洱海是云南省第二大高原淡水湖泊，近年来，水质由Ⅱ～Ⅲ类降到Ⅲ～Ⅳ类，由中营养湖泊向富营养湖泊转变，水质呈日益下降趋势^[1]。其中，农田氮磷流失导致的面源污染是引起水体富营养化的重要影响因素^[2]。因此，减少农田氮素流失是防控洱海水体污染的关键。雷宝坤等^[3]和汤秋香等^[4] 在对洱海流域农作物种植情况、农田肥料投入、作物养分吸收、土壤养分残留等方面开展系统调查研究的基础上，通过土壤碳坝的空间效应和时间效应分析，提出碳氮共济效应，表明土壤高碳库的存在可以形成阻控氮素流失的碳坝，从而实现阻控氮素流失的面源污染。土壤微生物群落结构及其功能是影响该碳氮共济效应的重要驱动因素，但其过程及机制缺乏基于分子生态学层面的研究。

微生物参与了土壤碳氮素转化过程，不同功能的微生物种群通过竞争氧化还原化学反应底物而调节碳氮素转化与平衡^[5]。因此，微生物是土壤有机碳氮素转化的关键纽带，其通过合成参与碳氮转化过程的酶调节转化过程，各生理类群微生物在碳氮素的不同形态转化中发挥特定功能^[6]。微生物介导了碳素转化的碳固定（CO₂ 转化成有机物）、甲烷代谢（产甲烷和甲烷氧化）和碳降解（有机质分解）等重要过程^[7]和氮转化的固氮作用（氮还原成氨）、硝化作用（氨转化为硝酸盐）、反硝化作用（硝酸盐还原为氮）、厌氧氨氧化作用（氧化铵态氮为氮气）、氮同化还原作用（硝酸盐还原成氨）及异化还原作用和氨化作用6个有序的不同反应过程^[8]。土壤中的各种酶专一性地作用于其底物，活性强弱反映了与其相关的转化进程^[9]。其中，β-1，4-葡萄糖苷酶（GC） 和 β-1，4-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）是土壤碳氮素水解的重要功能酶，参与土壤中纤维素、几丁质和肽聚糖的降解，表征土壤碳氮循环的重要过程^[10-11]。土壤中不同的微生物种群在种群结构、空间分布和生理生态功能等方面具有不同的生态位^[12]，并且具有相似功能的种群组成特定的功能群落^[13]，基于生态系统中食物网相似的其它功能群落构成土壤微生物功能群落，共同推动着土壤中的碳氮转化^[8]。通过分子检测技术鉴定功能基因是掌握农田生态中碳氮循环过程的重要手段和方法，过去多年的研究揭示了参与碳氮循环微生物的多样性特征，编码特定功能酶的功能基因不断成功破译，极大地拓展了对碳氮循环功能微生物的认识^[14]。然而，尽管有关碳氮转化体系的框架及其部分子系统的机理与机制有相关研究的解释，但仍然存在一部分子系统由于机理机制探索存在争议而需要进一步研究。

在土壤微生物固碳以及与之共济的氮素转化作用过程中，碳素通过影响土壤微生物群落结构和功能变化而改变氮素动力学转化过程，土壤氮素则通过影响土壤微生物群落结构和功能变化而有效调节碳素转化和生态系统碳素平衡^[15]。在洱海流域稻油轮作农田设置长期定位试验，分析土壤微生物种群结构、丰度和功能，结合土壤理化性质和酶活性特征，解析土壤微生物群落结构和功能的分子生态学特征。该研究对于深入认识和理解区域农田生态系统中碳氮共济的关键过程及其驱动机制，实现对农田生态系统的优化管理和合理保护、维护区域生态安全和可持续利用等方面均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验地概况和试验设置

试验田位于洱海流域洱源县凤羽镇（99°57′E， 25°58′N），为北亚热带高原季风气候，海拔2099m，年平均气温13.90℃，年降水量745.00mm，土壤类型为水稻土。试验于2013年开始，设置有机碳源物料输入长期定位试验，典型的水稻-油菜水旱轮作种植模式，水稻种植时间为当年6月，收获时间为10月；油菜种植时间为当年11月，收获时间为次年5月。处理的重复设置、面积、施肥（品种、用量、时期等）和有机碳源物料（品种、用量、时期等）等试验内容与陈安强等^[16]的设置相同。本研究选取其中不施用有机肥和氮磷钾化肥（CK）处理和不施用有机肥单施用氮磷钾化肥（TF）处理为研究对象，考察长期施肥对土壤酶活性和微生物种群结构的影响。

1.2 土壤样品采集、处理

2017至2019年的每年5月，于油菜收获期按照常规取样法分别取0～20cm土层土样，每个小区沿对角线5点取样，然后混合均匀为1个样，挑除根系等杂质后，一部分土样过0.45mm筛后迅速放入做好标记的自封袋中，置于低温保温箱中，带回实验室后再分成2份，一份用于测定土壤酶活性，另一份于-80℃冰柜中预冷冻1h后再进行冷冻干燥，待充分干燥后置于-80℃冰柜妥善保存，以备后续DNA提取；另一部分土样进行自然风干，待充分干燥后置于室温妥善保存，以备后续理化性质分析。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤有机质和全氮含量测定

土壤有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定； 土壤全氮含量采用凯氏定氮法测定^[17]；根据土壤有机质和全氮含量，计算碳氮比。

1.3.2 土壤酶活性测定

土壤GC酶活性和NAG酶活性采用试剂盒（G0312W和G0321W，苏州格锐思生物科技有限公司生产）微板法测定，测定方法按照试剂盒说明书进行。待样品处理完成后，吸入96孔板并置于酶标仪上（Multiskan GO，ThermoFisher），GC酶活性在405nm波长下读取吸光值，NAG酶活性在415nm波长下读取吸光值，通过酶的回归方程和活力单位公式，计算酶活性大小，其中，GC活性[μg/（h·g）]=10.36×（ΔA-0.005）/W，NAG活性[μg/（h·g）]=10.43×（ΔA+0.0056）/W，ΔA=测定-对照，W为实际称取干土质量。

1.3.3 土壤DNA提取、细菌16S rRNA基因和真菌IT基因的高通量测序

采用OMEGA土壤总DNA提取试剂盒提取土壤微生物总DNA，提取方法参照操作说明书。每份土样3个重复，提取的DNA溶液经分光光度计（Nanodrop 2000，ThermoFisher）和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量、浓度和片段长度。 DNA送至上海派森诺生物科技股份有限公司，应用Illumina MiSeq平台对细菌16S rRNA基因的V4区（515F-806R）和真菌ITS1区（ITS5F-ITS1R） 基因进行测序。

1.4 数据分析

1.4.1 土壤微生物高通量测序数据统计分析

采用Illumina MiSeq平台双端（Paired-end）测序，测序原始数据以FASTQ格式保存。原始数据疑问序列采用QIIME软件（Quantitative Insights IntoMicrobial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org/） 识别，检查并剔除嵌合体序列，采用QIIME软件（v1.8.0， http：//qiime.org/）调用USEARCH（v5.2.236，http：//www.drive5.com/usearch/）处理，获得样本的有效序列^[18]。基于QIIME、UCLUST程序，选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，按97%的序列相似度进行归并和OTU划分，构建OTU在各样本中丰度的矩阵。根据OTU丰度矩阵，计算各样本（组）共有OTU的数量，计算Chao1丰富度估计指数和ACE指数，评价微生物群落丰富度；计算Shannon多样性指数和Simpson多样性指数，评价微生物群落的丰富度和均匀度。利用每个OTU的代表序列，基于QIIME软件，通过与对应数据库的模板序列相比对，获取每个OTU所对应的分类学信息。Greengenes数据库（Release13.8，http：//greengenes.secondgenome.com/）为细菌16S rRNA基因模板序列基因库^[19]，UNITE数据库（Release5.0， https：//unite.ut.ee/）为真菌ITS基因模板序列基因库^[20]。根据OTU划分和分类鉴定结果，统计每个样本在各分类水平组成。基于Galaxy在线分析平台（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/） 的LEfSe分析，查找在各分类水平具有显著性差异的物种。

1.4.2 微生物种群结构与土壤环境因子间的关系分析

测试数据经Excel2010软件整理；用DPS 7.05Duncan多重比较法检验处理间的差异性；用SPSS 18.0的Perason双变量相关分析法分析不同因子间的相关性；用Canoco 5.0Redundancy analysis（RDA） 法分析因子间的冗余关系。

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤碳氮素含量分析与比较

土壤碳氮素含量3年测试分析统计结果如表1所示，与空白不施化肥处理相比，施用化肥处理土壤有机质显著低于不施化肥处理，碳氮比差异不显著，而全氮含量则高于空白对照处理（P<0.05）。年度间各指标变化均呈相同的变化趋势。

2.2 不同处理土壤水解酶活性分析与比较

土壤水解酶活性测定统计结果如图1和2所示，空白不施化肥处理和施用化肥处理GC活性分别为268.19～279.32和269.75～271.18[μg/（h·g）]，处理间差异不显著（P ≥ 0.05）。NAG活性分别为44.96～48.78和63.16～64.58[μg/（h·g）]，施用化肥处理显著提高了土壤NAG酶活性（P< 0.05），分别提高了22.76%、28.99%和29.64%；年度间酶活性变化表现出逐渐增加的趋势。

注：数据为3次重复的平均值，括号内数据为标准差；不同小写英文字母表示在0.05水平下的差异显著。下同。

注：柱上字母不同表示处理间差异显著。下同。

酶活性与土壤碳氮素相关性的Pearson分析结果如表2所示，GC活性与土壤有机质含量间相关性由显著（P<0.05）向不显著水平（P ≥ 0.05）转化，由正相关关系向负相关关系转变；与土壤全氮含量间相关性不显著（P ≥ 0.05），且相关关系由正相关关系向负相关关系转变；与碳氮比间相关性由显著（P<0.05）向不显著水平（P ≥ 0.05）转变，呈正相关关系。

土壤NAG活性与土壤有机质含量间相关性不显著（P ≥ 0.05），呈负相关关系；与全氮含量间相关性由不显著性（P ≥ 0.05）向显著性水平（P<0.05）转变，呈正相关关系；与碳氮比间相关性不显著（P ≥ 0.05），呈负相关关系。

注：* 表示相关性显著（P<0.05）。下同。

2.3 不同处理土壤微生物菌群多样性分析与比较

土壤细菌16S rRNA基因和真菌ITS1基因高通量测序数据统计分析结果如表3所示。原始数据经过整理、过滤及质量评估，各处理得到细菌优质序列条数为46464和44738，得到真菌优质序列条数为41459和45526，处理间优质序列数量差异均不显著（P ≥ 0.05）。基于≥ 97%的相似度水平，通过OTU划分和分类地位鉴定，各处理得到细菌OTUs数量为15294和15266，得到真菌OTUs数量为2621和3003，处理间OTUs数量差异均不显著（P ≥ 0.05）。处理间的ACE指数、Chao 1指数、Simpson指数和Shannon指数差异均不显著（P ≥ 0.05）。

基于OTUs的不同处理土壤细菌群落和真菌群落的主坐标分析（PCoA）结果如图3、图4所示。土壤细菌群落主成分1（PC1）与主成分2（PC2）分别解释变量方差的38.88%、20.65%，两者累计贡献率达59.53%；土壤真菌群落主成分1（PC1）与主成分2（PC2）分别解释变量方差的39.91%、24.37%，两者累计贡献率达64.28%。基于OTUs丰度数据可以把同一处理样点相对聚集，不同处理样点相对分开，不同处理菌群群落组成存在一定程度差异。

2.4 不同处理土壤细菌种群组成分析

土壤细菌门分类水平种群结构组成如表4所示。根据物种注释结果，不同处理在细菌门的分类水平上检测到的前5个优势细菌种群为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes），占总原核微生物群落丰度的91.54%～93.10%。与不施化肥处理相比，施用化肥处理中细菌Proteobacteria和Acidobacteria的种群相对丰度降低，分别降低3.11%和9.25%；Chloroflexi、Actinobacteria和Gemmatimonadetes的种群相对丰度则提高，分别提高7.46%、6.84%和19.48%。

基于LEfSe分析，查找各处理在细菌属分类水平上具有显著性差异的土壤微生物物种，结果如图5所示。其中，不施用化肥处理中有13个属的细菌种群存在显著性差异，施用化肥处理中则仅有11个属的细菌种群存在显著性差异，表明施用化肥导致部分细菌显著差异性物种种群丰度发生变化。

2.5 不同处理土壤真菌种群组成分析

土壤真菌门分类水平种群结构组成如表5所示。根据物种注释结果，不同处理在真菌门的分类水平上检测到的前3个优势真菌种群为：子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota） 和接合菌门（Zygomycota），占总真核微生物群落丰度的93.26%～96.63%。与不施化肥处理相比，施用化肥处理中，呈现真菌3个门分类水平种群丰度减少的趋势，分别减少2.09%、8.58%和8.79%。

基于LEfSe分析，查找各处理真菌门到属分类水平上具有显著差异的土壤微生物物种，结果如图6所示。其中，不施化肥处理中有5个真菌种群存在显著差异，施用化肥处理中12个真菌种群存在显著差异，表明施用化肥导致一些部分真菌显著差异性物种种群丰度发生变化。

2.6 土壤微生物种群与土壤环境因子相关性的Pearson分析

土壤微生物种群丰度与土壤环境因子间的Pearson分析结果如表6所示，细菌种群中的Chloroflexi相对丰度与全氮含量相关性显著（P<0.05），呈正相关关系；真菌种群中的Ascomycota相对丰度与有机质含量相关性显著（P<0.05），呈正相关关系；其它细菌种群丰度和真菌种群丰度与环境因子间，有些种群呈正相关关系，有些种群呈负相关关系，但相关性均不显著（P ≥ 0.05）。

2.7 土壤微生物种群、土壤酶活性与土壤环境因子相关性RDA分析

以土壤微生物门分类水平的种群相对丰度和酶活性为响应变量，土壤环境因子为解释变量，分析种群相对丰度、酶活性与土壤环境因子间的冗余关系，结果如表7和图7所示。对于土壤微生物种群相对丰度和酶活性的影响解释度而言，第1轴解释了69.10%，第2轴解释了19.09%，两轴共解释了种群相对丰度变化的88.19%，能够很好地反映种群相对丰度和酶活性变化与土壤环境因子间的关系。土壤碳氮比、全氮和有机质3个环境因子对酶活性和微生物种群相对丰度影响的解释度分别为68.20%、 20.00%和0.10%。其中，土壤碳氮比与GC酶活性呈正相关，与NAG酶活性呈负相关，与Ascomycota、 Zygomycota、Basidiomycota、Acidobacteria、Proteobacteria和Chloroflexi等微生物种群相对丰度呈正相关，与Actinobacteria和Gemmatimonadetes种群相对丰度呈负相关。

3 讨论

3.1 洱海流域稻油轮作农田土壤碳氮变化特征

氮肥对于保障作物稳产和高产发挥着重要的作用，但过量施用反而引起利用率低和由于流失导致的环境污染等问题，土壤氮素的合理管理是作物获得高产的有效措施^[21-22]。土壤碳氮间存在着相互依存和相互制约的共济关系，利用碳素管理可以协调氮素高效利用和降低氮素流失^[3]。土壤产生氮素净矿化的碳氮比临界点为25，当碳氮比大于25时，土壤将出现氮素的净固持；当土壤碳氮比小于25时，土壤将出现显著的氮素矿化作用，可以据此对土壤氮损失做出预测^[23]。在洱海流域稻油轮作农田，不施肥空白处理土壤有机质和全氮含量均呈逐年下降的趋势，但差异未达显著水平（P ≥ 0.05），碳氮比变化不明显，表明较高有机质和全氮含量在维持碳氮比稳定性中具有重要作用。施用化肥处理的土壤有机质和碳氮比则显著降低，全氮含量则显著上升（P<0.05），进一步从土壤碳氮素间的Pearson相关性分析结果来看，土壤有机质和全氮含量由正相关关系向负相关关系转变，土壤全氮含量与碳氮比呈负相关关系，表明氮素的持续施用，会促进土壤有机质的耗减和土壤碳氮比持续下降。试验区土壤碳氮比为9.48～10.33，与全国的7～13相当^[24]。为调节碳氮比在适宜范围，同时有效减缓土壤有机质的耗减，施用适宜碳氮比的有机碳源配施氮肥是较为合理的土壤保育技术措施。

3.2 洱海流域稻油轮作农田土壤碳氮水解酶活性变化特征

土壤酶是由土壤中植物、动物和微生物分泌介导土壤碳氮素转化的重要生理生化物质，酶活性影响微生物对底物的利用从而改变土壤养分转化速率，其活性强弱是评价土壤生物化学过程强度及土壤肥力的指标之一^[25]。土壤碳氮素组分和含量决定微生物对底物的利用模式，从而影响土壤酶活性。掌握农田施肥与土壤酶活性的关系，可为农田土壤碳氮管理提供支撑^[26]。本研究选用GC和NAG为靶标，研究洱海流域稻油轮作农田有机质和全氮含量与土壤酶活性之间的关系。从研究结果看，不施肥空白处理2种酶活性呈逐渐下降的趋势，但差异未达显著水平。结合土壤碳氮素含量变化特征分析来看，土壤有机质和全氮含量呈下降趋势，但碳氮比变化不显著，表明碳氮比是维持酶活性的重要环境因子。在此基础上，化肥施用则显著提高了NAG的活性，而对GC活性的影响不显著。通过酶活性与土壤环境因子间的Pearson相关性分析验证，NAG的活性与全氮含量间相关性由不显著（P ≥ 0.05）向显著水平（P<0.05）转变，呈正相关关系；GC的活性与土壤全氮含量相关性不显著，且相关性由正相关关系向负相关关系转变；随着土壤全氮含量的增加，NAG的活性逐渐增强，GC的活性逐渐降低，NAG的活性与碳氮比相关性不显著（P ≥ 0.05），呈负相关关系，GC的活性与碳氮比相关性由显著（P<0.05）向不显著水平（P ≥ 0.05）转变，但呈正相关关系。相关研究表明，土壤中各元素之间存在耦合关系，高含量元素促进胞外酶对另一元素的分解利用^[27]。氮输入提高碳分解酶活性，促进有机养分的分解或加速活性有机碳的溶解，表现出有机碳含量下降^[28]。氮素输入量、时间长短和土壤本底值是影响酶活性进而影响养分循环的重要因素^[29]。本试验结果也表明，长期施用化肥处理的土壤有机质、碳氮比显著降低，表明氮肥施用提高与土壤碳相关的水解酶活性，从而促进碳周转，加速有机质分解而呈下降趋势，同时说明氮素对NAG活性具有较大的促进作用，表明氮是洱海流域稻油轮作农田土壤酶活性的限制因素，根据不同土壤碳氮比，采用不同碳氮比的有机碳源物料和化肥组合，调节土壤GC和NAG的活性以及碳氮比。

3.3 洱海流域稻油轮作农田土壤微生物多样性特征

微生物是土壤碳氮素转化的纽带，其通过合成参与碳氮转化过程的酶而调节转化过程^[6，30]。在土壤微生物固碳以及与之共济的氮素转化作用过程中，碳素通过影响土壤微生物群落结构和功能变化而改变氮素动力学转化过程，土壤氮素则通过影响土壤微生物群落结构和功能变化而有效调节碳素转化和生态系统碳素平衡^[15]。前期研究结果表明，洱海流域典型稻油轮作农田土壤有机质和全氮含量丰富，有机质含量为40.0～70.0g/kg，平均含量56.3g/kg；全氮含量为2.0～4.5g/kg，平均含量3.3g/kg，碳氮比7～14^[31]。土壤微生物种群组成分析结果表明，土壤细菌在门分类水平上以Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria和Gemmatimonadetes 5个门为主要种群，真菌在门分类水平以Ascomycota、Basidiomycota和Zygomycota3个门为主要种群，各处理在门的分类上组成基本相似，平均相对丰度所占比例略有差异，但差异未达显著水平（P ≥ 0.05）。但对2个处理进行对比发现，与不施化肥处理相比，施用化肥处理中的2个门分类水平的细菌种群（Proteobacteria和Acidobacteria）的相对丰度降低，3个门分类水平的细菌种群（Chloroflexi、Actinobacteria和Gemmatimonadetes） 的相对丰度提高，而3个门分类水平的真菌种群丰度均呈降低趋势。进一步基于LEfSe分析，查找到处理间在属分类水平上具有显著差异的土壤微生物物种，结果也表明施用化肥导致细菌和真菌显著差异的物种数发生变化。进一步基于土壤环境因子与微生物种群间的Pearson相关性分析和冗余分析表明，不同的土壤环境因子对不同微生物种群丰度的影响不同。从总体变化趋势来看，微生物种群相对丰度差异不显著，维持在相对稳定的水平。综合土壤碳氮变化特征，表明土壤碳氮素是决定微生物多样性和功能多样性的重要因素，而微生物群落多样性和功能则是维持生态系统功能和稳定性的基础。

4 结论

在洱海流域稻油轮作农田，GC的活性与土壤有机质含量正相关，NAG的活性与土壤全氮含量正相关，土壤碳氮比是影响碳氮水解酶活性稳定的主要环境因子。土壤高碳、氮含量是维持洱海流域农田碳氮水解酶活性稳定的主要环境因子。

在洱海流域稻油轮作农田，土壤细菌以Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、 Actinobacteria和Gemmatimonadetes 5个门分类种群为主要种群，真菌以Ascomycota、Basidiomycota和Zygomycota3个门分类种群为主要种群，其种群多样性和丰度处理及年度间变化均不显著。不同的土壤环境因子对不同微生物种群丰度的影响不同，化肥处理显著差异的物种种群丰度发生变化，土壤高碳氮含量是影响洱海流域稻油轮作农田土壤微生物多样性的主要环境因子。

参考文献