尿素是我国最主要的氮肥品种^[1]，其施入土壤后会在脲酶的作用下快速水解转化为铵态氮，若不能及时被作物吸收利用，易导致氮素损失，从而降低肥料利用率^[2-3]。因此，利用一定材料对尿素进行改性，以影响其转化，降低其氨挥发损失，对提高肥料利用率具有重要意义^[2，4-6]。

腐植酸（HA）是一种含有活性官能团的大分子有机化合物，具有螯合性、吸附性^[7]。研究证明腐植酸可以促进作物生长、提高作物产量^[8-9]，促进作物对养分的吸收、转化及利用^[10-11]；同时腐植酸可以结合尿素态氮、抑制脲酶活性、减缓尿素水解、提高氮素利用、减少氨挥发损失^[12-15]。因此，腐植酸常与尿素结合制备成腐植酸尿素^[12-14]，腐植酸与尿素的结合工艺是影响腐植酸尿素应用效果的重要因素。目前制备腐植酸尿素的工艺主要有以下几种：（1）机械混合等物理方法制备掺混腐植酸尿素^[15-18]；（2）以水为介质，用包涂的方法制备腐植酸尿素^[19-20]；（3）以有机溶剂为介质制备腐植酸尿素^[21]；（4）在熔融条件下制备熔融腐植酸尿素^{[12-14，22-23]}。其中最有代表性的是熔融工艺和掺混工艺^[12-18]。研究表明，腐植酸与尿素掺混施入土壤后，可以抑制土壤脲酶活性，吸附尿素释放的铵态氮，降低氨挥发^{[15-17，24-25]}。另有研究表明，腐植酸与尿素在熔融条件下可以发生反应，通过改变尿素的结构减缓尿素在土壤中的转化^{[22-23，26-27]}； 同时熔融腐植酸尿素施入土壤后的氨挥发显著低于对照尿素^[26-27]。然而，先前的腐植酸尿素研究多停留在对单一工艺条件下的分析、探索，对不同工艺下的系统对比研究鲜见报道。因此，本研究将腐植酸与尿素分别通过掺混与熔融两种工艺制备腐植酸尿素试验产品，开展了土壤培养试验以探究腐植酸与尿素结合工艺对尿素转化及损失的影响，为腐植酸尿素的研发及生产工艺的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 土壤

供试土壤取自中国农业科学院德州实验站禹城试验基地连续3年不施任何肥料的匀地试验田耕层土壤（0～20cm），混匀，风干，磨碎并过2mm筛，保存备用。土壤类型为石灰性潮土，土壤pH值8.9，有机质11.1g/kg，全氮0.7g/kg，有效磷5.3mg/kg，速效钾100.3mg/kg。

1.1.2 腐植酸

供试腐植酸以霍林河风化煤为原料，利用碱溶酸析法提取腐植酸^[23]，所得腐植酸C含量为55.02%，N含量为0.96%，羧基含量为0.8meq/g，酚羟基含量为2.12meq/g，pH值为7.45，E4/E6为3.26（E4/E6是腐植酸的重要参数之一，是指腐植酸碱溶液在波长465和665nm处吸光度的比值，一般作为腐植酸芳香化程度的特征指标。其比值越低，表示芳香化程度越高^[23]）。

1.1.3 肥料

供试肥料的制备：（1）将上述腐植酸按0.5%、 5%的比例添加到熔融尿素中，充分混匀、冷却后研磨，制备熔融的腐植酸尿素产品（HAU0.5、 HAU5）；（2）尿素熔融后，冷却、研磨，然后将腐植酸按0.5%、5%的比例与其充分混合，制备掺混的腐植酸尿素产品（HA+U0.5、HA+U5）； （3）制备仅熔融但不添加腐植酸的对照尿素产品 （U）。采用消煮-凯氏定氮法测定所得产品的氮含量^[28]。供试肥料的基本信息见表1。

1.2 试验设计

设置尿素处理5个，分别为4种腐植酸尿素处理HAU0.5、HA+U0.5、HAU5、HA+U5和对照尿素处理U，施氮量均为N 0.3g/kg；同时，设置不施氮肥对照CK，与HAU0.5和HA+U0.5处理中腐植酸添加量相一致的只施入腐植酸处理HA0.5，与HAU5和HA+U5处理中腐植酸添加量相一致的只施入腐植酸处理HA5。共计8个处理。

1.3 试验方法

本试验在2019年6月12日至8月26日在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所农业农村部植物营养与肥料重点实验室进行。正式培养开始前，先将土壤进行预培养。具体操作为：向过2mm筛的干土喷水直至土壤含水量为田间最大持水量的40%，然后将其放置到25℃培养箱中进行恒温预培养（3d）。预培养结束后，将预培养的土壤分为2部分，分别进行氨挥发试验与尿素转化试验。

1.3.1 氨挥发试验

试验采用“静态吸收法”进行。根据1.2试验设计，将各处理的肥料与预培养土（相当于500g干土）充分混匀，每个处理重复3次；用重量法补充水分，直至土壤含水量为田间最大持水量的60%，然后装入800mL培养瓶中；在培养土上部放置装有20mL浓度为2%硼酸溶液的吸收杯；培养瓶密封，置于25℃人工气候箱中进行密闭培养。于培养后的第0.25、0.5、1、2、3、5、7、14d取出吸收杯，在取出吸收杯的同时，培养瓶中接着换入新的装有硼酸溶液的吸收杯继续培养。取出的吸收杯滴入2滴甲基红-溴甲酚绿指示剂后，用0.02mol/L 1/2H₂SO₄ 溶液进行滴定，计算氨挥发氮量。

1.3.2 尿素转化试验

根据1.2试验设计，将各处理的肥料与预培养土（相当于100g干土）充分混匀，每个处理重复24次；用重量法补充水分，直至土壤含水量为田间最大持水量的60%，然后装入顶部有孔的200mL培养瓶中，置于25℃人工气候箱中进行好气培养。在培养后的第0.25、0.5、1、2、3、5、7、14d进行破坏性取样，每个处理取3个重复，并将土样分为两部分。一部分取鲜样测定土壤尿素态氮、 NH₄ ⁺-N、NO₃^--N含量和土壤含水量；另一部分土壤风干后测定土壤脲酶活性与土壤pH值。其中，土壤尿素态氮测定采用对二甲氨基苯甲醛比色法；土壤NH₄ ⁺-N、NO₃^--N采用2mol/L氯化钾溶液浸提，流动注射分析仪比色测定；土壤脲酶活性采用靛酚蓝比色法（间接方法）测定；土壤pH采用pH测定计测定，水土比为2.5∶1^[28]。

1.4 数据处理

采用Excel 2013、SPSS 23.0和Duncan新复极差法对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 腐植酸与尿素结合工艺对氨挥发累积氮量的影响

由图1可知，随着培养时间的延长，各施氮处理的氨挥发累积氮量逐渐增加，在培养结束时，达到最高值，为2.469～3.971mg/瓶，占施氮量的8.2%～13.2%。培养初期（0.5d以内），各施氮处理的氨挥发累积氮量差异不显著；而在培养1～14d，各腐植酸尿素处理的氨挥发累积氮量分别比对照尿素处理显著降低6.7%～61.7%（P<0.05）。培养1～7d，等量腐植酸添加，经由熔融工艺制备的腐植酸尿素（HAU）处理的氨挥发累积氮量低于掺混工艺，其中HAU5比HA+U5处理显著降低氨挥发累积氮量10%～14%；而腐植酸添加比例为0.5%时，在培养第1d，HAU0.5比HA+U0.5显著降低氨挥发累积氮量30%。相同结合工艺，培养1～7d，腐植酸添加比例为5%的腐植酸尿素处理的氨挥发累积氮量显著低于腐植酸添加量为0.5%的处理。其中HA+U5处理的氨挥发累积氮量比HA+U0.5处理低15.1%～40.3%，HAU5处理的氨挥发累积氮量比HAU0.5处理低22.2%～27.6%。

注：小写字母不同表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。

2.2 腐植酸与尿素结合工艺对土壤尿素残留量的影响

随着培养时间的延长，各施氮处理的土壤尿素残留量逐渐降低；培养第3d，土壤中未检测出尿素，说明所施尿素此时已全部水解。培养前2d，腐植酸尿素处理的土壤尿素残留量均显著高于对照尿素处理（P<0.05）。等量腐植酸添加，经由熔融工艺制备的腐植酸尿素处理（HAU）的土壤尿素残留量均高于掺混工艺制备的腐植酸尿素处理（HA+U），且腐植酸添加比例为5%时，培养第0.25、0.5、1、2d，HAU5处理的土壤尿素残留量分别为545.2、429.7、301.1、101.9mg/kg，显著高于相应培养时间的HA+U5处理，分别高出33.7%、26.3%、17.5%、32.3%（P<0.05）； 而HAU0.5处理在培养第2d时，土壤尿素残留量显著高出相应培养时间的HA+U0.5处理65.7%（图2）。相同腐植酸与尿素结合工艺，添加比例为5%的腐植酸尿素处理的尿素残留量高于添加比例为0.5%的腐植酸尿素处理，且培养第0.25、0.5、1d，熔融工艺制备的2种腐植酸尿素差异显著（P<0.05）； 而掺混工艺制备的2种腐植酸尿素仅在培养第0.5d差异显著， HA+U0.5处理的尿素残留量比HA+U5减少12.8%（图2）。

2.3 腐植酸与尿素结合工艺对土壤NH⁺ ₄-N含量的影响

随着培养时间的延长，各施氮处理的土壤NH⁺ ₄-N含量均呈现先升高后降低的变化趋势（图3），在培养的第2d出现峰值，其中HAU0.5、HA+U5、 HAU5处理的NH⁺ ₄-N含量分别为268.5、259.5、 273.4mg/kg，均显著高于对照尿素处理（P<0.05）（图3）。等量腐植酸添加条件下，在培养第2、5d时，经由熔融工艺制备的腐植酸尿素处理（HAU） 的NH⁺ ₄-N含量显著高于掺混工艺制备的腐植酸尿素处理（HA+U）（ 图3）。在第2d时HAU0.5处理的NH⁺ ₄-N含量比HA+U0.5处理显著提高9.4%， HAU5处理的NH⁺ ₄-N含量比HA+U5处理显著提高5.3%；在第5d时HAU5处理的NH⁺ ₄-N含量比HA+U5处理显著提高30.4%（图3）。相同腐植酸与尿素结合工艺，在培养的第2d HA+U5处理的土壤NH⁺ ₄-N含量比HA+U0.5处理显著提高5.7%，而HAU5与HAU0.5处理间的NH⁺ ₄-N含量差异不显著 （图3）。

2.4 腐植酸与尿素结合工艺对土壤NO^-₃-N含量的影响

随着培养时间的延长，各施氮处理的土壤NO^-₃-N含量呈现先逐渐升高后趋于平稳的变化，其中U及HA+U5处理在第7d达到峰值，HA+U0.5、 HAU0.5、HAU5处理在第14d达到峰值（图4）。在培养结束时，腐植酸尿素处理的NO^-₃-N含量均高于对照尿素处理，且HA+U0.5、HAU5处理的NO^-₃-N含量分别比U处理显著提高12.6%、13.2%（图4）。等量腐植酸添加条件下，在培养结束时， 2种工艺制备的腐植酸尿素处理的NO^-₃-N含量呈现出显著差异，其中HA+U0.5处理的NO^-₃-N含量比HAU0.5处理显著提高了8.7%，HAU5处理的NO^-₃-N含量比HA+U5处理显著提高了4.3%。相同腐植酸与尿素结合工艺，不同腐植酸添加量的腐植酸尿素之间无显著性差异（图4）。

2.5 腐植酸与尿素结合工艺对土壤pH值的影响

随着培养时间的延长，各施氮处理的土壤pH值呈现先升高后降低的变化，均在培养的第1d达到峰值，约为8.99～9.02（图5），各腐植酸尿素处理的土壤pH值与对照尿素处理无显著性差异，不同工艺的腐植酸尿素之间差异不显著。整体而言，腐植酸于尿素结合对土壤pH值无显著影响。

2.6 腐植酸与尿素结合工艺对土壤脲酶活性的影响

随着培养时间的延长，各施氮处理的脲酶活性呈现出先降低后升高的变化（图6）。在整个培养周期内，各腐植酸及施肥处理的土壤脲酶活性均低于CK，其中各腐植酸处理之间无显著差异（图6）。在培养的第0.25、0.5d，经由掺混工艺制备的腐植酸尿素处理的脲酶活性低于对照尿素处理；在培养的第0.25、0.5、14d，经由熔融工艺制备的腐植酸尿素处理的脲酶活性高于对照尿素处理，分别显著提高49.8%、100.7%、14.6%（图6）。等量腐植酸添加条件下，在培养的第0.25、0.5d，经由熔融工艺制备的腐植酸尿素处理的脲酶活性显著高于掺混工艺制备的腐植酸尿素处理，其中HAU0.5处理分别比HA+U0.5处理显著提高56.8%、100.8%， HAU5处理分别比HA+U5处理显著提高118.6%、 172.9%。相同腐植酸与尿素结合工艺，不同腐植酸添加量的腐植酸尿素处理之间无显著性差异 （图6）。

3 讨论

尿素施入土壤后，首先在脲酶的作用下水解为氨，同时使土壤pH值快速增加，在培养的第1d达到峰值；随后，尿素水解的氨在硝化细菌的作用下发生硝化作用生成NO^-₃-N，同时释放H⁺ 降低土壤pH值^[23] （图5）。本试验中，尿素在培养的第3d已水解完全（图2），而NH⁺ ₄-N、土壤pH值的峰值分别出现在第2、1d（图3、5），在时间序列上并不同步，这主要是因为在培养的第1d已经出现硝化作用，使得土壤pH值下降点较NH⁺ ₄-N峰值点有所提前（图4）。在培养的前3d，两种工艺制备的腐植酸尿素均可抑制尿素水解，这与大多数人的研究结果相一致。但两种工艺制备的腐植酸尿素对脲酶活性的影响呈现不一致的结果（图6），这可能是因为在掺混过程中腐植酸未能与尿素发生反应，施入土壤后腐植酸可通过吸附、络合等方式与土壤脲酶结合，从而降低脲酶活性^[17]；而在熔融过程中，腐植酸与尿素发生反应，尿素结构发生改变^[29-31]，施入土壤后，尿素无法在短期内与脲酶结合，因此呈现出脲酶活性、尿素残留量高的结果。因此，不同工艺制备的腐植酸尿素增效机理可能是不同的，其中掺混工艺制备的腐植酸尿素通过抑制脲酶活性，间接减缓尿素水解；熔融工艺制备的腐植酸尿素通过改变尿素结构^[23]，直接减缓尿素水解，具体原因可通过结构分析进一步验证。在培养第2～14d，各施氮处理的脲酶活性逐渐升高，其中腐植酸尿素处理的脲酶活性提高幅度大于对照尿素处理，这是腐植酸在培养后期稳定脲酶活性的表现^[23]。

在培养的前5d所有施氮处理的氨挥发累积氮量迅速增加，随后趋于平稳，这与大多数研究结果相一致^[32-33]。其中腐植酸尿素可显著降低氨挥发，一方面是因为腐植酸可减缓尿素的水解，另一方面是因为腐植酸具有多孔性，可吸附尿素水解释放的氨^[34-35]。此外，本试验中熔融腐植酸尿素处理的氨挥发显著低于掺混腐植酸尿素处理，主要原因可能是熔融工艺减缓尿素效果高于掺混工艺。

在培养的前5d，腐植酸尿素处理可降低氨挥发6.1%～61.7%，而在尿素转化试验中，NH⁺ ₄-N含量仅提高了1.1%～12.3%，两者并不一致。一方面因为两者的试验环境不一致，氨挥发试验是在密闭环境下进行的，而尿素转化试验是在通气条件下进行；同时部分尿素水解的NH⁺ ₄-N，也可能被微生物利用进而转化为微生物态氮^[8]。此外，培养结束后，腐植酸尿素的NO^-₃-N含量较对照尿素有增加的趋势，这主要是由腐植酸尿素处理的尿素态氮残留量高、氨挥发损失较低导致的。HAU5处理在培养第7d时，其NO^-₃-N含量显著低于其他尿素处理，这可能是腐植酸-尿素反应产物抑制硝化作用导致的^[36-37]，具体原因有待进一步研究。

4 结论

与对照尿素相比，腐植酸尿素的氨挥发累积氮量可降低6.7%～61.7%；熔融腐植酸尿素较掺混腐植酸尿素可降低氨挥发累积氮量21.8%；添加0.5%腐植酸，两种结合工艺对氨挥发累积氮量无显著影响。添加5%腐植酸，熔融腐植酸尿素较掺混腐植酸尿素可显著降低氨挥发累积氮量13.5%； 腐植酸尿素较对照尿素可显著减缓尿素水解，提高培养后的土壤矿质态氮含量，其中熔融腐植酸尿素较掺混腐植酸尿素可显著增加土壤尿素残留量24.1%，提高土壤矿质态氮含量11.7%，添加0.5%腐植酸的熔融腐植酸尿素与添加5%腐植酸的掺混腐植酸尿素的尿素残留量相当；与对照尿素相比，在培养前期（0.5d以内）掺混腐植酸尿素可降低脲酶活性19.1%、12.3%，而熔融腐植酸尿素可显著提高脲酶活性48.5%、102.1%。

总体而言，腐植酸尿素可显著抑制尿素水解、降低氨挥发、提高土壤矿质氮含量，其中以熔融工艺的效果最佳。

参考文献