大蒜（Allium sativum L.）系百合科葱属植物，不仅是具有丰富营养的调味品，而且还具备区别于其它蔬菜的药用价值，如大蒜有杀菌防腐、抗癌、降低血脂、抗衰老等作用^[1]。据《本草纲目》中记载：“大蒜有归五脏、散痈肿、除风邪、杀毒气、下气消古、化肉”等功效^[2]，使大蒜成为少有的天然保健食品，因此常被人们誉为“天然抗生素”。在我国，大蒜年种植面积超过53万hm²，占全球大蒜种植面积50%以上，山东金乡及周边地区大蒜种植面积达20万hm²，为我国大蒜种植主产区^[3-5]。有研究报道大蒜连续多年种植会发生严重的连作障碍，表现为土壤病害的爆发性，主要为土壤真菌病害^[6-7]，金乡县及其周边地区多年连作大蒜，引起病害累积，土传病害越发严重，对大蒜的产量、质量造成重大危害。马龙传等^[8]对金乡大蒜的病害进行调查，发现大蒜根腐病是当地发生面积最大、危害最重的主要病害之一，严重时可导致减产30%以上。

大蒜根腐病在育苗期和大田生长期均可发病，发病轻的植株矮小、叶枯黄，发病重的植株根全部腐烂，整株枯萎，最后整株死亡^[9]。加强大蒜根腐病的田间症状识别、调查、病原鉴定，提出一套有效的防治策略，成为生产上亟待解决的问题。2008年，张博^[10] 对山东金乡县进行了大蒜根腐病的调查研究，发现腐霉（Pythium） 是山东省金乡县大蒜根腐病的病原菌；然而， 2017年张丽娟等^[11]发现新疆吉木萨尔地区大蒜根腐病主要由镰刀菌属的真菌引起。近10年鲜有关于我国大蒜主产区山东省及周边地区大蒜主要病害根腐病病原菌的研究，是否随着时间的变化土壤里导致根腐病的主要病原菌类群发生了改变呢？

本文针对山东金乡及周边地区大蒜根腐病病原菌连续开展3年的调查研究，通过病原真菌的分离、鉴定、柯赫氏回接验证、致病能力等方面的研究，揭示该地区大蒜根腐病的主要种类，为我国山东及周边地区大蒜主产区大蒜根腐病的科学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 感染大蒜根腐病的大蒜样品

本实验2016、2017、2018年连续3年对我国大蒜主产区山东省金乡县及其周边地区大蒜根腐病进行调查采样，从山东省济宁市金乡县、江苏省徐州市丰县和河北省永年县等地共采集大蒜根腐病样品51份。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：新鲜马铃薯400g，洗净后去皮、切块，加水煮沸至马铃薯变软，用纱布过滤，加葡萄糖40g、琼脂40g，用蒸馏水定容至2L溶解后分装，121℃湿热灭菌30min。

马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：方法同PDA培养基，仅不加琼脂。

1.3 供试大蒜品种

供试大蒜品种为金乡白皮蒜，由山东玛利亚农业机械有限公司提供。

1.4 大蒜根腐病潜在病原菌的分离纯化

1.4.1 大蒜根腐病样品表面消毒

取感染大蒜根腐病的完整根样品，溶于无菌磷酸缓冲盐溶液（PBS），用无菌镊子在灭菌烧杯内搅拌清洗干净后，转入50mL离心管，并加入PBS到没过样品。然后超声处理2遍，在超声第1遍后需要换新50mL离心管与PBS缓冲液。超声完后的大蒜根用无菌超纯水清洗2遍，用灭菌滤纸吸干表面水分备用。

1.4.2 大蒜根腐病潜在病原真菌的分离

取一条完整感病大蒜根，用无菌剪刀小心剪切，先去掉两头暴露部位，露出病变部位，选取病健交界处用无菌镊子平铺在PDA培养基上，每个平板放置3个样品，28℃培养箱中培养。长出真菌菌落后，取菌丝在显微镜下进行镜检，依据大型分生孢子的形状、大小和小型分生孢子的有无进行形态学的初步鉴定。将被认定是潜在致病菌的做好标记，以备纯化用。

1.4.3 潜在病原菌的纯化

用灭菌后镊子夹枪头挑取菌落边缘部分的新生菌丝转移到新的PDA平板，培养箱28℃恒温培养， 5d后拍照。待平板培养基纯化完成后，同时保存在PDA斜面培养基上。

1.5 大蒜根腐病潜在病原菌的初步鉴定

1.5.1 形态学鉴定

将分离获得的潜在病原菌在PDA上培养，于25℃恒温培养箱中培养5d，在此期间观察记录病原菌菌株的培养特征，包括菌落颜色、形态和菌落生长速度；制作切片，在光学显微镜下观察有无大、小型分生孢子和厚垣孢子及其大小、形状和着生方式；隔膜有无及其数目、产孢结构等。

1.5.2 分子生物学鉴定

将纯菌落菌丝刮入2mL离心管中，并将其置于-80℃超低温冰箱中30min以上。取出后每管放入1颗0.6mm的钢珠，使用细胞破碎仪以27f/s的频率高速振荡2min后，通过冻融细胞破碎仪以26f/s的频率振荡3min，然后按照真菌基因组提取试剂盒操作步骤依次进行，获得的DNA用超微量分光光度计测定浓度。以DNA为模板，采用病原菌引物ITS1/ITS4对ITS基因进行聚合酶链式反应（PCR）扩增^[12]。

PCR扩增：ITS-rDNA区段对于一部分真菌相对保守，不足以支持一些菌株的鉴定结果确定到种，因此一些种属需要多基因综合鉴定。如镰刀菌属，在鉴定时还需要的基因有：TEF、IGS、mtSSU、 RPB2、TUB 和 CAL^[13-14]；本试验中选择了除 ITS 外的 TEF 及 RPB2 两种基因进行鉴定。

PCR产物检测与测序：配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，在首位或末位胶孔中加入marker 1μL，其他胶孔中依次加入PCR产物2 μL，在120V电压下，电泳20min，并在凝胶成像系统下观察条带情况，进行图像采集。若样品扩增成功后，需将其送至公司（上海生工生物工程有限公司，以下简称生工）进行测序，待结果返回后在NCBI Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg） 上比对，下载模式菌株的相关序列，利用MEGA 7.0进行序列进化分析，使用邻接法（Neighbour-joining methods，N-J）构建系统发育树，分析其亲缘关系。将病原菌的亲缘关系分析结果与其形态特征、培养性状及致病性结合起来对其进行鉴定^[15]，确定菌株的分类地位。

1.6 大蒜根腐病病原菌H9 致病性研究

1.6.1 不同浓度大蒜根腐病病原菌H9 对大蒜幼苗感病能力研究

在装有600mL水的烧杯中，挑取无伤、生长情况良好、大小一致的健康大蒜经酒精表面杀菌后放在浮漂上，使根部没于培养液中。水位下降时，及时加水，使水量保持稳定。大蒜生长至幼苗期时，幼苗高5cm左右，接入大蒜根腐病病原菌（H9）孢子液进行实验处理，孢子液浓度为2×10⁹ cfu/mL，每组处理设置3个重复。每个重复烧杯中4株大蒜幼苗。处理情况如表1，每个实验3次重复。放置于温室进行培养，观察大蒜感病情况。培养40d后对实验组大蒜进行回收，带回实验室进行生长指标测定并对根茎部进行扫描观察。

1.6.2 柯赫氏法则验证

根据柯赫氏法则，对发病植株进行病原菌的再次分离。采根部发病部位1～2cm，经超声表面处理后，磨样进行稀释涂布，稀释浓度为1×10^-4 cfu/mL，并在28℃下培养48h后，挑取菌株进行 ITS、RPB2 和 TEF 基因序列扩增及测序，将测序获得的菌株序列在NCBI基因数据库对比，再与大蒜根腐病潜在病原菌H9的 ITS 序列比对。

2 结果与分析

2.1 大蒜根腐病潜在病原菌的分离归类

本课题组于2016、2017、2018年连续3年对我国大蒜主产区山东省金乡县及其周边地区大蒜根腐病进行调查采样，共采集大蒜根腐病样品51份。感染根腐病后的大蒜主要表现为根短、数量少，从根尖向根基部干瘪、中空、腐烂，有的根为红色，植株长势弱（图1）。通过对51份感病大蒜样品进行潜在病原菌的分离，共分离纯化出优势潜在病原真菌62株。对上述菌株进行显微镜检测，通过观察其产孢结构和菌丝形态进行初步归类，获得潜在病原菌为两大类，代表菌株分别为H5和H9。

其中，菌株H5属于茎点霉属（Setophoma），是首次在我国发现可以引起大蒜红根腐的病原菌，相关研究结果已发表^[16]，本论文重点研究H9这一类群。

2.2 大蒜根腐病潜在病原菌H9 的形态学研究

菌株H9在PDA平板上，于28℃培养箱中培养5d，其菌落平均生长速率为0.88cm/d，气生菌丝，菌丝较短、较密集，地毯状，前期灰白色，后期表面灰白色、底层灰粉色，菌落背面淡黄色 （图2A）。镜检发现菌株H9的菌丝透明、有隔，分生孢子数量密集，小型梭形，大型镰刀状，多隔，淡黄色（图2B）。

注：图A为菌株H9菌落的正面和背面图；图B为菌株H9的孢子形态图。

2.3 大蒜根腐病潜在病原菌H9 的分子生物学初步鉴定

采用真菌ITS1、ITS4通用引物对菌株H9的 ITS 基因进行PCR扩增，获得一条约500bp明亮清晰的片段。将PCR产物送至生工公司测序，返回结果在NCBI网站上逐一进行Blast比对，利用MEGA 7.0软件采用N-J法构建系统发育树（图3），结果显示，潜在病原菌H9属于镰刀菌属（Fusarium），与它 ITS 基因相似性最高的菌种是 Fusarium solani。

因为 ITS 基因在镰刀菌属的鉴定中具有局限性，因此对镰刀菌属菌株进行 RPB2、TEF 的多基因鉴定^[17-18]。以EF1和EF2为引物PCR扩增菌株H9的TEF1基因序列，获得长度为700bp的基因片段；以7cR和11aR为引物PCR扩增菌株H9的 RPB2 基因序列，获得长度为970bp的基因片段，并对相应基因片段进行测序。将生工返回的测序结果与 Fusarium MLST Database（http：//www.westerd ijkinstitute.nl/fusarium/）中的菌株进行比对并生成系统发育树（图4、5），结果均显示：菌株H9为 Fusarium solani species complex。

注：支持率<50的数值不显示。

综合 ITS、RPB2 和 TEF 基因的系统发育分析，大蒜根腐病潜在病原菌菌株H9鉴定为 Fusarium solani species complex。

2.4 柯赫氏验证实验

温室实验显示：接种菌株H9后，可以引起大蒜产生根腐病。对产生大蒜根腐病症状的大蒜根样品进行分离纯化以及 ITS、RPB2 和 TEF 基因序列扩增及测序，结果显示：新分离的优势菌株与接种菌株H9序列一致，该结果表明接种的菌株H9为大蒜根腐病病原菌。

2.5 大蒜根腐病病原菌 Fusarium solani H9 对大蒜幼苗致病能力研究

在温室条件下，开展不同浓度大蒜根腐病病原菌 Fusarium solani H9对大蒜幼苗的致病能力研究。实验设置7个处理，分别为清水对照（CK）、接菌5、10、20、50、100、150mL。接菌后40d收蒜，首先直接观察（图6A）显示：大蒜幼苗随着接菌大蒜根腐病原菌H9浓度的增加，幼苗地上部分生长受到抑制，浓度越高受抑制程度越严重；根部不仅表现为生长受抑制，还表现为根部干瘪、萎蔫。根部的这种情况，直接影响植物对营养物质的吸收，从而导致植物地上部分生长势弱。

注：图A：采用相机拍照，观察不同浓度菌株H9对大蒜幼苗的致病能力。图B：采用根茎部扫描，观察接种不同浓度菌株H9对大蒜幼苗的致病能力。

根茎部扫描仪观察每个处理的根部腐烂状态，当根腐病病原菌 Fusarium solani H9的接菌量达到100和150mL时，在扫描仪下根部呈现半透明状态，表明大蒜根部腐烂严重（图6B）。该结果表明，接种孢子浓度2×10⁹ cfu/mL、接菌量为100和150mL的病原菌H9时，可以导致大蒜幼苗严重的根腐病。

为了进一步明确大蒜根腐病病原菌H9对大蒜幼苗生长的影响，对接菌40d后采收大蒜样品的茎粗、株高、根长、株鲜重与根鲜重进行称重测量。结果显示：病原菌H9的接种浓度与大蒜的茎粗、株高、根长、株鲜重与根鲜重呈负相关。利用SPSS软件对数据进行统计分析，与不接菌的对照处理相比，当病原菌H9的接菌量达到100mL时，大蒜的株高、根长、株鲜重和根鲜重具有显著性差异；当病原菌H9的接菌量达到150mL时，检测大蒜的株高、根长、株鲜重和根鲜重具有显著性差异 （表2）。

注：同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05，n=10）。

3 结论与讨论

3.1 不同作物根腐病病原菌略有不同，镰刀菌属是作物根腐病的主要病原菌之一

根腐病作为我国农作物主要土传病害之一，目前国内已有多位学者对作物根腐病的病原菌开展研究。张博^[10]研究发现山东省主要大蒜根腐病病原菌为腐霉属（Pythium）；Chang等^[19]研究发现大豆根腐病主要病原菌为镰刀菌属，包括燕麦镰刀菌、镰刀菌、尖孢镰刀菌和增殖镰刀菌；张德珍等^[20]对小麦根腐病的185株分离株鉴定进行了研究，认为小麦根腐病主要是由麦根腐平脐蠕孢和镰孢属真菌侵染引起；陈应娥等^[21]发现引起饲用玉米根腐病的病原菌为茄病镰刀菌（Fusarium solani）。同时，由镰刀菌侵染引起的根腐病在番茄、辣椒、草莓已见报道^[22-25]。本研究发现，山东及周边地区大蒜主产区根腐病的主要病原菌之一是镰刀菌属的 Fusarium solani species complex H9，与已研究结果一致。

3.2 不同地区、不同年份大蒜根腐病的主要病原菌不同

张博^[10]在2008年对山东金乡、鱼台、菏泽等地进行调查，结果显示山东省主要大蒜根腐病病原菌为腐霉属（Pythium）。张丽娟等^[11]研究发现2013、2014、2015年新疆吉木萨尔地区大蒜根腐病主要是镰刀菌属，包括尖孢镰刀菌、层生镰刀菌、芳香镰刀菌等。但是，本研究于2016、2017、 2018年对山东金乡及周边地区大蒜根腐病调查研究显示，大蒜根腐病主要病原菌是镰刀菌属的 Fusarium solani species complex H9和本实验室已发表的在我国大蒜中首次发现的大蒜红根腐病病原菌 Setophoma terrestris^[16]。此外，杨峰等^[26]、李宪生等^[27]、李程玉^[28]认为大蒜根腐病属于细菌性病害，但是没有给出具体的研究材料、方法等，为综述性或新闻性报道，还有待进一步的研究确认。

综上推测，大蒜根腐病为复合型侵染，一般由多种病原菌引起；不同地区、不同年份的病原菌不同。因此，对作物主产区主要病害开展持续性的监测是必要的，如果主要病害发生改变，则需要改进相应的防护措施。

参考文献