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“微塑料”是指环境中存在的粒径小于5mm的塑料类污染物，包括碎片、纤维、颗粒、发泡、薄膜等不同形态[1]。由于微塑料化学性质稳定，在环境中不易分解而长时间存在，目前已经作为一种新型污染物受到越来越广泛的关注。土壤是环境中污染物的重要汇集地之一，微塑料颗粒可以通过农用薄膜、堆肥、污泥、灌溉用水、生活中的塑料产品、大气沉降等途径进入到土壤环境[2-3]。 Fuller等[4]通过对澳大利亚悉尼某工业区土壤调查发现工业区土壤微塑料含量高达6.7%。研究人员对瑞士洪泛平原地区土壤样品中的微塑料污染调查中发现其污染程度与当地人口密度有关，说明人类活动是造成土壤环境微塑料污染的原因之一[5]。不仅国外土壤中检测到了微塑料污染，我国土壤中也存在微塑料污染情况。对上海郊区20个菜地的表层土（0～3cm）和深层土（3～6cm）调查发现，浅层土壤和深层土壤中均检测到了以聚丙烯和聚乙烯为主要成分的微塑料[6]；在云南省西南滇池农田和河岸森林缓冲带的50个土壤样品中检测到含量为7100～42960个·kg-1（平均18760个·kg-1）的以聚乙烯和聚丙烯为主的微塑料污染物，其中高达95%的微塑料粒径范围在0.05～1mm[7]。由此可见，土壤微塑料污染问题已经不容忽视。
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地膜使用是农田土壤中微塑料的一个重要来源[2]。农业生产中，地膜覆盖可以增温保墒、维持土壤结构、抑制杂草、防病虫和自然灾害等，还可以实现反季节生产，极大地提高了农作物的生产水平和农民的收入[8-9]。但如果地膜回收不当，就会导致残膜在土壤中不断积累，最终分解为微塑料颗粒，对土壤的理化性质和生物多样性产生影响[10]。而土壤质量的高低直接决定了植物的生长状况，土壤中存在的微塑料对植物生长、种子发芽等会产生影响。研究表明，乙烯-乙酸乙烯酯共聚物（EVA）、线性低密度聚乙烯（LLDPE）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）3种微塑料在低中浓度 （< 500mg·L-1）时会抑制小麦种子发芽率，而LLDPE在10mg·L-1 时对小麦芽长有明显抑制作用[11]。廖苑辰等[12]以聚苯乙烯荧光微球（PS-MPS）为对象分别在水培和土培条件下研究其对小麦生长的影响。结果发现，在水培条件下，高浓度（200mg·L-1） 的PS-MPS对小麦的根、茎有明显抑制作用；土培条件下，PS-MPS在10mg·L-1 时对小麦生长影响最显著。因此，土壤中微塑料对作物生长的影响不容忽视。
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目前应用最广泛的地膜材料主要成分是聚乙烯和聚氯乙烯，具有难降解、韧性高、不透水等特点，在土壤中残留会对土壤质量及作物生长产生不良影响。长期残留的农膜还会进一步破碎为粒径更小的微塑料颗粒。然而，目前关于农膜源微塑料对作物生长影响的研究报道十分有限，其对作物的毒性效应尚不清楚，所以研究农膜源微塑料对作物的毒性效应对于全面认识土壤中微塑料的生态风险和发展绿色农业具有十分重要的意义。为此，选用大豆为供试植物，以聚乙烯微塑料为研究对象，通过室内盆栽试验研究施加不同粒径以及不同浓度微塑料对大豆生长的影响，以揭示土壤中微塑料对植物的毒性效应。
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1 材料与方法
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1.1 仪器与试剂
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1.1.1 主要仪器
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冷冻干燥机（ZCIENTZ-10ND，宁波），电子天平（CP224C，上海），台式低速离心机（SC-3612，安徽），干燥箱（UF260，北京），优普超纯水机（UPR-I-40L，成都），叶绿素测定仪 （SPAD-502Plus，日本），紫外-可见分光光度计 （SP-1920，上海），火焰光度计（M410，英国）。
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1.1.2 主要试剂
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聚乙烯微塑料购置于美国Thermo Fisher Scientific公司，粒径分别为500和1000 μm。其形貌如图1所示。
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图1 扫描电镜下不同粒径微塑料颗粒的形貌
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注：（a）粒径500 μm，（b）粒径1000 μm。
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试验中所用到的药品还包括牛血清蛋白、考马斯亮兰G-250、试亚铁灵、硫酸亚铁铵、酒石酸钠、奈氏试剂、钒钼酸铵试剂、2，6-二硝基酚指示剂、硝酸、盐酸、硫酸，乙醇、磷酸、过氧化氢，均为分析纯，购置于中国国药集团。
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1.2 试验方法
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1.2.1 土壤采集与处理
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土壤样品于2019年5月采集于内蒙古农业大学试验地，所采集土壤为未铺设过地膜样地的表层土壤（0～20cm），无微塑料颗粒检出。将采回的土壤样品去除植物根、大的石块等杂质，风干，过0.85mm筛。然后取直径为15cm的花盆，每盆装1000g土壤。分别向土壤中添加500和1000 μm 2种粒径的聚乙烯微塑料，浓度设置为1%和5%2个处理，同时设置不添加微塑料作为对照处理，每个处理3次重复。将微塑料与土壤充分混合均匀，使土壤状态尽可能接近常规大田。稳定15d后，一次性施入磷酸二氢钾和尿素作为基肥（控制土壤中氮磷钾的质量浓度比例为10∶8∶10），用去离子水浇灌，称重法使土壤水分含量达到田间持水量的15%～20%。
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1.2.2 盆栽试验
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大豆（中黄37）购置于内蒙古农牧科学研究院。选取均一饱满的大豆种子，用自来水和蒸馏水冲洗后，弃去浮于水面的种子，剩余种子经10%的H2O2 浸泡消毒15min后，用蒸馏水冲洗多次。将消毒后的种子置于蒸馏水中浸泡4～6h后用于试验。每盆播种10粒大豆种子，试验在控制环境的温室中进行，植物均随机摆放并每3d更换一次位置，白天光照14h，温度25℃，夜间黑暗10h，温度20℃，相对湿度60%～70%，Osram日光灯供应光照250 μmol·m-2·s-1，每天以称重法浇灌保证土壤湿度保持在田间持水量的60%左右。大豆生长45d后收获，连续种植两茬。
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1.2.3 样品处理与分析
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收获前测定植株的株高和叶片的叶绿素值。收获后，样品先用自来水冲洗，清除叶片上的粉尘和根部黏附的泥土，再用去离子水清洗两到三次，用滤纸擦干，然后将植物分为地上和地下两部分，备用。主要指标测定方法如下：
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（1）出苗率：试验45d收获大豆，计算出苗率。出苗率（%）=（出苗数/播种数）×100
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（2）株高：收获时，用直尺量取从植株基部到茎秆最高端的垂直高度，同时测定每个处理下5株幼苗的株高，取平均值。
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（3）鲜重：收获后，立即用蒸馏水洗净根际土，滤纸吸干表面水分后用天平称重。
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（4）叶绿素SPAD值：收获前，选取6～8片完整的新叶和老叶，去除叶片表面的灰尘等污染物，用SPAD-502型叶绿素计（Minolta，日本）在叶片距叶缘的2/3处测定，每个叶片测定3次，然后取SPAD平均值，最后对每个处理的叶片叶绿素SPAD值取平均值，进行统计分析。
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（5）可溶性蛋白质：考马斯亮蓝法[13]。
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（6）纤维素：硫酸亚铁铵滴定法[13]。
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（7）氮磷钾：H2SO4-H2O2 消煮-奈氏比色法、 H2SO4-H2O2 消煮-钒钼黄比色法、H2SO4-H2O2 消煮-火焰光度法[14]。
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1.3 数据分析
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试验数据均用平均值 ± 标准差表示，利用Excel 2010录入、整理，采用SAS 9.0进行单因子方差分析、Duncan多重比较，P<0.05时，表示处理组和对照组存在显著差异。利用Sigmaplot 12.5进行图表绘制。
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2 结果与分析
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2.1 聚乙烯微塑料对大豆生长的影响
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2.1.1 大豆出苗率的变化
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从图2可以看出，与对照相比，两茬大豆种植中除添加1%粒径500 μm的微塑料对出苗率有一定的促进作用（P> 0.05），其它的微塑料处理均表现出对大豆发芽的抑制作用。从两茬数据分析来看，添加5%粒径500 μm的微塑料大豆的出苗率分别比对照处理降低了35.89%、42.11%。第一茬中添加1%和5%粒径1000 μm的微塑料大豆的出苗率比对照分别降低了7.69%、14.10%，第二茬中添加1%和5%粒径1000 μm的微塑料大豆的出苗率比对照分别降低了35.09%、64.91%。由此可见，大颗粒微塑料对大豆出苗率的影响更显著，且随着添加浓度的增加对出苗率的抑制作用增强。出苗率是说明土壤中存在微塑料的情况下种子存活能力的重要指标，本试验研究结果表明，聚乙烯微塑料的存在会影响种子在土壤中的存活和萌发能力。
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图2 聚乙烯微塑料对大豆出苗率的影响
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注：图中不同字母表示不同处理之间差异显著（P<0.05）。下同。
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2.1.2 大豆鲜重和株高的变化
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表1 是添加不同微塑料对大豆的鲜重和株高的影响。从表1中可以看出，与对照相比，第一茬种植中添加微塑料均表现出对大豆鲜重和株高的抑制作用，且添加粒径500 μm的微塑料抑制作用最显著，添加5%粒径500 μm的微塑料处理中大豆鲜重比对照降低了28.94%（P<0.05），而添加1%粒径500 μm的微塑料使大豆株高比对照降低18.40%（P<0.05）。在第二茬种植中微塑料对大豆鲜重和株高则表现为促进作用，且随着添加浓度和粒径的增加，促进作用随之增加。其中添加5%粒径1000 μm的微塑料对二者的促进作用最显著，分别比对照增加了28.75%和50.76%。
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2.1.3 大豆叶绿素的变化
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图3 显示添加不同粒径、不同浓度的聚乙烯微塑料处理对大豆叶绿素SPAD值的影响。与对照相比，在第一茬大豆种植中添加微塑料对大豆叶片叶绿素SPAD值表现出一定抑制作用，而在第二茬大豆种植中添加微塑料则会使叶片叶绿素SPAD值有所增加，但影响并不显著。
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注：同列数字后不同字母表示不同处理组之间差异显著（P<0.05）。下同。
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图3 聚乙烯微塑料对大豆叶绿素SPAD值的影响
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2.2 聚乙烯微塑料对大豆品质的影响
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2.2.1 大豆地上部纤维素含量的变化
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由表2可知，与对照相比，添加微塑料会促进大豆地上部纤维素的含量。两茬种植中，添加1%粒径1000 μm的微塑料处理下大豆地上部纤维素含量比对照分别增加了82.11%、56.03%。同一粒径塑料颗粒，不同添加浓度处理之间没有明显的差异；但是在不同粒径之间，在低浓度（1%）处理下，两茬大豆种植中添加粒径500 μm的微塑料处理地上部纤维素含量分别是对照的2.10、1.69倍； 而添加粒径1000 μm的微塑料处理地上部纤维素含量分别是对照的1.82、1.56倍。由此可见，小粒径微塑料的添加对大豆地上部纤维素含量的促进效果强于大粒径。在高浓度处理下，微塑料添加对大豆地上部纤维素含量的影响表现出与低浓度处理下相似的变化规律，即添加小颗粒微塑料对大豆地上部纤维素含量的促进效果更显著。
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2.2.2 大豆地上部可溶性蛋白质含量的变化
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由图4可以看出，与对照相比，添加微塑料处理均会显著抑制植物体内可溶性蛋白质的生成，但是两茬种植中同一处理所表现出的抑制程度不同。在第一茬种植中，添加5%粒径500 μm的微塑料处理对大豆地上部可溶性蛋白质的抑制作用最大，其含量比对照降低了51.39%；而在第二茬种植中，添加1%粒径500 μm的微塑料处理下大豆地上部可溶性蛋白质含量比对照降低了61.67%，抑制作用最强。而大颗粒微塑料对大豆地上部可溶性蛋白质生成的抑制作用要弱于小颗粒微塑料。
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图4 聚乙烯微塑料对大豆地上部可溶性蛋白质的影响
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2.3 聚乙烯微塑料对大豆吸收累积养分的影响
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表3 显示添加微塑料对大豆吸收累积养分的影响。与对照相比，大豆中氮含量在添加高浓度 （5%）微塑料处理下均表现出抑制作用，第一茬种植中添加粒径500和1000 μm的微塑料处理对大豆吸收累积氮抑制率分别为19.90%、19.31%，第二茬种植中添加粒径500和1000 μm的微塑料处理对大豆吸收累积氮抑制率分别为16.82%、29.55%。低浓度（1%）微塑料处理下，大豆中氮含量与对照相比，变化不显著。
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对于大豆钾含量来说，与对照相比，第一茬种植中添加5%粒径500 μm、1%粒径1000 μm的微塑料提高大豆体内钾含量，分别增加了11.50%、11.06%； 而添加5%粒径1000 μm微塑料则表现出抑制作用，此时大豆体内钾含量比对照降低了3.10%。第二茬种植中，添加微塑料均会抑制大豆对钾的吸收累积。其中大粒径（1000 μm）微塑料的抑制作用更强，在添加1%和5%2个浓度下大豆中钾的含量比对照分别降低了12.38%、26.73%。
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与对照相比，两茬种植中添加微塑料均表现出促进大豆体内磷的吸收和累积，且随着添加量的增加和微塑料粒径的增大，促进作用逐渐增强。其中添加5%粒径1000 μm微塑料，两茬种植中大豆体内磷含量分别比对照增加了48.15%和26.89%。
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3 讨论
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自然状态下，进入土壤的微塑料很难降解，会持续积累，最终会通过改变土壤环境或与依靠土壤存活的动植物相互作用而影响土壤生物的适应性和功能[15-17]。目前，农业生态系统中微塑料污染已受到国内外广泛关注，但是关于土壤中的微塑料是否会影响作物生长以及如何影响作物生长方面的研究报道还十分有限。
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3.1 微塑料对大豆生长的影响
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本试验中，添加微塑料对大豆出苗率有一定的抑制作用，大颗粒微塑料对大豆出苗率的抑制作用要强于小颗粒，且随着添加浓度的增加对出苗率的抑制作用增强，其中在添加5%粒径1000 μm的微塑料处理下大豆的出苗率比对照降低了64.91%。聚乙烯微塑料对大豆鲜重和株高的影响在第一茬种植中表现出对大豆鲜重和株高的抑制作用，而在第二茬种植中微塑料对大豆鲜重和株高则表现为促进作用，且随着添加浓度和粒径的增加，促进作用随之增加。与对照相比，两茬种植中微塑料对叶绿素的影响不明显，而且各处理之间差异也不显著。总体而言，土壤中微塑料的存在对植物幼苗生长有一定的抑制作用。Qi等[18]对聚乙烯和降解的残膜对小麦生长产生影响的研究中同样发现微塑料会影响植物幼苗的生长。这可能是因为残留在土壤中的塑料颗粒会影响植物根的生长发育和对养分及水分的正常吸收，进而影响植株地上部的生长发育[19]。
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3.2 微塑料对大豆品质的影响
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蛋白质和纤维素含量是评价大豆品质的重要指标。试验研究结果表明，添加微塑料会降低大豆体内蛋白质含量，但是会提高纤维素含量。在两茬大豆种植中添加微塑料都明显抑制大豆地上部蛋白质的合成，其中添加500 μm的微塑料对大豆体内可溶性蛋白质含量影响更大，两茬种植中相较于对照都降低了50%以上，说明土壤中微塑料的积累可影响大豆蛋白质的合成代谢，从而降低对氮素的利用效率。这与陈熹等[20]对微塑料影响小麦农艺性状的研究结果一致。添加微塑料会促进大豆体内纤维素含量的增加，这可能是因为微塑料影响大豆正常的水分和养分吸收造成的，但具体的生化机制机理还不清楚，需要进一步探索和验证。
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3.3 微塑料对大豆吸收累积养分的影响
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微塑料添加影响大豆吸收累积养分。两茬大豆种植中，添加微塑料处理对大豆体内氮吸收累积的抑制率为2.75%～29.55%，但会促进大豆体内磷的吸收和累积，且随着添加量的增加和微塑料粒径的增大，促进作用逐渐增强。在第一茬种植中添加微塑料对大豆吸收累积钾表现出促进作用，而在第二茬种植中添加微塑料均会抑制大豆对钾的吸收累积。土壤中微塑料残留一方面会造成作物根系生长发育困难，阻碍根系伸长，影响作物正常吸收水分和养分[18]。另外一方面，微塑料驱动的土壤理化特性变化可能影响土壤微生物的生物多样性，对陆地生态系统中关键的共生组合产生潜在影响，如菌根[21]和固氮[22]组合。这种对土壤结构和功能的潜在影响对作物生长尤其重要。本试验中，微塑料的添加会抑制大豆对氮的吸收和累积，可能是因为微塑料对大豆根部共生菌群的影响所致。
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已有研究显示，足够小的微塑料颗粒可以透过细胞壁、细胞膜等屏障，进入细胞内部，引起氧化胁迫，改变养分、水分的吸收和运输，影响植物的正常生长发育[23-24]，进而产生潜在的生态和健康风险。本试验中微塑料粒径较大，在植物表面的附着作用可能是其对作物产生影响的主要途径。此外，可食作物中微塑料的积累，还可能会增加人体对塑料中添加化学品（包括可浸出添加剂和黏附污染物）直接暴露的风险，并可能进一步对人类健康造成危害[25]。目前关于微塑料与植物互作的研究报道还十分有限，特别是农田生态系统中作物对微塑料的吸收和积累机制及生态毒性效应尚缺乏系统研究，评估土壤中微塑料对农作物及蔬菜的潜在安全及健康风险方法与体系亟待建立。因此，未来应加强对土壤中微塑料的生物效应及其机制的研究。
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4 结论
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添加微塑料会影响大豆的出苗率和生长发育，大粒径微塑料对大豆出苗率的抑制作用要强于小粒径，小粒径对大豆株高和鲜重的抑制更显著，且随着添加浓度的增加抑制作用增强。
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添加微塑料会抑制大豆植株体内可溶性蛋白质的合成，且大粒径微塑料的抑制效果要强于小粒径微塑料，但会促进大豆体内纤维素的累积。
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聚乙烯微塑料会影响大豆对养分的吸收累积，具体表现抑制大豆对氮的吸收累积，促进对磷的吸收累积，而对钾的吸收则是先促进后抑制。
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摘要
微塑料作为一种新型污染物，近几年在国内外受到普遍关注，但是大多研究都集中在水域生态系统方面， 对陆地生态中微塑料的环境行为研究甚少，尤其是对作物毒性效应的研究鲜有报道。通过盆栽试验比较不同粒径 （500、1000 μm）、不同浓度（1%、5%）的聚乙烯微塑料暴露下大豆生长和生理状况，以探究微塑料对大豆的毒性效应。研究结果发现，两茬种植中，微塑料暴露下大豆出苗率比对照处理降低了 7.69% ～ 64.91%，大粒径微塑料（1000 μm）对大豆出苗率的影响更显著，且随着添加浓度的增加对出苗率的抑制作用增强，而小粒径微塑料 （500 μm）对株高和鲜重表现出更强的抑制作用，对大豆叶片叶绿素含量没有明显影响。说明微塑料对大豆生长有一定的负面影响。与此同时，微塑料明显抑制大豆地上部蛋白质的合成，其中 500 μm 的微塑料对大豆体内可溶性蛋白质含量影响更大，相较于对照均降低了 50% 以上。而微塑料对大豆体内纤维素的含量则表现出一定的促进作用。微塑料同样会影响大豆体内养分的吸收和累积。两茬种植中，添加微塑料会抑制大豆体内氮的吸收累积 （抑制率为 2.75% ～ 29.55%），但会促进大豆体内磷的吸收和累积，且促进效果随添加量的增加和粒径的增大而增强，添加微塑料对大豆体内钾的吸收累积表现出先促进后抑制的作用。研究结果为全面认识农业生态系统中微塑料的潜在生物毒性效应和生态风险提供参考依据。
Abstract
As an emerging pollutant，microplastics have been received extensive attention all over the world in recent years. However，most of previous research focused on the fate of microplastics in aquatic ecosystems，little has been conducted on the environmental behavior of microplastics in terrestrial ecosystems，especially，study on its toxic effects to crops was rarely reported. A pot experiment was conducted to compare the growth and physiological status of soybean exposed to polyethylene microplastics with different particle sizes（500，1000 μm）and different adding concentrations（1%，5%）and the toxic effect of microplastics on soybean was explored. The results showed that the soybean germination rate under microplastics exposure was reduced by 7.69% ～ 64.91%，compared with the control in two crops planting. The effect of large-grained microplastics（1000 μm）on the germination rate of soybean was more significant，and the inhibitory effect on seedling germination rate was enhanced with the increase of additive concentration. However，the microplastics with small-grained particles（500 μm）showed stronger inhibition on plant height and fresh weigh of soybean，while it had no significant effect on soybean of content leaf chlorophyll. All of these results indicated that microplastics had some negative effects on soybean growth. At the same time，the addition of microplastics obviously inhibited the protein synthesis of soybean over ground， and 500 μm microplastics had a greater effect on the soluble protein content of soybean，which was more than 50% lower than that of the control treatment. Microplastics had a positive effect on the content of cellulose in soybean. Microplastics also affected nutrient uptake and accumulation in the soybean. In two crops planting，microplastics inhibited nitrogen uptake and accumulation in soybean（inhibition rate was 2.75% ～ 29.55%），while promoted the absorption and accumulation of phosphorus in soybean with the promoting effect being enhanced with the increase of additive amount and particle size. The absorption and accumulation of potassium in soybean were firstly promoted and then inhibited by microplastics in two crops planting. These results will provide profound reference for a comprehensive understanding of the potential biological toxic effects and ecological risks of microplastics in agricultural ecosystems.