枇杷内生木霉（Trichoderma sp.）P3.9菌株抗菌谱广^[1]，发酵工艺简单^[2-3]，能抑制枇杷根腐病菌^[4]，且能成功定殖于枇杷根际^[5]及其植株内^[6]，并能抑制枇杷根际土壤真菌^[7]及枇杷内生真菌^[8]，促进枇杷根际细菌生长^[9]。对枇杷植株有促生防病^[6]作用，具有广阔的开发应用前景。

随着高通量测序技术的发展^[10]，植物未培养病菌得以检测^[11]，明确了黄豆发霉优势病菌为 Fusarium moniliforme^[12]。黄连^[13]、枸杞^[14]、人参^[15-17]、丹参^[18]、重楼^[19]、茶^[20]等中药，榨菜^[21]、马铃薯^[22] 等蔬菜，草莓^[23]、脐橙^[24]、葡萄^[25]等果树根际土壤真菌多样性状况不断得到揭示，根腐病发病机理研究进一步深入。发现黄连根腐病株镰刀菌属含量显著高于健康植株^[13]，榨菜根肿病重病田土壤病原真菌数量增加^[21]。菌根菌 Glomus intraradices 内球囊霉^[26]处理，可以显著提高草莓根际土壤有益真菌，减少致病真菌种类。土壤中添加纳米银^[27]、生物炭^[22，28]、环保肥料^[29]等物质能改善植物根际土壤真菌群落结构。土壤微生物群落结构已成为判断土壤是否健康的生物指标^[30]。通过科学耕作，管理根际土壤微生物丰度来实现农业可持续发展，将是一种不错的选择^[31-32]。为进一步明确木霉P3.9菌株对枇杷根腐病的防病促生机理，本研究利用Illumina平台，对添加木霉P3.9菌株的处理和未添加对照枇杷根际土壤真菌进行高通量测序，分析其对枇杷根际真菌多样性及群落组成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

内生木霉P3.9菌株（Trichoderma atroviride）分离自枇杷主干韧皮部，保存于红河学院生命科学与技术学院植物病理学标本室。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL；pH 7.0。

在121℃高压灭菌30min。材料均购自农贸市场及试剂公司，试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌悬液接种于根际土壤的方法

将试管斜面保存的P3.9菌株移入PDA平板上活化，待菌落长满全皿后，用打孔器取5mm的菌饼，接入PDA平板中央。共培养5皿，置28℃培养5～7d；待菌落长满全皿后，收集所有培养物至粉碎机，并加入适量无菌水，充分打匀，制成菌悬液，调整孢子浓度至1×10⁶ cfu/mL备用。枇杷嫁接苗种植于营养袋（23cm×18cm）中，苗龄为1年时做接种试验。用上述木霉孢子悬浮液灌根，500mL/株，灌根等量清水做为对照，设10个重复，常规肥水管理。

1.2.2 枇杷根际土样采集

灌根木霉孢子悬浮液第10、20、30、40、50、 60、70、80、90d，用不锈钢环刀土钻，高0.5m，钻头直径38mm；处理和对照枇杷苗分别随机取3株，每株用5点取样法，采集深度5～20cm的根际土样，除去枯枝落叶，过0.075mm筛，用四分法充分混匀土样备用。每个处理取3个重复送检。

1.2.3 枇杷根际土壤总DNA提取

用MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒，按说明提取。

1.2.4 设计并合成引物接头

根据illumina Miseq高通量测序要求，进行双向测序，设计目标区域和带有“5′Miseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3′”的融合引物。

F5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT特异引物-3′；

R 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAAT TCCA-特异引物-3′。

1.2.5 PCR扩增和产物纯化定量及均一化

采用两步PCR扩增的方法，使用ABI9700PCR仪，一次PCR扩增体系：5xBuffer 10μL，dNTP（10mmol/L）1μL，Phusion超保真DNA聚合酶1U，F/R内侧引物（10 μmol/L）各1μL，模板5～50ng， ddH₂O补至50μL。一次PCR扩增程序：94℃ 2min预变性，94℃ 30s变性，50～56℃ 30s退火，72℃ 30s扩增，72℃ 5min延伸，10℃保温，25～35个循环。二次PCR扩增体系：5xBuffer 8μL，dNTP （10mmol/L）1μL，Phusion超保真DNA聚合酶0.8U，F/R外侧引物（10 μmol/L）各1μL，模板5uL，ddH₂O补至40μL。二次PCR扩增程序：94℃ 2min预变性，94℃ 30s变性，56℃ 30s退火， 72℃ 30s扩增，72℃ 5min延伸，10℃保温，8个循环。

将PCR扩增产物，于2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收（电泳槽保持干净，更换电泳缓冲液）。采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收。回收产物进行qPCR定量。采用FTC-3000TM real-time PCR仪对胶回收产物进行定量。

1.2.6 MiSeq高通量测序

54 个样品送微基生物科技（上海）有限公司测序。

1.2.7 数据统计

1.2.7.1Operational Taxonomic Units（OTU）聚类

使用USEARCH和mothur去除没有注释结果的OTU，去除注释结果不属于分析项目中的物种。

通过mothur（classify.seqs） 将OTU代表序列与数据库比对进行物种注释，置信度阈值设置为0.8。

1.2.7.2群落结构组成韦恩图

选用相似水平为97%的OTU样品表，用mothur和R语言作图。

1.2.7.3基于OTU的PCA分析

使用97%相似度的OTU，用mothur作图。

1.2.7.4群落结构组成柱状图

基于每个样品在每个OTU的丰度统计表，利用R语言工具作图。

1.2.7.5Anova_oneway组间差异比较

选择P<0.05的物种绘制柱形图，每个柱子为差异物种的相对丰度，误差线为标准误，其中 * 代表0.01<P<0.05， ** 代表0.001<P<0.01，*** 代表P<0.001。

2 结果与分析

2.1 引入木霉P3.9 菌株对枇杷根际土壤真菌多样性及群落丰度的影响

由表1可知，枇杷根际土壤中引入木霉P3.9菌株10～90d之间，根际土壤真菌ACE、Chao、香农和辛普森指数与不引入木霉P3.9菌株的对照差异不显著。说明木霉P3.9菌株不影响枇杷根际土壤真菌群落丰度和群落多样性。

2.2 引入木霉P3.9 菌株对枇杷根际土壤真菌群落数量的影响

由图1可知，枇杷根际引入木霉P3.9菌株处理与未引入对照共有的根际真菌有1304种，引入木霉P3.9菌株处理枇杷根际土壤独有的根际真菌有588种，未引入木霉对照独有的根际真菌有590种。说明枇杷根际引入木霉P3.9菌株能抑制土著真菌生长，导致枇杷根际真菌数量减少2种，因此枇杷根际真菌群落组成发生变化。

注：T代表引入木霉P3.9菌株的枇杷根际土壤，CK代表未引入对照土壤。

2.3 引入木霉P3.9 菌株对枇杷根际真菌多样性的持续影响

由图2可知，枇杷根际土壤引入木霉P3.9菌株之后，PC1值为42.05%，表示不同取样时间检测枇杷根际真菌群落差异可以解释全面分析结果的42.05%。在引入木霉P3.9菌株10～30d之间，引入木霉的处理和未引入对照在PCA坐标图上几乎聚集在一起；40～90d之间，引入木霉的处理和未引入对照在PCA坐标图上分散开来。说明引入木霉P3.9菌株30d之内，枇杷根际真菌群落几乎未发生改变；40～90d之间，枇杷根际真菌群落组成发生改变。

2.4 引入木霉P3.9 菌株对枇杷根际土壤真菌群落组成的影响

2.4.1 引入木霉P3.9 菌株对枇杷根际土壤真菌群落属分类地位的影响

由图3可知，枇杷根际土壤真菌注释到58个已知属，其中物种丰度占前15位的依次为 Fusarium、Mortierella、Trichoderma、Chaetomium、 Gibberella、Ilyonectria、Phoma、Monographella、Fusicolla、Cladosporium、Acremonium、Aspergillus、 Lasiodiplodia、Stephanonectria、Lectera。由图4可知，引入木霉P3.9菌株处理与未引入对照枇杷根际土壤真菌，在属分类水平上物种丰度差异显著。导致枇杷根际土壤真菌注释到的15个已知属物种丰度发生改变。物种丰度占前15位的优势属中，有5个属物种丰度发生改变，占比达1/3。其中优势属 Mortierella 极显著增加（0.001<P<0.01），优势属 Trichoderma 急剧增加（P<0.001），优势属 Phoma、Aspergillus 和 Lectera 显著降低（0.01<P< 0.05）。其余10个优势属物种丰度未发生变化。非优势属 Cladophialophora 显著增加（0.01<P<0.05）， 9个非优势属显著降低（0.01<P<0.05或0.001<P<0.01）。说明枇杷根际土壤引入木霉P3.9菌株导致根际真菌群落组成发生改变。木霉既能抑制多数非优势真菌属生长，也能抑制少数优势真菌属生长。同时，木霉还能促进少数优势真菌属和非优势真菌属增殖。

注：T1～T9分别表示引入木霉P3.9菌株处理第10、20、30、40、 50、60、70、80、90d根际土样；CK1～CK9分别表示不引入木霉P3.9菌株对照第10、20、30、40、50、60、70、80、90d根际土样； T1-1、T1-2、T1-3，T2-1、T2-2、T2-3······T9-1、T9-2、T9-3分别表示引入木霉P3.9菌株处理第10、20、30、40、50、60、70、80、 90d各自的3个重复；CK1-1、CK1-2、CK1-3，CK2-1、CK2-2、 CK2-3······CK9-1、CK9-2、CK9-3分别表示不引入木霉P3.9菌株对照第10、20、30、40、50、60、70、80、90d各自的3个重复。下同。

2.4.2 引入木霉P3.9 菌株对枇杷根际土壤真菌群落种分类地位的影响

由图5可知，枇杷根际土壤真菌注释到49个已知种，其中物种丰度占前20位的依次为 Fusarium brachygibbosum、Ilyonectria macrodidyma、Mortierella alpina、Phoma omnivirens、Monographella cucumerina、Fusicolla acetilerea、Acremonium antarcticum、Stephanonectria keithii、Penicillium neocrassum、Penicillium citrinum、Podospora communis、Sarocladium strictum、Purpureocillium lavendulum、Penicillium virgatum、Metacordyceps chlamydosporia、Mortierella exigua、Clonostachys rosea、Subulicystidium perlongisporum、Hyaloseta nolinae 和 Clonostachys miodochiali。由图6可知，引入木霉P3.9菌株处理与未引入对照枇杷根际土壤真菌，在种分类水平上差异显著，导致枇杷根际土壤真菌注释到的14个已知种物种丰度发生改变。物种丰度占前20位的优势种中，有4个种物种丰度发生改变，占比为1/5。其中优势种 Mortierellaalpina 和 Mortierellaexigua 显著增加（0.01<P<0.05），优势种 Phomaomnivirens 和 Podospora communis 显著降低（0.01<P<0.05），其余16个优势种物种丰度未发生变化。7个非优势种Mortierellaminutissima、Latoruacaligans、 Acremonium fusidioides、Acremonium guillematii、 Aspergillus proliferans、Leptodiscellachlamydospora、 Conocybeanthracophila 显著降低（0.01<P<0.05）， 3个非优势种 Cryptocossuspodzolicus、Penicillium menonorum 和 Olpitrichumsphaerosporum 极显著降低 （0.001<P<0.01）。说明枇杷根际土壤添加木霉P3.9菌株导致根际真菌群落组成发生改变。木霉既能促进少数优势真菌种增殖，也能抑制少数优势真菌种生长。同时，木霉抑制枇杷根际多数非优势真菌种的生长。

注：0.01<P<0.05显著性差异标注为 *，0.001<P<0.01显著性差异标注为 **，P<0.001显著性差异标注为 ***，T为处理，CK为对照。下同。

3 讨论

枇杷根际土壤引入木霉P3.9菌株对枇杷根际真菌多样性无不良影响，但对其真菌群落组成影响显著，导致根际真菌减少2个种。从属水平分析，被孢霉属 Mortierella、木霉属 Trichoderma、蜡蚧菌属 Lecanicillium 增加，裂壳属 Schizothecium、茎点霉属 Phoma、曲霉属 Aspergillus、Lectera、柄孢壳菌属 Podospora 减少； 从种水平分析，Mortierella alpina、Mortierella exigua、Penicillium decumbens和Lecanicillium primulinum 增加，Penicillium citrinum 和 Coprinus phaeopunctatus、Phoma omnivirens、 Acremonium fusidioides、Cryptocossus podzolicus、 Aspergillus proliferans、Leptodiscella chlamydospora 和 Penicillium menonorum 减少。据报道，大兴安岭地区土壤优势真菌为被孢霉属^[33]。被孢霉属^[34]真菌可以排斥和抑制其它土壤微生物^[35]，高山被孢霉 M.alpina 能产生倍半萜类化合物^[36]，具有抑菌作用。长期施有机肥，玉米根际土壤被孢霉属数量急剧增加^[37]，与本研究结果一致。被孢霉在土壤养分浓度提升过程中贡献最大，能产生抗生素，调控玉米根际激素水平，对玉米有促生防病作用^[37]。添加被孢霉能修复三七连作土壤真菌群落，预防三七根腐病^[38]。斜卧青霉菌 Penicillium decumbens^[39] 有溶磷作用，对玉米有促生作用。蜡蚧菌属大多为昆虫寄生真菌，能寄生于柑橘木虱^[40]，从而减轻柑橘黄龙病发生。说明引入木霉P3.9菌株能促使枇杷根际土壤有益真菌增加，增强枇杷根际土壤肥力及抑菌作用，对枇杷植株起到促生防病作用，此结论与笔者前期研究结果一致^[6]。茎点霉属 Phoma 真菌能引起核桃树腐烂病^[41]，葡萄茎枯病^[42]；曲霉属 Aspergillus 真菌能引起枣果^[43]、生菜^[44]腐烂病、烟叶霉变^[45]；Penicillium citrinum 能引起柑橘采后腐烂病^[46]，说明引入木霉P3.9菌株能促使枇杷根际土壤病原真菌减少。综上所述，木霉P3.9菌株对枇杷根际土壤真菌群落结构有改善作用，有益真菌数量增多，有害真菌数量减少，对连作枇杷根际土壤有潜在修复作用。

4 结论

枇杷根际引入木霉P3.9菌株不会改变枇杷根际土壤真菌群落多样性，改变了根际真菌群落组成。有益真菌物种丰度增加，有害真菌物种丰度减少，对枇杷连作根际土壤有潜在修复作用。

枇杷根际引入木霉P3.9菌株可以促进 Mortierella alpina 和 Mortierella exigua 生长，对枇杷根际土壤肥力有提升作用。

综上，枇杷内生木霉P3.9菌株对枇杷植株具有促生防病作用，应用前景广阔。

参考文献