腐植酸是脂肪族和芳香族有机高分子化合物的非均相混合物，含有丰富的含氧官能团。具有土壤改良和生态环境优化方面的性能。同时，它也能够为植物提供良好的生长环境。在农业生产上起到增产、增收，改善农产品品质等作用^[1-3]。可溶性腐植酸是衡量腐植酸肥料和腐植酸盐产品应用性能的主要质量指标^[4-6]。目前对可溶性腐植酸测定的方法主要有重量法、容量法等^[6-16]，本文采用分光光度法测定有机碳含量进而对可溶性腐植酸碳含量^[17]进行测定，并探讨了影响可溶性腐植酸含量测定的几个因素。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津）、 JE502分析天平、TDL-40B离心机（安亭科学）、硫酸、重铬酸钾、苯甲酸钠（化学试剂均采用分析纯）。

1.2 实验原理

用蒸馏水提取含矿物源腐植酸样品中的可溶性腐植酸，得到的提取液在酸性条件下沉淀，分离去除非腐植酸的可溶性物质。在高温和强酸的条件下，腐植酸中的有机碳成分被过量的重铬酸钾溶液和硫酸溶液氧化，使K₂Cr₂O₇ 中的Cr⁶⁺ 被还原成Cr³⁺，而Cr³⁺ 含量与腐植酸中有机碳含量呈正相关，在某一波长处测定吸光度，按照Cr³⁺ 的含量计算有机碳的含量。过程化学反应原理如下：

$\begin{array}{c}2{\mathrm{K}}_2{\mathrm{C}\mathrm{r}}_2{\mathrm{O}}_7+3C+8{\mathrm{H}}_2{\mathrm{S}\mathrm{O}}_4\to 2{\mathrm{K}}_2{\mathrm{S}\mathrm{O}}_4+2{\mathrm{C}\mathrm{r}}_2{\left({\mathrm{S}\mathrm{O}}_4\right)}_3+\\ 3{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2+8{\mathrm{H}}_{2}O\end{array}$

1.3 实验步骤

1.3.1 校准曲线的绘制

苯甲酸钠标准溶液的配制：称取105℃烘干2h的苯甲酸钠（C₆H₅CO₂Na，分析纯）8.5714g（准确至0.1mg），加水溶解后用水定容到1L。

分别用移液管移取苯甲酸钠标准溶液[c（C）=5.000g/L]0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL至50mL玻璃试管中，然后加入2.5、2.0、1.5、0.5、0mL水补至2.5mL，相应碳含量分别为0、2.5、5.0、7.5、 10.0、12.5mg。向试管中准确加入5mL重铬酸钾溶液[c（1/6K₂Cr₂O₇）=1mol/L]，然后沿管壁缓慢加入8mL硫酸，避免溅出，轻轻摇匀。将试管置于（100±2）℃恒温箱中，加热氧化90min后将试管取出，放入冷水中冷却至室温，将试管内液体全部转移至50mL容量瓶中，定容、摇匀。在590nm波长处测定吸光度值，以测定的吸光度值对有机碳含量绘制校准曲线。

1.3.2 试样提取

称取1g样品于300mL锥形瓶中，加入70mL蒸馏水，沸水浴中加热，冷却后离心分离，将离心后的上清液转移至250mL容量瓶中，用水分多次洗涤锥形瓶中残渣至离心管中，对沉淀物进行洗涤离心，至可溶物萃取率大于98%（固液体积比=1∶10，洗涤两次，每次洗涤要将沉淀物摇匀），合并上清液于250mL容量瓶中，加水定容，备用。吸取容量瓶中试样10mL（样品碳含量大于30%，可根据样品碳含量适当减少吸取量），用pH=0^[18]的硫酸溶液4mL酸化后离心，离心后的沉淀再用pH=1^[18]的硫酸溶液洗涤，保留沉淀物。

1.3.3 试样测定

根据1.3.1的操作步骤依次向1.3.2操作步骤提取出的沉淀物内准确加入5mL重铬酸钾溶液 [c（1/6K₂Cr₂O₇）=1mol/L]，然后沿管壁缓慢加入8mL硫酸，避免溅出，轻轻摇匀。将试管置于（100±2）℃恒温箱中，加热氧化90min后将试管取出，放入冷水中冷却至室温，将试管内液体全部转移至50mL容量瓶中，定容、摇匀。最后取定容液进行吸光度测定。同时做空白实验。

2 结果与分析

2.1 吸收波长的确定

苯甲酸钠标准溶液被过量的重铬酸钾溶液和硫酸溶液氧化后，对其进行400～800nm波长扫描，结果见图1。可以看出434和590nm处为吸光度峰值。其中434nm处是重铬酸钾溶液的Cr⁶⁺ 吸光度值^[19]，590nm处是苯甲酸钠溶液中有机碳与重铬酸钾发生氧化反应后生成的Cr³⁺ 的吸光度值^[19]，因此测试波长选择590nm。

2.2 称样量的确定

本实验考察了0.5、1.0、2.0、5.0g取样量的提取情况。取样量为0.5g时，由于取样量过小，样品代表性较差；取样量为2.0g时，根据实验方案进行验证，腐植酸含量较高的样品吸光度超出曲线范围较大；取样量为5.0g时，部分样品不能完全提取。因此本实验选择样品取样量为1.0g。结果见表1。

2.3 离心条件

实验选取同一种样品，在不同离心时间下进行提取，测定样品含量，离心10min与离心20、 30min的分离情况基本相同，已经满足分离条件，因此选择离心时间为10min。结果见表2。

本实验在样品沉淀过程中对玻璃离心管和塑料离心管进行了考察，在用塑料离心管进行绘制曲线的过程中发现曲线无法成线性，可能由于氧化过程中加入硫酸且在烘箱中以100℃加热90min，塑料离心管中的物质有溶出，因此实验采用玻璃离心管。

根据参考文献^[7，13]，用玻璃离心管离心选择3000～4000r/min的转速，实验过程选取了3000、 3500、4000r/min进行考察，发现3000r/min与3500、 4000r/min的分离情况基本相同，已经满足分离条件，因此选择离心转速为3000r/min。结果见表3。

2.4 重铬酸钾浓度的选择

实验选取了0.4、0.8、1.0mol/L重铬酸钾溶液浓度进行考察，在移取相同体积的重铬酸钾溶液条件下，0.4mol/L重铬酸钾溶液只能将标准曲线中含量为2.5、5.0mg的有机碳完全氧化，不能完全氧化7.5、10.0、12.5mg的有机碳。0.8mol/L重铬酸钾溶液可与含量为2.5、5.0、7.5、10.0mg的有机碳发生完全氧化反应，不能完全氧化12.5mg的有机碳。因此重铬酸钾溶液的浓度定为1.0mol/L。结果见图2。

2.5 氧化时间

实验选取30、60、90、120min为氧化时间进行考察，从不同氧化时间校准曲线对比可看出，30min氧化时间校准曲线，在7.5、10.0、12.5mg的有机碳未能反应完全，不能作为本实验氧化时间；60min氧化时间校准曲线，12.5mg的有机碳未能反应完全，不能作为本实验氧化时间；90和120min的氧化时间校准曲线，校准曲线各点都已反应完全，两条校准曲线的相关系数r分别为0.9995和0.9998，线性范围较好，选择90min作为校准曲线的氧化时间。结果见图3。

3 方法验证

3.1 校准曲线

按照1.3.1校准曲线的操作步骤，绘制和校准曲线如图4所示，校准曲线为y=0.0463x0.0004，相关系数为0.99995，符合实验要求。

3.2 方法检出限

按照1.3.3试样测定的操作步骤，做了7个空白实验，以MDL=3.143×S^[20]（MDL为方法检出限，S为标准偏差）计算出MDL。结果如表4所示，MDL为4.27%。

3.3 精密度

按照1.3.3试样测定的操作步骤，做了18个实验，分别配制3个不同浓度的含量1样品、含量2样品及含量3样品，做6次平行实验得到精密度，结果如表5所示，3个不同含量样品的相对标准偏差分别是11.6%、8.3%、2.1%。

3.4 回收率

按照1.3.3试样测定的操作步骤，依旧做了18个实验，分别在样品中加入一定量标准溶液，并配制成3个不同浓度、各6个样品，结果如表6所示，3个不同加标含量样品的加标回收率分别是90%、106%、102%。

3.5 数据比对

将本方法与国标GB/T35107-2017法进行比对，测定可溶性腐植酸碳含量，从两种方法数据结果看，两组数据基本相同，说明本实验方法数据可靠，但相对国标法测定数值较高，分析其原因，可能是离心分离较过滤分离损失更小，且仪器分析的灵敏度更高，人为干预因素降低造成的，结果见表7。

4 小结

本方法改进了国标方法中的分离方法，采用离心法代替过滤法，从而缩短提取分离的时间。与重量法和容量法相比，本方法因具备校准曲线和加标的质量控制手段，以及依靠仪器测试避免人为主观误差，从而具有更高的精密性和准确性。对于批量样品的测定在保证准确度的情况下大大提高了工作效率。

参考文献