近年来化肥和农药的大量使用，导致了一系列的土壤问题^[1]，例如土壤盐渍化、酸化及板结现象，这些问题不仅破坏了土壤自身的功能性质，也限制了农作物的正常生长，影响其产品的产量及质量。近年来，为了解决化肥和农药带来的负面影响，生物有机肥的使用日益广泛，该类肥料具有一定改良土壤团粒结构和增加微生物群落的作用^[2]。

生物有机肥的制备主要通过固体废弃物发酵产生，这不仅解决了固体废弃物资源化再利用的问题，也很好地降低了化学肥料的使用。我国农业废弃物以年均5%～10%的速度不断增加^[3]，成为了制备生物有机肥的重要来源之一。目前针对生物有机肥的研究主要是固体废弃物制备生物有机肥的可行性研究和生物有机肥对土壤肥力及农作物产量影响的研究。邓干然等^[4]利用提取纤维后的新鲜菠萝叶渣为主料，添加鸡粪、木糠和过磷酸钙等辅料生产生物有机肥。结果表明，利用菠萝叶渣生产生物有机肥，可提高蔬菜产量和品质。曾振基等^[5]利用当地食用菌菌糠、羊粪、烟草废料生产有机肥料，产品的有机质含量达到54%、全氮含量2.2%、全磷含量2.22%、全钾含量4.92%、总养分含量9.34%。臧文霞^[6]通过添加有效微生物菌剂，通过优化最佳发酵工艺生产有机肥，证明了利用麻疯果油粕为原料制备生物有机肥的可行性。

生物有机肥中起着关键作用的是微生物和营养物质的数量。在生物有机肥保存过程中，由于温度、湿度等各种环境因素的影响，会出现有机肥品质下降的现象，主要是由于生物有机肥内部成分及环境发生变化，导致活菌数下降。因此可以通过添加外源物质对有机肥内的微生物进行保护。添加保护剂和助剂是国外微生物肥料生产中保密性最强的核心技术^[7]，而我国在这方面的研究报道甚少，值得深入研究探讨。熊竹^[8]、万刘静^[9]在研究化肥组分配伍时提出，外源添加尿素、磷酸氢二铵可以提高生物有机肥中的有效活菌数和酶活性。柠檬酸和乳酸是目前在食品加工中最常用的防腐保鲜剂，具有调节pH值、抑霉菌、延长保质期、提高产品质量等作用，然而，其对生物有机肥保存期的影响尚不清楚。因此，本文重点研究柠檬酸和乳酸添加对生物有机肥保存期间产品品质的影响，包括理化指标、生物性质、大分子有机物及小分子有机物含量的变化情况，以期为生物有机肥的保存提供可行方法，具有较为重要的实践价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试菌株来自本实验室保藏的菌株ZX6（芽孢杆菌）。将菌株ZX6在37℃下培养至对数期，测定活菌数，得到单一的微生物菌剂。以干重0.3%的活菌数将微生物菌剂加入从实验室获得的腐熟物料^[10]并混合均匀。

制备生物有机肥的原料为玉米秸秆（2mm）和污泥（来自食品工厂）^[10]。

所得腐熟物料的基本理化性质见表1。

实验所用腐熟物料的各项指标均符合国家生物有机肥的标准，可进行进一步实验。

1.2 实验设计

将单一的微生物菌剂ZX6以0.3%干重的活菌数加入腐熟物料中，并混合均匀，得到生物有机肥M。将混合均匀的M分成3份，1份作为空白CK，另外2份分别以1%干重的比例加入乳酸和柠檬酸，并混合均匀，分别记为LA、CA。

将CK、LA、CA等分为3份，放入编织袋并编号（例CK-1、CK-2、CK-3），用封口机进行密封保存。

将分装好的生物有机肥放于室内阴暗处的牛皮纸盒中，以便后续继续观察取样。

1.3 分析测试项目及方法

在整个实验过程中，每个月各取一次样，取样方法遵循生物有机肥取样标准，即在无菌条件下，同组样品以袋为单位，取相同质量并混合均匀。一部分新鲜样品进行实时测定，另一部分直接冰冻保存备用。所有分析测定工作均在采样后完成。

pH采用pH计测定^[11]；含水率采用含水率仪测定；生物有机肥采用HClO₇-H₂SO₄ 法消解后，总氮和总磷的含量分别用凯氏定氮法和钼酸铵分光光度法测定；可溶性多糖含量采用苯酚-硫酸法测定^[12]；可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定^[13]；脱氢酶（DHA）活性采用磷酸缓冲液-TTC比色法^[14] 测定；铵态氮和硝态氮含量分别采用Berthelot法^[15]和紫外分光光度法（NY/T1116-2014）测定；活菌数采用平板稀释涂布法测定；种子发芽指数（GI）采用国标GB/T23486-2009法测定；粪大肠菌群数和蛔虫卵死亡率按照生物有机肥（NY 884-2012）标准方法测定；氨基酸含量采用高效液相色谱法测定；挥发性有机酸 （VFA）含量采用气相色谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 物理指标及养分含量随保存时间的变化

2.1.1 物理指标的变化

国家生物有机肥的标准中，其物理指标主要包括pH、含水率、产品外观及气味。在产品监测的整个过程中，LA、CA处理组肥料的外观并没有发生显著变化，即在整个阶段呈现出松散、大小均匀的状态，有泥土气味，与大部分生物有机肥类似，符合国家标准。而CK处理组肥料在第5个月时出现了轻微腐败的气味，不合格。

在整个监测过程中，初始含水率均控制在20%左右，符合生物有机肥国家标准。随着监测时间的延长，3个处理组（CK、LA、CA）的含水率均呈现出下降趋势（图1），前3个月含水率下降速率较快（3个处理组分别下降了34%、38%、 28%），这主要是由于含水率较高，天气炎热（大于25℃）导致水分挥发，第3个月时含水率分别为12.92%、12.43%、13.92%。随着环境温度不断下降，水分损失速率降低，至监测结束时（第6个月），3个处理组的含水率分别为12.39%、12.21%、12.94%，均无显著性下降。

乳酸和柠檬酸是一种酸性物质，在食品行业得到广泛应用，可以通过螯合和调节pH的作用抑制酶活性，增加微生物的抗氧化能力，延长保存期。从图2可以看出，乳酸和柠檬酸的添加均降低了初始有机肥的pH，分别由7.65降低到7.44和7.13。在整个监测阶段，3个处理组的pH变化均符合国家生物有机肥标准（5.5～8.5）。第1个月结束时，LA和CA处理组的pH显著上升，这与挥发和被微生物利用，导致VFA含量显著下降有关 （表2）。当有机酸的产生速率低于其消耗速率时， pH呈下降趋势（各处理组1～3月）。3个月后，添加外源物质的LA、CA处理组中的柠檬酸、乳酸被逐渐分解，导致pH上升。在整个检测阶段，添加乳酸、柠檬酸处理组的pH变化范围较小，即分别能控制在7.16～7.49、7.04～7.29，其更有利于保证肥料内部微生物的生存环境，减少pH变化对微生物的影响。柠檬酸的添加对肥料pH表现出了最积极的缓冲作用。

2.1.2 养分含量变化

生物有机肥的养分含量包括氮、磷、钾，但最新国家生物有机肥标准NY 884-2012中并未规定生物有机肥中氮、磷、钾的含量，仅要求总有机质的含量大于40%（图3）。生物有机肥中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性的基础，而不像其它肥料以氮、磷、钾等主要元素的形式和含量为衡量标准。

但适当的氮、磷、钾含量也会提高生物有机肥在施用过程中的肥效。如表3所示，肥料中氮、磷（以P₂O₅ 计）的含量为3.67%～5.76%，钾（以K₂O计）的含量＞ 5%，明显高于肖瑛琼等^[16]制备的有机肥中氮、磷、钾的含量，分别高出0.60%、 1.60%、2.85%。最终产品的氮、磷养分含量均高于初始含量，且CA处理组与LA处理组相比，氮、磷养分含量均偏高，这可能是伴随有机质的降解，产生了浓缩效应。

2.2 生物指标及大分子有机物含量随保存时间的变化

2.2.1 生物指标变化

生物有机肥是我国新型肥料中技术含量最高的产品之一^[12]，其中起关键作用的主要为“活的 + 具有特殊功能的 + 微生物菌种”。我国生物有机肥标准（NY 884-2012） 中规定，生物有机肥中的有效活菌数（CFU）≥ 0.2亿CFU/g，且在保存期的最后一天必须达到这个数值。在投加液态菌剂ZX6 1d后，3个处理组的活菌数比原始物料（42亿CFU/g） 分别提高了373.80%、180.95%、 252.38%，其明显高于杨新等^[17]制备的生物有机肥的有效活菌数（85.32亿CFU/g）。这可能是投加的外源液态菌剂丰富了腐熟物料内的微生物种类和数量。在整个生物有机肥的监测过程中，3个处理组的活菌数均呈现出先增加后降低的趋势 （图4）。在监测的前3个月，CK、LA和CA处理组的活菌数不断上升，并于第3个月达到峰值，分别为9.3×10¹¹、1.38×10¹² 和1.80×10¹² CFU/g。这是因为液态菌剂ZX6中所含微生物是从原堆肥体系筛选出的有利于纤维素降解的特殊优势菌种，且其添加提高了有机肥水分和营养物质的含量，有利于微生物的生长增殖和有机质的降解。 3个月后由于肥料含水率较低，且易降解物质消耗殆尽，微生物大量死亡，呈现出不断下降的趋势。第6个月时，CK与LA、CA处理组的活菌数分别为0.001亿、0.6亿、0.8亿CFU/g，此时CK组的活菌数已小于我国生物有机肥中活菌数0.2亿CFU/g的标准，已不合格，但LA、CA处理组的活菌数依然达标。

乳酸、柠檬酸的添加一方面减小了保存期间pH的变化幅度及对微生物的损害，另一方面添加的外源物质属于小分子有机物，容易被微生物快速利用，可以在一定程度上提高有机肥的有效活菌数并可延长其保质期。与添加乳酸相比，柠檬酸的添加更能在一定程度上提高生物有机肥M的质量，CA处理组在监控期间整体有效活菌数大于LA处理组，第3个月时达到最高活菌数，比LA处理组高30.43%，第6个月时有效活菌数比LA处理组高出33.33%。

生化反应的实质是微生物在一系列酶的催化下进行的氧化还原反应。参与生物氧化还原的重要酶有氧化酶和脱氢酶（DHA），其中DHA尤为重要。 DHA是指一类能激活被氧化有机化合物的氢原子，并将其转移到特定的受氢体，催化物质（如糖类、有机酸、氨基酸）进行氧化还原反应的酶。DHA含量的高低与微生物的数量及活性密切相关。生物有机肥的DHA活性的变化如图5所示。在整个阶段，3个处理组的DHA含量均呈现先上升再下降最后趋于平缓的趋势，这与整个过程中活菌数的变化趋势相类似，随着活菌数的变化，DHA的含量也随之变化。最后由于含水率过低，微生物数量剧减，因此微生物活动受到了抑制，其DHA活性保持在一个水平不变。且在整个过程中，外源物质的添加抑制了酶活性，使LA、CA处理组酶活性的波动范围明显小于CK处理组。

2.2.2 大分子有机物含量变化

生物有机肥中含有功能菌和有机质，适量的有机质含量能改良土壤并促进被土壤固定养分的释放。若生物有机肥中的有机质含量过高，则说明其中的腐殖质含量过低，且施用到农业上会造成作物烧根、资源浪费的问题。若生物有机肥中的有机质含量过低，则会减弱其作用。因此，国家生物有机肥料中规定，生物有机肥中的有机质含量应大于40%。

国家生物有机肥规定的有机质含量大于40%是指有机质中的有机碳含量大于40%。整个监控过程中生物有机肥的有机质含量变化如图4。3个处理组的有机质含量均呈现出先下降后趋于平缓的趋势。前期（前3个月）由于微生物数量和酶活性均较高，肥料中的有机质被微生物大量利用，分别降解了5.55%、6.91%、9.92%。第6个月时，3个处理组的有机质含量分别为46.36%、 45.56%、43.43%，这与肖瑛琼等^[16] 制备的新鲜生物有机肥中有机物平均含量为45.62%相差不大。

3 个处理组的有机质含量与初始含量相比，分别下降了6.65%、8.16%、12.23%。说明外源物质的添加促进了微生物数量和酶活性增加，进而间接促进了有机肥料中的有机质的降解，且最终的有机碳含量均符合国家生物有机肥的标准。

由于制备生物有机肥的原始物料为秸秆和污泥堆肥处理后的腐熟产品，内含大量堆肥过程中未被降解的纤维素、木质素和半纤维素。一般来说，此类物质的降解发生在堆肥的高温期。从表4中可以看出，在整个监控过程中，3个处理组的纤维素和木质素并无显著变化，可能是由于纤维素和木质素不易降解。而易降解的半纤维素发生了不同程度的降解，3个处理组分别降解了3.14%、3.42%、 3.29%。因此，外源物质的添加对生物有机肥纤维素、半纤维素、木质素的降解并未显示出明显的积极作用。

2.2.3 无害化指标的变化

种子发芽指数（GI）是衡量生物有机肥是否对作物具有毒害作用的重要指标。一般来说，GI大于80%，则认为达到腐熟且对作物无毒害作用。 LA、CA处理组在整个监控阶段GI均大于80%（第6个月时GI分别为84.16%、86.93%），而对照组CK的GI第5个月时低于80%，为75.58%，第6个月时为65.52%，即CK组在第5个月时已不达标（图6）。

此外，病原生物（大肠杆菌、蛔虫卵死亡率） 也是生物有机肥质量的衡量指标。在整个阶段，3个处理组的大肠杆菌、蛔虫卵死亡率在6个月内均达标, 即大肠杆菌小于100个，蛔虫卵死亡率大于95%。

因此说明，乳酸、柠檬酸的添加对生物有机肥保质期的延长有积极作用。且与LA处理相比，CA处理更能减缓生物有机肥的变质。

2.3 小分子有机物含量随保存时间的变化

2.3.1 可溶多糖、蛋白含量的变化

单糖、双糖、多糖是生物有机肥中较为常见的小分子有机物，易于被微生物利用。在生物有机肥的检测过程中，并未检测出单糖、双糖含量的存在 （低于检测线）。在整个监控阶段生物有机肥的可溶多糖含量变化如图7，在前两个月，生物有机肥的可溶多糖含量保持在一个相对水平不变，这可能是制备生物有机肥M所用的腐熟物料中残存堆肥过程中高温阶段结构被破坏的木质纤维素，其水解产生的多糖含量与微生物利用小分子多糖的速率保持平衡。当消耗速率大于产生速率时，多糖含量不断下降（如第2～4月份），第4个月时3个处理组的多糖含量分别为7.34、7.65、7.71mg/g，此后由于生物有机肥的环境不适宜微生物生存，导致微生物活性低，可溶多糖含量低水平保持不变。

蛋白质是组成微生物细胞的重要物质之一，也是微生物降解有机物的重要“工具”。生物有机肥的可溶蛋白含量在一定程度上表示了有机肥内整体酶活性的变化，呈现先上升后下降再趋于平衡的趋势 （图8），与生物有机肥中DHA、活菌数的变化趋势一致。前期由于微生物活性不断上升，产生的酶含量越多，可溶蛋白含量越高。达到峰值时，3个处理组的可溶蛋白含量分别为4.05、4.39、4.48mg/g。而后随着微生物数量下降，可利用的营养耗尽，酶活性不断下降，即可溶蛋白含量下降。第4个月后，由于微生物所处的环境不再适应其代谢活动，其可溶蛋白也保持在一个水平不变。与CK相比，添加外源物质的处理组LA、CA的可溶蛋白含量偏高，可能是由于乳酸、柠檬酸部分螯合了生物有机肥的可溶蛋白。

2.3.2 酸性有机化合物的变化

挥发性脂肪酸（VFA）是具有1～6个碳原子碳链的有机酸，包括乙酸、丙酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、正丁酸等。VFA的相对分子质量较小，容易被微生物快速利用。在整个监控阶段生物有机肥的VFA含量整体上呈现下降的趋势 （ 表2）。3个处理组在监控第1个月结束时，挥发性有机酸分别下降了48.37%、57.58%、 66.76%，这可能是由于VFA属于易挥发的有机酸，且微生物利用简单的有机酸作为碳源生长繁殖。而后可能由于微生物利用有机酸的速率大于其分解有机质产生的有机酸速率，导致有机酸含量不断下降，最终低于检测限。乳酸、柠檬酸的添加在初始阶段可能改变了生物有机肥的pH，促进了生物有机肥内有机酸根离子的解离平衡，进而增加了挥发性有机酸的含量。

氨基酸作为一种小分子的有机物添加剂存在生物有机肥中，其可促进土壤中微生物的生长和繁殖，并直接被作物吸收利用。在整个监控阶段，生物有机肥中的氨基酸含量呈现出了不断缓慢上升的趋势（表2），由于氨基酸是构成蛋白质的基本单位，因此氨基酸与蛋白含量的变化（表2）趋势一致。与CK相比，外源物质的添加对生物有机肥中的氨基酸含量产生了积极作用，且CA处理组的氨基酸含量较高于LA，说明柠檬酸的添加更能提高生物有机肥的产品质量。

3 结论

在产品的保存期间，LA、CA处理组的生物有机肥外观均呈现出松散、无显著机械杂质，大小均匀的状态，气味为泥土气味，符合国家标准。pH、含水率均符合国家生物有机肥（pH在5.5～8.5之间，含水率小于25%）的范围要求。

3 个处理组的养分含量随着有机质的降解出现浓缩效应，使最终单位质量的养分含量上升，最终总养分含量＞ 5%；且有机质、粪大肠杆菌数、蛔虫卵死亡率等无害化指标在6 个月内均符合国家标准。

活菌数作为生物有机肥最重要的指标，LA、 CA处理组在第6个月结束时的活菌数分别为0.6亿、0.8亿CFU/g，均符合国家生物有机肥中活菌数大于0.2亿CFU/g的标准。但此时CK组的活菌数为0.001亿CFU/g，已不合格。

与CK处理组相比，添加乳酸和柠檬酸均有利于保存期间生物有机肥品质的提高，一是其本身是一种酸性物质，可通过螯合和调节pH的作用抑制酶活性，增加微生物的抗氧化能力，延长保存期； 二是可将pH控制在相对稳定的范围内，减少pH对微生物的影响，利于其中的微生物利用底物增长繁殖，增加其有效活菌数；三是添加的外源物质属于小分子有机物，一部分容易被微生物快速利用，提高了有机肥中的活菌数。

乳酸和柠檬酸的添加在生物有机肥中会产生一定的积极作用，但与乳酸相比，添加柠檬酸时，生物有机肥的有效活菌数、氮磷养分含量及小分子有机物氨基酸的含量也较高，分别为0.8亿CFU/g、 5.75mg/g、128.95mg/g，更有利于土壤肥力的提高和植物生长。

因此，乳酸和柠檬酸的添加在生物有机肥中产生一定的积极作用，为今后生物有机肥的制备提供参考。

参考文献