硝化作用是连接固氮作用与反硝化作用的中间环节，不仅决定着植物对氮素的利用效率，还与过量氮肥投入导致的土壤酸化等一系列生态环境问题密切相关^[1]。而氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）参与的氨氧化过程，是硝化作用的首个反应过程，也是限制整个硝化作用反应速度的重要过程^[2]。研究结果表明，土壤环境因子的变化如pH值、有机质、施肥管理措施、土壤类型等的改变对土壤氨氧化微生物类群有特异选择性^[3-5]。国内外大量研究表明，AOB和AOA对于施肥与pH值等环境变化的响应不同^[6-9]。对湖南祁阳酸性红壤研究表明，虽然AOB与AOA的丰度都与土样的硝化潜势有非常显著的正相关性，然而只有AOA群落结构受土壤pH影响显著^[6]。内蒙古草原上长期施用氮肥而导致酸化的土壤很大程度上改变了AOB的群落组成，而对AOA的群落组成影响较小^[10]。同时，Shen等^[11]研究表明，在碱性土壤中，土壤的pH值和AOB的丰度呈显著负相关（r=-0.612，P<0.01），而AOA丰度和土壤pH值没有显著相关性。但也有研究结果表明，不同施肥处理之间的AOA和AOB丰度不同，AOA amoA基因的拷贝数量高于AOB amoA基因^[7，12-13]。然而，Nyberg等^[14]研究表明施肥不会引起氨氧化微生物群落组成的任何变化。以上研究说明，在不同生境、不同植物类型AOB和AOA的群落结构和活性对环境条件变化的响应都存在差异，对土壤硝化作用的贡献也不一样，进一步认识两类微生物在不同植物系统中的生态特点和它们在功能活性上的变化规律，对认识氮循环具有重要意义。

湖北省是我国中部地区重要的蚕桑主产区，现有桑园面积约2万hm²，但桑园立地条件普遍较差，多处于山坡地带，桑树产叶量较低，蚕农为了得到足量桑叶满足养蚕需求，长期施用氮肥以增加产叶量。虽然氮肥的施入可提高桑树的产叶量，但长期的超量施用也造成桑园土壤酸化现象严重（pH值小于5.5），土壤环境恶化，氮肥利用率逐渐下降，最终导致桑叶产量降低，品质变劣，养蚕成绩差。土壤酸化等环境因子发生改变会直接导致土壤微生物群落多样性的改变^[13]，尤其是土壤中功能微生物（氨氧化微生物）多样性的变化^[6，13]。近年来，国内外研究者报道了pH对于AOB和AOA的影响^[6-10]，但长期偏施氮肥引起桑园土壤酸化对土壤AOB和AOA种群结构的影响尚未见研究报道，本文利用Real-time PCR和PCR-DGGE技术对以上问题进行深入研究，为桑园氮素的有效管理及调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 桑园施肥处理及土壤样品采集

试验地位于湖北省农业科学院经济作物研究所的桑树资源圃（30°35′N，114°37′E，海拔50m），具有典型的亚热带季风性气候，平均年降水量为1269mm，平均温度为15.8～17.5℃。试验桑树品种为湖桑32号，分别定植于1982、1997和2010年，定植株行距为0.5m×1.7m。每个处理小区面积30m²，重复种植4个小区，自定植以来统一施用化肥尿素，施用量450kg·hm^-2 氮素（N），肥料分2次施入，春季施入40%，夏伐后施入60%，施肥方式为沟施，施肥后覆土，以未施肥桑园田埂土壤为对照。

于2014和2015年5、7、11月，采用“S”形5点取样法取施肥4年（4Y）、17年（17Y）、32年（32Y）和对照0年（0Y）0～20cm土层土壤并分别混匀，记录取样点GPS信息，共3次采集，每次4份样品。一部分土样（约100g）用液氮速冻后置于-20℃保存，以供后续土壤微生物分子生物学研究；另一部分土样则自然风干，用于土壤理化性质分析。土壤硝态氮的测定采用酚二磺酸比色法，土壤铵态氮测定采用纳氏试剂比色法，土壤潜在硝化速率（PNR）测定采用格里斯试剂比色法，土壤有机质测定采用重铬酸钾容量法^[15]。

1.2 土壤DNA提取和Rt-PCR定量分析

每个施肥处理组取5g土样，按照e.Z.N.A Soil DNA Kit试剂盒（Omega Bio-Tec，USA）的操作步骤，提取土壤微生物总DNA。AOB和AOA amoA基因采用iCycler iQ5扩增仪（Bio-Rad，USA）进行荧光定量PCR测定。表2中列出了所用引物和TaqMan探针的浓度。AOA amoA基因扩增体系为20 μL，包括10 μL SYBR® Premix Ex Taq^TM（Takara， Japan），2 μL牛血清白蛋白（25mg·mL^-1），正反引物各0.5 μL（10 μmol·L^-1），DNA稀释液2 μL（1～10ng）作为模板。氨氧化古菌amoA基因定量采用SYBR® Premix Ex Taq^TM（TaKaRa）。 AOB amoA基因扩增体系为25 μL，2.5U HotStar Taq DNA聚合酶（Qiagen，Valencia，CA），正反引物各0.5 μL（10 μmol·L^-1），DNA稀释液2 μL（1～10ng）作为模板。数据分析采用iCycler软件（version 1.0.1384.0CR）。定量PCR及标准曲线测定采用He等^[6] 和Shen等^[11] 研究方法，PCR效率为90%～100%，r² 为0.98～0.99。

1.3 PCR扩增和变性梯度凝胶电泳（DGGE）

以提取的土壤微生物总DNA为模板，分别利用AOB与AOA amoA基因的特异性引物对土壤样品的AOB与AOA的amoA基因进行扩增^[16]（ 表1），引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。扩增体系为30 μL，包括：2×Es Taq MasterMix 15 μL，正反引物各10 μmol·L^-1 1.2 μL，DNA模板3 μL，RNase-Free Water 9.6 μL。扩增完成后，取5 μL的PCR产物，利用1%琼脂糖胶对AOB和AOA的amoA基因进行检测。AOB和AOA amoA基因扩展的反应程序见表1。

注：AOB探针5’端结合发光集团FAM（6-羧基荧光素），3’端结合猝灭集团TAMRA（四甲基-6-羧基罗丹明）（Takara Bio，Japan）。

采用Bio-Rad D Gene系统（Bio-Rad Laboratories， Hercules，CA，USA）分离PCR产物。AOA amoA基因PCR产物的分离采用8%聚丙烯酰胺凝胶， 15%～55%变性梯度；AOB amoA基因PCR产物分离采用6%聚丙烯酰胺凝胶，30%～60%变性梯度，DGGE电泳缓冲液为1×TAE。AOB目的基因扩增产物分离的电压80V，电泳时间14h； AOA目的基因扩增产物分离的电压先是200V、10min，然后是80V、16h。DGGE电泳结束后，利用SYBR Green核酸染料染色后，立即用Gel DOC^TM XR⁺ 型号凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories， Hercules，CA，USA）成像和拍照。

1.4 克隆和测序及序列分析

将不同土壤样品的主要DGGE条带切胶并进行克隆和测序分析。以回收好的DNA条带溶液为模板，分别用引物amoA1F/amoA2R和arch amoAF/arch amoAR进行再扩增，按照纯化试剂盒的操作步骤将PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物连接到pMDTM18-T vector（Promega，USA）载体上，将连接好的反应液加入到融好的DH5α 感受态细胞中，经过37℃培养后，根据蓝白筛选的原理，挑取阳性克隆子，进行菌落PCR鉴定，挑取验证的阳性克隆子接于LB培养液，同时按照氨苄（10mg·mL^-1）：培养液为1∶1000加入氨苄抗生素，于37℃摇床上震荡过夜培养，然后送到擎科生物科技有限公司测序。将测序得到的amoA基因序列提交GenBank数据库，AOB数据库登录号为KX036835-KX036853，AOA数据库登录号为KX036800-KX036814。

运用CHECK-CHIMERA程序在RDP在线数据库进行嵌合体检验，去除嵌合及怪异序列。所有获得序列在GenBank数据库进行比对分析，由BLAST去掉同源性对比相同的结果，选取文库中amoA基因序列和已知环境样品进行分析，共同构建系统发育树。使用MEGA 5.1软件构建系统发育树。

1.5 数据处理与统计分析

获得的DGGE图谱采用Quantity one4.6.2（BioRad）软件对其进行数据分析，分别对电泳条带多少、条带密度和多样性3个方面进行分析。参照郭正刚等^[17]的方法，采用Shannon多样性指数（H）、 Pielou均匀度指数（E）分析DGGE图谱。计算公式如下：$H=-\sum P_i\mathrm{l}\mathrm{n}{P}_i,E=H/\mathrm{l}\mathrm{n}{S}_{\circ }$

式中，P_i=N_i/N，N_i为属i的单菌落数量，N 为土样中总单菌落数量，S 为属i所在土样中属的数目。

定量PCR基因拷贝数均进行以10为底数的对数转换。采用SPSS 19.0进行单因素方差分析（oneway ANOVA）、Tukcy多重比较试验，用Pearson相关分析进行氨氧化微生物多样性指数与土壤理化指标间的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同氮肥施用年限桑园土壤理化特性变化

氮肥对桑园土壤pH、有机质、NH₄ ⁺-N、NO₃^--N、潜在硝化速率等指标的影响因氮肥施用年限不同而异（表2）。随着氮肥施用年限的增加，桑园土壤pH、有机质含量、NO₃^--N含量、潜在硝化速率等指标呈下降趋势，而NH₄ ⁺-N含量呈升高趋势。4Y土壤pH、有机质含量、NO₃^--N含量和潜在硝化速率显著高于17Y和32Y土壤（P<0.05）。

2.2 不同氮肥施用年限桑园土壤AOB和AOA丰度比较

4 Y土壤中检测出的AOB丰度最高，其次是0Y土壤（图1A）。32Y土壤中AOB的丰度最低， 4Y土壤AOB丰度是32Y土壤的21～76 倍。17Y土壤和32Y土壤AOB丰度无显著差异。AOA丰度对氮肥的反应与AOB不同，4Y、17Y和32Y土壤AOA丰度比0Y土壤高（ 图1B），且32Y和0Y土壤之间达显著差异水平，而2014 和2015 年5 和11 月4Y、17Y和32Y土壤间比较无显著差异。AOB和AOA amoA基因拷贝数差异显著，各处理AOB amoA基因拷贝数为6.46×10⁵～8.32× 10⁷ ·g^-1 干土，显著高于AOB amoA基因拷贝数1.70×10⁴～1.20×10⁵ ·g^-1 干土。AOB与AOA amoA基因拷贝数的比值最高可达4894，表明氮肥施用年限显著影响AOB amoA基因的拷贝数（P<0.01），而采样时间对其没有明显影响（表3）。取样时间显著影响AOA amoA基因的拷贝（P<0.01），氮肥施用年限对其影响不显著（表3）。

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平具有显著差异。

注：数值为平均值 ± 标准差（n=3）。不同小写字母表示在0.05水平具有显著差异。

注：T 检验，* 表示在0.05水平上显著，** 表示在0.01水平上显著。

2.3 不同氮肥施用年限桑园土壤AOB和AOA种群结构变化

DGGE谱带分析表明，AOB与AOA种群结构对氮肥施用年限的反应明显不同（图2）。对于AOB，DGGE图谱分析检测到15条丰度较高AOB目的基因条带，条带1和2是0Y土壤特有条带，条带4～11在4Y土壤亮度较高，而在其他氮肥施用年限土壤中亮度较弱或没有检测到。条带12是17Y土壤特有条带，条带14和15是32Y土壤特有条带。对于AOA，不同氮肥施用年限土壤AOA种群差异明显（图2B），条带5～11在4Y土壤亮度较高，而在其他处理中没有检测到，条带13、14和15在32Y土壤亮度较高。

注：A为氨氧化细菌，B为氨氧化古菌；每组条带从左到右依次为氮肥施用0年（0Y，对照）、4年（4Y）、17年（17Y）和32年（32Y）桑园土样，相邻的2条带为2次重复。

2.4 不同氮肥施用年限桑园土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌种群结构多样性指数变化

各取样时间4Y土壤AOB多样性指数显著高于其他氮肥施用年限处理土壤（P<0.05）（除了2014年11月17Y土壤），而32Y和0Y土壤AOB的多样性指数显著低于4Y和17Y土壤（P<0.05）。但是对于AOA，各取样时间0Y土壤AOA多样性指数低于其他处理土壤，2014年7月，各处理间土壤AOA多样性指数差异不显著，而其他取样时间4Y、17Y和32Y土壤间AOA多样性指数没有显著差异（除了2014年11月取样），此外，11月AOA多样性指数明显高于其他采样时间（2014年0Y土壤除外）（表4）。主成分分析表明，主成分1（PC1） 与主成分2（PC2）分别解释了AOB群落DGGE条带48.65%和23.34%的变异，AOA群落DGGE条带45.02%和23.90%的变异，共解释了总变异的71.99%（AOB）和68.92%（AOA）（图3）。主成分荷载量分析表明AOB不同施肥处理土壤间离散距离较近，这表明，氮肥施用年限对AOB种群结构影响比取样时间明显。然而，对于AOA而言，相同取样时间的处理间离散距离较近（除0Y土壤），这表明取样时间对AOA种群结构的影响比氮肥施用年限显著（图3）。ANOVA分析表明，氮肥施用年限对AOB amoA基因的多样性指数影响显著（P< 0.01），而对于AOA amoA基因多样性指数，氮肥施用年限和取样时间对其均有一定的影响（表3）。

注：数值为平均值 ± 标准差（n=3）。同列数据后不同小写字母表示在0.05水平具有显著差异。

注：A为氨氧化细菌，B为氨氧化古菌。

2.5 氨氧化细菌和氨氧化古菌DGGE条带克隆测序和聚类分析

对有代表性的15个AOB DGGE条带进行切胶和测序，同NCBI数据库中已知序列进行比对， BLAST结果表明，AOB回收的条带序列与不可培养氨氧化细菌的同源性为99%到100%。聚类分析表明，所分离到的AOB amoA基因与 Nitrosospira 和 Nitrosomonas 两个属的同源性最高，被定义为两大簇3a和3c（图4），关于AOB聚类的分类在He等^[6]、Nyberg等^[14]的研究中已进行了初步定义。 0Y土壤中检测到的条带1和条带2与 Nitrosomonas 聚为一簇，条带8与施肥的红土聚为一类，属于3a集群。而其他大部分DGGE条带均与 Nitrosospira 菌属归为一类，属于3c集群。

AOA系统发育分析表明，切胶测序的15个条带与从已研究土壤中选的6个克隆被分成2个类群，被定义为集群W和Y（图5）。8个AOA序列被归为集群Y，其他条带序列被归为群集W。17Y和32Y土壤中条带14、条带15与NCBI中酸性土壤序列聚为一类，属于W2集群。

2.6 土壤理化因子与土壤氨氧化微生物种群丰度相关性

长期偏施氮肥桑园土壤AOB和AOA amoA基因丰度和种群结构多样性指数与土壤理化因子（pH、有机质、NH₄ ⁺ -N、NO₃^--N、潜在硝化速率） 之间的相关性分析表明，AOB amoA基因丰度和多样性指数与土壤潜在硝化速率呈显著正相关关系（R=0.604和0.515，P<0.05），而AOA与潜在硝化速率相关性不显著。AOB amoA基因丰度和多样性指数与土壤有机质（R=-0.512和-0.451，P<0.05） 和pH（R=-0.602和-0.535，P<0.05）值呈显著负相关关系，而AOA amoA基因丰度和多样性指数与土壤pH值和有机质相关性不显著（表5）。

注：克隆的定义包括以下信息：DGGE条带GenBank序列登录号，节点处步长值（>50%）。下同。

注：* 表示在0.05水平上显著相关。

3 小结与讨论

3.1 长期偏施氮肥对桑园土壤氨氧化微生物丰度的影响

施用氮肥不仅能够改善土壤中氮素的有效性，同时也会改变与硝化作用密切相关的AOB和AOA的种群结构和丰度^[4-7]。本研究中AOB amoA基因拷贝数较高（6.46×10⁵ ·g^-1 干土至8.32×10⁷ ·g^-1 干土），显著高于AOA（amoA基因拷贝数1.70×10⁴ ·g^-1 干土至1.20×10⁵ ·g^-1 干土），表明AOB和AOA在硝化作用中发挥潜在的重要性不同，此结果与前人的研究结果不一致，刘灵芝等^[7]和Li等^[18]发现AOA amoA基因拷贝数显著高于AOB amoA基因拷贝数。此外，本研究中发现氮肥施用4年土壤中AOB丰度显著高于其他氮肥施用年限桑园土壤，此与Chen等^[19]报道的结果相一致，氮肥施用5年显著增加AOB丰度；然而，长期施用氮肥显著降低了AOB丰度，氮肥施用17年和32年桑园土壤AOB丰度显著低于4年土壤，此结果与前人研究报告不一致，Chen等^[20]研究表明氮肥施用19年稻田土壤与其他施肥处理土壤相比AOB丰度没有显著差异，而He等^[6]报道长期（17年） 施用氮肥刺激了土壤环境中AOB丰度增长。对于以上相关研究结果不一致的一个可能的解释是，长期施用氮肥导致土壤pH值或有机质含量发生变化（表2），而植物种类不同，其土壤中AOB及AOA对土壤pH值或有机物质等土壤环境变化的响应可能不同所致。

长期施用氮肥会导致土壤酸化^[21]。本研究中，氮肥施用17和32年桑园土壤pH值和有机物含量显著降低，此结果与氮肥施用70年Brunisol土壤研究相一致^[22]，也和氮肥施用16年的稻田土壤一致^[6]。本研究2014和2015年两年结果一致表明， 17Y和32Y土壤AOB种群丰度较低，相应土壤pH值和有机质含量也低，这表明，土壤pH值或有机物含量可能是调控土壤中AOB丰度的重要因素，土壤pH降低或有机质含量的减少可能降低AOB丰度。而与AOB相比较，长期施用氮肥对AOA丰度无显著影响，AOA丰度和pH值之间无显著相关性；DGGE主成分分析也表明，取样时间对AOA种群结构影响显著，而氮肥的施用年限对其影响不显著（图3）。前人研究表明^[23-24]，AOA种群结构主要受土壤类型的影响，而肥料种类对其影响效果较小。此结果与He等^[6]和Leininger等^[12]的研究结果不一致，其研究结果表明在酸性土壤中AOA丰度受土壤pH值影响较大。相关研究结果不一致的原因可能是作物品种、土壤类型、肥料种类和土壤理化性质的不同导致的。

3.2 长期偏施氮肥对桑园土壤氨氧化微生物种群的影响

AOB amoA基因序列的聚类分析表明，Nitrosospira 或 Nitrosospira 属两个集群在不同氮肥施用年限处理土壤中占主导地位，这与前人研究报道较一致^[6，25]，Nitrosospira 是农业施肥土壤中最常见的一类硝化细菌^[6]。虽然 Nitrosospira 集群1和2已经被证明存在于水稻酸性红土或施肥旱地土壤^[26-27]，但是这些集群在本研究中没有检测到，表明长期施用氮肥的桑园土壤可能具有独特的amoA基因谱系。本研究中AOA序列被分成两种不同的集群（W集群和Y集群）。集群W和集群Y中的序列主要与6种不同的土壤及 Nitrososphaera 密切相关^[6，28]。值得注意的是，从NCBI中提取的酸性土壤序列与17Y和32Y土壤中分离的序列聚为同一类群W2类群，这表明长期施用氮肥改变了AOA种群组成，17Y或32Y土壤AOA类群可能和栽植地块较酸土壤AOA类群类似。

总之，长期偏施氮肥能够引起桑园土壤酸化。 AOB和AOA种群结构及丰度对氮肥的反应不同，长期施用氮肥对AOB种群结构和丰度影响较大，取样时期对其影响较小，而长期施用氮肥对AOA丰度影响较小，对AOA种群结构影响较大。

参考文献