制剂 T2 还显著提高了土壤过氧化氢酶活性，降低了微生物代谢熵，而 T1 则无显著影响。病害防治试验显示，T1 对烟草黑胫病的防效约 22.7%；T2 的防效显著高于 T1，达到 76.4%。由此表明，本研究创制的复合微生物制剂 T2 具有潜在改善土壤生物特性、防治烟草黑胫病的应用价值。
Abstract
Tobacco as the world’s most important non-food agricultural crop has great economic importance in China. It is a vital manner for tobacco green management using microbial agents to regulate soil properties and control soil-borne diseases．In this study，four beneficial bacterial strains were used to make two compound microbial agents which were determined the effect on soil physical and chemical properties and tobacco black shank. Agent T1 was composed by Bacillus sp. S711，Pseudomonas sp. S1130 and Acinetobacter sp. S1063 while T2 included Bacillus sp. S711，Pseudomonas sp．S1130 and Sphingobium sp. S1191. Both agents T1 and T2 increased the enzymatic activities of soil dehydrogenase，urease and sucrase，and also improved soil microbial biomass carbon and nitrogen，even the intensity of soil respiration. Importantly，the results indicated that T2 was more efficient than T1．Compared to agent T1，T2 specifically increased the enzymatic activity of catalase and decreased soil microbial metabolic quotient. Agent T2 had a high control efficiency at 76.4% for tobacco black shank，which is significantly higher than treated by T1，which had a very low control efficiency at 22.7%．These results suggest that the compound microbial agent T2 would be potentially used in soil management and biological control of soil-borne diseases.