海藻是沿海农业地区廉价且广泛的资源，其含有大量陆地生物所缺乏的生物活性物质、营养物质及功能成分，这些特性决定了海藻具有巨大的商业开发潜力^[1]。海藻肥是以海藻生物为原材料，使用超临界流体萃取、酶解发酵、酸碱水解以及超声波萃取等工艺分离活性成分并加工而成的新型生物肥料，含有海藻多糖、甘露醇、植物激素及氮、磷、钾等多种物质，具有无毒、无污染、易降解等特点^[2-4]，在发展环境友好型农作物种植方面发挥了重要作用。

目前，国内外学者研究海藻肥所用的藻类主要以褐藻门为主，包括泡叶藻、墨角藻、马尾藻以及海带等。Rayirath等^[5]试验表明，泡叶藻肥能够有效缓解拟南芥在低温胁迫下的叶片失活和叶绿素降解，从而提高植株对低温逆境的耐受性。Shukla等^[6]研究海藻肥对干旱胁迫条件下大豆幼苗生长发育的影响，结果发现海藻肥处理显著提高植株的相对含水量和气孔导度，同时也诱导干旱逆境响应相关基因表达上调；在干旱胁迫下的大豆幼苗恢复生长期，海藻肥处理与对照相比具有更高的抗氧化酶活性。Latique等^[7-8]分别将不同浓度墨角藻肥预浸泡过的小麦种子和马尾藻肥预浸泡过的大豆种子进行盐胁迫试验，发现海藻肥处理的生物量积累以及抗氧化酶活性普遍高于对照。吴秀红^[9]和王向丽^[10]研究发现适宜浓度的海带肥能够分别提高黑果枸杞和番茄在盐胁迫下的抗氧化酶活性及抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）的含量，同时增加植株的生物量。以上研究表明海藻肥具有提高植物抗逆水平及促进作物生长的潜在功能。

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），又称黑节草、云南铁皮，为兰科石斛属多年生附生草本植物，主要分布于我国安徽西南部、浙江东部、福建西部、广西西北部、四川以及云南东南部等地区，喜生于海拔达1600m的山地半阴湿的岩石上，具有极高的药用和观赏价值^[11-12]。近年来由于过度采挖和生态环境的破坏，野生的铁皮石斛种质资源已经濒临灭绝，但利用植物组织培养技术确保了每年数亿株铁皮石斛幼苗的市场供应^[13]。目前，我国铁皮石斛生产基地主要集中在浙皖地区和云南，而浙皖地区冬季最低温度可达5℃以下，山区冬季最低温度甚至达到0℃以下。铁皮石斛生长最适温度为20～25℃，研究发现在长时间5℃低温胁迫下铁皮石斛叶片电解质渗透率和抗氧化酶活性迅速升高，而在0℃及以下低温时铁皮石斛细胞损伤程度严重，且影响幼苗的生长发育，甚至引起死亡；同时产业中存在盲目引种现象，大量铁皮石斛幼苗由于不适应引入地的生态和栽培条件无法正常越冬而死亡，严重制约了铁皮石斛的繁育与生产^[14-16]。因此，研究如何提升铁皮石斛抗低温能力对其实际生产具有重要意义。

目前国内外未见将海藻肥施用于铁皮石斛上的研究报道，而铁皮石斛的越冬管理依旧是人工栽培过程中的一个重要环节。基于此，本试验以铁皮石斛‘晶品一号’幼苗为试材，通过不同浓度海藻肥喷施处理探讨其对低温胁迫下铁皮石斛的缓解作用，将海藻肥与铁皮石斛的低温逆境响应建立功能性联系，为拓宽海藻肥在铁皮石斛产业上的利用空间提供新方向。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

试验于2019年7～12月在浙江农林大学平山现代温室（30°15′48″N，119°43′10″E）中进行，该地属亚热带湿润季风气候，常年平均气温16℃，冬季平均气温5℃。夏秋雨量少，多干旱；冬季则多霜雪天气，常有冻害出现。

供试植株材料为已移栽驯化6个月、长势均匀、生长健壮的铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）‘晶品一号’幼苗。栽培容器为上口径100mm，下口径65mm，高85mm的栽培盆，栽植密度为每盆2丛幼苗，所用栽培基质由松鳞、泥炭土和蛭石（3∶1∶1，v/v）组成。

海藻肥所用原料为褐藻门海带属藻类提取物，主要成分包括海藻酸、甘露醇、植物激素和微量元素等，其pH为7～8。Miracle-Gro浓缩营养液 （N-P-K：27-17-16）和颗粒缓释肥（N-P-K：14-9-12）作为本试验中铁皮石斛的基础营养来源。

1.2 试验设计

将海藻肥稀释成3个不同浓度的海藻肥溶液，分别为低浓度稀释1500倍（T1）、中浓度稀释1000倍（T2）、高浓度稀释500倍（T3），以喷施清水为对照（T0），每个处理设20盆幼苗，每处理重复3次。海藻肥喷施间隔为一周，各处理每次喷施的海藻肥溶液体积约为2L。

连续喷施处理5个月后将上述铁皮石斛幼苗（T0～T3）置于人工气候箱（GLD-450D，宁波乐电）中进行低温胁迫处理，温度设定为4℃，光强8000Lx，光照周期12h。在胁迫开始后的第0、6、 12h分别取样，然后将人工气候箱温度恢复至常温 （昼/夜温度为25/15℃），在恢复生长阶段的第2、 4、6d分别取样。各处理每次取样随机挑选5盆长势均匀的植株，剪取由上至下第3～5片叶，放入液氮速冻后保存于-80℃超低温冰箱，各处理取样重复3次。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 叶片相对活性

参考刘楠等^[17]方法检测植物完整叶片的细胞活性。将铁皮石斛叶片用纯净水清洗、抹干，并浸泡在0.25%（w/v）的伊文思蓝染液中24h；随后取出叶片，用纯净水清洗表面蓝色染液，抹干后放入无水乙醇中去除叶绿素直至底色显白色为止；将脱去叶绿素而呈现有明显蓝色斑的叶片平展，用数码相机拍照，然后利用Image-J（http：//rsb.info.nih.gov/ij/）计算叶片非染色区域面积（A）与全叶片面积（At），将二者的比值作为叶片相对活性（V），即：V（%）=A/At×100。

1.3.2 叶绿素、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量

叶绿素含量测定采用乙醇浸提法；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法；Pro含量测定采用酸性茚三酮法^[18]。

1.3.3 抗氧化酶活性

过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法^[19]，过氧化氢酶（CAT）活性测定采用紫外吸收法^[19]，超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用NBT法^[20]，抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定采用抗坏血酸氧化法^[21]。

1.3.4 抗氧化酶相关基因表达分析

利用高多酚多糖植物总RNA提取试剂盒 （新景，杭州）提取铁皮石斛叶片总RNA，利用 EasyScript One-Step SuperMix试剂盒（全式金，北京）反转录合成cDNA第一链，具体方法参照试剂盒说明书。以铁皮石斛18S rRNA为内参基因^[22]，参照李标^[23]和魏明等^[24]方法分别设计铁皮石斛POD和CAT、SOD基因特异性定量引物（表1），引物序列交由杭州擎科生物工程有限公司合成。利用 TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒（ 全式金，北京）进行qRT-PCR分析，采用2^-ΔΔCT 法计算相对表达水平，qRT-PCR反应体系见表2。

1.4 数据处理

将上述测得的数据利用SPSS 22.0进行显著性检验，Duncan法的多重比较在0.05和0.01水平上进行；利用Origin 2018绘制图表。

2 结果与分析

2.1 海藻肥对低温胁迫下铁皮石斛幼苗叶片相对活性的影响

由低温胁迫下不同处理组的铁皮石斛幼苗叶片相对活性染色结果（图1A）可知，随着低温胁迫时间的延长，所有处理组叶片染色面积逐渐增加，表明叶片的相对活性逐渐减弱，尤其以T0处理减弱幅度最大。低温胁迫6h后，T0处理的叶片相对活性为30.52%，而海藻肥处理T1、T2、 T3分别达62.8%、65.73%、65.35%；当胁迫时间延长至12h时，T0处理叶片相对活性仅为5.52%，而T1、T2、T3处理分别为48.51%、45.91%、 43.84%（图1B）。由此可初步说明海藻肥处理能够有效缓解低温胁迫下铁皮石斛叶片组织损伤和细胞失活

2.2 海藻肥对低温胁迫下铁皮石斛幼苗叶绿素、 MDA、Pro含量的影响

由表3可知，在低温胁迫前（0h），不同浓度的海藻肥处理下铁皮石斛幼苗叶片的叶绿素含量显著高于T0处理。在低温胁迫期间T0处理的叶绿素含量持续降低，而海藻肥处理叶绿素含量呈先降低后增加的趋势，且对低温胁迫下铁皮石斛叶绿素含量的减少具有一定的缓解效应，其中在低温胁迫6和12h时，T2处理叶绿素含量与T0处理之间存在显著差异，分别增加了27.04%、38.36%。

所有处理的铁皮石斛幼苗叶片MDA含量呈先降低后增加趋势（表3），其中在低温胁迫期间T0处理MDA含量均高于海藻肥处理，并且存在极显著差异。在低温胁迫前（0h），T1、T2、T3处理分别较T0处理降低19.32%、36.09%、38.81%。当低温胁迫延长至6和12h时，T2处理MDA含量均维持最低水平，与T0处理相比分别降低38.17%、 37.59%。

注：表中星号表示同一时间点不同处理间的差异显著性（* 表示P<0.05；** 表示P<0.01）。

不同处理下铁皮石斛幼苗叶片Pro含量变化因海藻肥喷施浓度和低温胁迫持续时间的不同而存在明显差异（表3）。在低温胁迫前（0h），不同浓度的海藻肥处理下铁皮石斛幼苗叶片Pro含量显著降低；当受到低温胁迫时，T0处理的Pro含量持续降低，而海藻肥处理的铁皮石斛叶片中Pro含量则呈升高趋势，其中T2处理其升高幅度最大。

2.3 海藻肥对低温胁迫下铁皮石斛幼苗抗氧化酶活性的影响

由图2A可知，铁皮石斛幼苗叶片在低温胁迫下POD活性快速上升，其中海藻肥处理提升幅度较为明显，在低温胁迫12h时，T1、T2、T3处理与T0处理之间存在极显著差异，分别增加155.14%、141.13%和167.38%。低温胁迫下海藻肥处理铁皮石斛幼苗叶片CAT活性显著低于T0处理（图2B），其中T2处理降幅最明显，在低温胁迫6和12h时，分别比T0处理减少32.04%和59.11%。

注：图中星号表示同一时间点不同处理间的差异显著（* 表示P<0.05；** 表示P<0.01）。下同。

铁皮石斛幼苗在遭受低温胁迫后叶片内SOD活性显著提高（图2C），在低温胁迫6h时，T1、 T2处理SOD活性相比T0处理分别提高8.9%、 18.32%；低温胁迫12h时，T1、T2相比T0处理分别提高9.43%、11.79%。但T3处理下铁皮石斛SOD活性降低，在整个低温胁迫期间（0、6、 12h）T3处理相比对照分别降低25.00%、2.61%、 0.47%。

由图2D可知，在低温胁迫后，各处理的铁皮石斛幼苗叶片APX活性快速上升，尤其以T2处理其提升幅度最大，且与其他处理之间均存在显著差异。综上所述，海藻肥处理能够有效提高铁皮石斛幼苗在低温胁迫下的POD、SOD、APX活性，其中以T2处理其提升幅度最大。

2.4 海藻肥对低温胁迫下铁皮石斛幼苗抗氧化酶相关基因表达水平的影响

在低温胁迫6h时，各处理的POD、CAT、 SOD基因表达水平均有不同程度的上调（图3），当低温胁迫时间延长至12h时，海藻肥处理的CAT基因表达水平出现下调，同时T1和T3处理的SOD基因表达水平也较6h时有所降低。在低温胁迫各时期，T2处理POD、SOD基因表达维持较高的水平，与其他处理之间均存在显著甚至极显著差异，说明在低温胁迫下适宜浓度的海藻肥处理 （T2）能够有效提高铁皮石斛幼苗的POD、SOD基因表达水平，同时降低CAT基因表达水平。

2.5 海藻肥对低温胁迫后恢复生长期铁皮石斛幼苗抗氧化酶活性的影响

在低温胁迫解除后的恢复生长初期（恢复生长至2d时），铁皮石斛POD、CAT、SOD、APX活性显著降低（图4）；恢复生长2～6d，POD活性持续降低，但CAT、SOD、APX活性逐渐升高，其中SOD、APX活性升高较为明显，CAT活性变化趋势平缓；在恢复生长期间T2处理的铁皮石斛幼苗POD、CAT、SOD、APX活性均高于其他处理。

3 讨论与结论

高等植物遭受低温胁迫时会发生一系列生理功能的紊乱，积累大量活性氧（ROS），其中主要包括过氧化氢（H₂O₂），超氧阴离子（O₂ ^·-）、单线态氧（¹ O₂）和羟基自由基（·OH）等，这些会破坏叶绿体中的电子传输链，导致叶片的叶绿素含量和光合活性降低，MDA含量升高^[25-26]。另外，植物叶绿素酶在叶片衰老过程中参与叶绿素降解，当植物遭受生物胁迫或者非生物胁迫时会刺激叶绿素酶活性升高^[27]。本研究发现，在低温胁迫下铁皮石斛叶片叶绿素含量显著降低（表3），而海藻肥处理有效缓解了这一现象，这可能与其降低铁皮石斛叶片中叶绿素酶的活性有关。同时本研究发现海藻肥处理有效缓解了铁皮石斛叶片失活（图1）和MDA含量积累（表3），推测喷施海藻肥处理对低温胁迫下铁皮石斛的细胞膜系统具有一定的保护作用，能够降低低温胁迫造成的膜脂过氧化损伤，较好地保持植物光合系统和细胞膜结构的稳定性，其中以稀释1000倍海藻肥的处理缓解效果最佳。

在植株受到逆境胁迫而积累的活性氧中，·OH对细胞组织具有更强的攻击性，而Pro对·OH的清除有明显的专一性^[28]。Cabo等^[29]研究表明海藻肥处理有效降低了榛子树中的Pro和MDA含量，是由于其提高了植株的抗逆能力。本研究发现，在低温胁迫初期（0～6h）海藻肥处理Pro含量普遍低于对照（表3），但随着胁迫时间延长，海藻肥处理Pro含量持续增加，而对照持续降低，本研究推测低温胁迫初期海藻肥处理·OH含量较少，因此受到的过氧化损伤较轻，但持续的低温胁迫刺激了植株对逆境的响应，此时海藻肥处理植株通过提高Pro含量防止细胞大量失水，稳定蛋白，并维持膜结构平衡^[30]。

POD、CAT、SOD和APX是参与抗氧化过程的4种重要酶类，可以保护植物免受非生物或生物胁迫引起的氧化损伤，其中SOD能够催化O₂ ^·- 分解为O₂ 和H₂O₂，而POD、CAT和APX进一步清除H₂O₂ ^[31]。同时，细胞器中各抗氧化酶之间存在一个动态平衡，某一酶活性的改变就有可能影响到其他酶活性，不同抗氧化酶在植物体内相互影响，协同作用，共同调节植株的抗氧化防御系统^[32]。本试验发现，低温胁迫下稀释1000倍海藻肥的处理铁皮石斛幼苗POD、SOD和APX活性显著提高，同时CAT活性显著降低（图2），这可能是由于POD对供氢体的要求比较广泛，因此对H₂O₂ 的催化具有很强的竞争力^[32]。而当植物体某些细胞器中CAT活性较低时，AsA-GSH循环能有效地清除细胞代谢所产生的H₂O₂，其中APX作为该循环中关键的抗氧化酶，能够通过催化底物AsA氧化从而清除H₂O₂ 和O₂^·-[33]，因此本研究中虽然海藻肥处理下铁皮石斛幼苗CAT活性低于对照，但植株通过调节POD、SOD和APX活性提高了清除H₂O₂、MDA和O₂ ^·- 的能力。

魏明等^[24]研究发现，内生真菌能够诱导干旱胁迫下铁皮石斛叶片抗氧化酶活性升高及相关基因表达水平上调，提高了铁皮石斛的抗氧化防御能力。本研究对抗氧化酶相关基因（POD、CAT、 SOD）表达水平进行qRT-PCR分析，结果发现低温胁迫下海藻肥处理POD、SOD基因表达水平一定程度上调，而CAT基因表达水平显著下调（图3），这也与在低温胁迫下喷施海藻肥处理铁皮石斛幼苗POD、SOD、CAT活性的变化趋势基本一致，说明海藻肥处理能够通过调节抗氧化酶相关基因表达来缓解低温对植株的伤害。

在低温胁迫解除后的恢复生长期铁皮石斛各抗氧化酶活性逐渐恢复至胁迫前水平（图4），这表明铁皮石斛叶片中膜脂过氧化物含量逐渐减少，细胞膜的结构及功能逐渐恢复，为植株其他生理代谢功能的恢复提供了条件^[31]。同时，海藻肥处理抗氧化酶活性普遍高于对照，说明海藻肥处理在一定程度上提高了铁皮石斛幼苗在恢复生长期的综合抗氧化能力。

综上所述，稀释1000倍海藻肥的处理可以有效缓解铁皮石斛幼苗在低温胁迫下的氧化损伤，有助于植株减缓叶片失活和叶绿素降解，调节Pro含量以及清除MDA从而维持细胞膜稳定性，同时调节抗氧化酶活性参与铁皮石斛幼苗对低温逆境的防御过程。因此，在铁皮石斛幼苗的人工栽培中，喷施适宜浓度的海藻肥可有效增强植株的抗低温能力，从而有利于促进铁皮石斛幼苗生长和发育。

参考文献