微生物是土壤生态中较为活跃的部分，在土壤有机质的分解、养分循环和生态环境改善等方面起着重要作用，对植物生长发育和群落演替具有重要的作用^[1-5]。土壤微生物群落结构是反映土壤肥力和健康状况的重要指标^[6-7]，而土壤微生物功能多样性是土壤微生物群落状态和功能的标志，反映了土壤微生物的生态特征^[8]。Biolog ECO板法是美国Biolog公司发展起来的，用于研究微生物代谢功能多样性和活性，原理是通过微生物对板中不同碳源类型的利用能力及代谢差异来反映微生物群落的功能多样性^[9-10]。该方法具有无需分离培养微生物、方便快捷、数据量大等优点，近年来被广泛应用于土壤、水体等研究^[11-14]。

目前，关于荔枝园土壤中微生物群落多样性的研究极少，阮传清等^[15]利用磷脂脂肪酸方法，研究了杨桃与荔枝根区土壤微生物群落结构，发现荔枝根区土壤微生物多样性指数（Simpson）和细菌、真菌的特征脂肪酸含量大小为：距植株1.0m土壤>0.5m土壤≈ 1.5m土壤。覃婵婵^[16] 利用Biolog ECO板法和高通量测序研究了荔枝幼龄果园间作大豆、红薯及覆膜处理后荔枝园土壤微生物群落对碳源的代谢水平及荔枝根际土壤微生物群落的多样性，发现间作大豆对微生物群落多样性的提高最佳，其次是间作红薯，最后是覆盖处理。施肥直接影响土壤理化性质、生物活性及微生物群落结构，不同施肥措施对微生物群落影响不同^[17-18]。枝叶还田、施肥方式和土壤类型等都是影响土壤微生物活性及群落多样性的因素^[19]，目前尚未见关于施肥对荔枝园土壤微生物多样性的研究报道。本研究拟通过Biolog ECO板法研究化肥减施对荔枝园土壤微生物功能多样性的影响，为提出荔枝合理施肥方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与样品采集

试验荔枝园位于海南省海口市东昌农场兴贵果园（110.618443°E，19.597410°N），供试品种为主栽荔枝品种‘妃子笑’，树龄20年，行间距4m×5m，单株均产45kg左右。试验于2018年6月开始，本研究是在完成2个年度生长周期的施肥管理后，于2020年6月取样研究的结果。试验共设10个施肥处理：果农习惯施肥处理（T0）和化肥减施处理（T1～T9）。T1～T9是在荔枝采后第一次施肥时采用L₉（3⁴）正交试验设计，枝叶还田方式、有机肥和无机肥种类及用量3个因素，设3个水平，共9个处理（表1）；其他物候期， T1～T9的施肥种类和用量一致。在整个年度生长周期内，相对果农习惯施肥处理T0，T1～T9的化肥总施用量均有减少（表2）。在树冠滴水线下开沟施肥，有机肥和无机肥（T7～T9添加粉碎后的枝叶）混合后埋施。各施肥处理试验用树均为18株，6株为1个小区，3次重复。以荔枝树施肥坑边10cm处0～20cm土层土壤混合作为1个样本，无菌袋收集后带回实验室。去除根系和动物残体，过2mm筛，用于Biolog Eco板法测定土壤微生物群落的功能多样性。

注：粉碎覆盖：用碎枝机把枝叶粉碎后均匀覆盖于树盘；清园：将所有修剪后的枝叶移走；粉碎填埋：枝叶粉粹后和有机无机肥一起混合埋施。表中肥料用量为每株荔枝的施肥量（kg/株）。下同。

注：枝叶直接覆盖是指枝叶修剪后不粉碎，直接覆盖于树盘。

1.2 测定方法

采用Biolog ECO板法。参照钱叶等^[20]的方法进行培养。（1）称5.0g新鲜土壤加入100mL灭菌离心管中，加入45mL灭菌的生理盐水（0.85%NaCl，w/v），封口。（2）25℃，暗培养，250r/min振荡60min，后静置30min。（3）按逐步稀释法，用移液器吸取5mL上清液，加入盛有45mL灭菌生理盐水的100mL离心管中，最终将土壤悬液稀释为10^-3 g/mL。（4）在超净工作台中，用移液器将制备好的土壤悬液接种到Biolog ECO板的各孔中，每孔接种量150μL。（5）将接种好的Biolog ECO板盖好盖子，放入25°C的培养箱中暗培养10d，每隔24h检测其在590和750nm波长下各孔的吸光度值（OD值）

1.3 数据处理

用Excel 2019对吸光度值数据进行预处理，计算Biolog ECO板平均颜色变化率和多样性指数等^[20]；用DPS 18.10对数据进行方差分析和相关分析，多重比较采用LSD法（P<0.05）。用Origin 2019完成主成分分析。

平均颜色变化率（AWCD值）和多样性指数 （U）的计算公式如下：

$\begin{array}{c}AWCD=\sum (C-R)/31\\ E=H/lnS\\ H=-\sum _{i=1}^N{P}_{i}ln{P}_i\\ U=\sqrt{\left(\sum n_i^2\right)}\\ D=1-\sum P_i^2\end{array}$

式中：C 为每个碳源孔590和750nm两波段光密度差值；R 为对照孔光密度值；31为ECO板供试碳源的种类数。S 为有颜色变化的孔总数目，即 C-R>0的孔总数目；N 代表碳源数，本试验用Biolog ECO板中共有31种碳源；P_i 代表第 i 个孔的OD值与总的OD值两者之间的比值；n_i 代表第 i 个孔的OD值。

2 结果与分析

2.1 化肥减施处理对平均颜色变化率的影响

平均颜色变化率（AWCD值）是反映土壤微生物碳源利用能力和土壤微生物代谢活性的重要指标，该值越大代表了土壤微生物群落代谢活性越高^[21]。由图1知，随着培养时间的延长，AWCD值呈“S”形曲线增加，可见，各处理土壤微生物利用碳源能力呈逐渐增加趋势，0～24h内AWCD值均有所增加，24～96h AWCD值增加最快，微生物的碳源利用增强，活性旺盛，120h后AWCD值增长趋于缓慢，逐渐进入平台期。确定120h为AWCD值的拐点^[22]，以该时间点的吸光度值作为进一步微生物碳源利用能力及群落多样性分析的依据。以T1～T9的AWCD值为指标，进行正交试验方差分析（表4），结果发现，根据极差R大小分析3个因素对AWCD值的影响排序为无机肥> 枝叶还田方式> 有机肥。枝叶还田方式、有机肥和无机肥施用的最优水平分别是枝叶粉碎覆盖、豆饼1.5kg、复合肥1.0kg，即T3处理为各因素的最优水平组合，但考虑枝叶还田方式和有机肥施用的互作影响，影响AWCD值的最优处理是T2处理[枝叶粉碎后覆盖、有机肥用量最多（羊粪20kg）、无机肥减施（磷肥投入最多）]。AWCD值最低的是T9处理[枝叶粉碎填埋、有机肥用量最少（豆饼1.5kg）、无机肥最少（磷肥投入最少）]，与T2呈显著差异；其他处理（T1、T3～T8）间无显著差异。为了解化肥减施的正交试验设计处理 （T1～T9）和果农习惯施肥处理（T0）的差异，以整个年度生长周期内不同施肥处理作为单因素统计（下同）。对T0～T9的AWCD值进行单因素方差分析，发现相对果农习惯施肥处理（T0），T2的AWCD值最高，呈显著差异，而其他化肥减施处理（T1、T3～T9）的AWCD值与T0差异不显著 （图2）。可见，枝叶粉碎后覆盖、有机肥用量最多 （羊粪20kg）、无机肥减施（磷肥投入最多）的处理（T2）土壤微生物碳源利用能力显著高于果农习惯施肥处理，且其他化肥减施处理间无显著差异。

注：k_i 为各因素在i水平的均值，R是极差值。表中结果为均值 ± 标准差，同列数值后不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

注：柱上不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。下同。

2.2 土壤微生物利用不同碳源的变化特征

Biology ECO板中31种碳源分为六大类，即糖类（10种）、氨基酸类（6种）、羧酸类（7种）、胺类（2种）、酚酸类（2类）和聚合物类（4种）。比较研究不同施肥处理下土壤微生物在吸光度变化拐点120h对六大类碳源的利用特征，发现不同施肥处理下土壤微生物对糖类、氨基酸类、胺类和聚合物类碳源的利用能力相对较高，而对羧酸类和酚酸类碳源的利用能力较低。各处理分别在氨基酸类和羧酸类碳源的利用能力无显著差异。可见，不同施肥处理微生物功能多样性的区别在于对糖类、胺类、酚酸类和聚合物类4类碳源利用的差异。在对糖类碳源利用上，T2和T3的利用能力较高，T0、 T7、T8、T9这4个处理对糖类碳源的利用能力与之相比较低，呈显著差异；对胺类碳源利用上，T0的利用能力最低，T1、T2、T4～T7、T9利用能力较高，与T0呈显著差异；在对酚酸类碳源利用上， T1和T3的利用能力较高，而T0、T4、T5、T6、T9这5个处理与之相比对酚酸类碳源利用的能力较低，呈显著差异；在对聚合物类碳源利用上，T7的利用能力最高，T5的利用能力最低，与之呈显著差异。

2.3 不同施肥处理土壤微生物群落多样性指数分析

由表5可知，T2的McIntosh多样性指数最高， T9的最低，且T0和T9的McIntosh多样性指数显著低于T2。T1的Shannon-wiener均匀度指数最高，T0的最低，且T2和T0的Shannon-wiener均匀度指数显著低于T1。T6的Simpson优势度指数最高，T0最低，且T0、T8和T9的Simpson优势度指数显著低于T6。各施肥处理土壤微生物群落的Shannon-wiener丰富度指数无显著差异。

2.4 土壤理化性质与土壤微生物群落对碳源利用及多样性的相关性

为了解不同施肥处理后土壤的理化性质与土壤微生物群落对碳源利用及其多样性的关系，本研究分析了土壤pH、有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾与对单糖/糖苷/聚合糖类、氨基酸类、酯类、醇类、胺类、酸类利用及AWCD值、 McIntosh多样性指数、Shannon-wiener丰富度指数、Shannon-wiener均匀度指数、Simpson优势度指数的相关性，发现有效磷与微生物对氨基酸类碳源的利用和McIntosh多样性指数呈显著正相关 （P<0.05）（表6）。

2.5 不同施肥处理土壤微生物群落碳源利用的主成分分析

利用培养120h测定的吸光值，对不同施肥处理土壤微生物对31种碳源利用进行主成分分析。根据累计方差贡献率85%以上的原则，提取了11个主成分，累计贡献率为86.05%。其中第1主成分的方差贡献率为21.81%，第2主成分为14.93%，第3～11主成分贡献率均较小，分别为8.20%、8.03%、6.86%、6.19%、5.25%、4.33%、 3.90%、3.53%、3.01%。由图4可知，T1～T4依次在PC1正轴分布，T7、T8、T5和T6依次在PC2正轴分布，T9和T0分别在PC1和PC2负轴分布，推测主成分分析中枝叶还田类型对其影响较大。分析PC1和PC2中相关性较高（|r|>0.2）的19个碳源（表7），发现糖类和羧酸类在PC1中的权重较大，而糖类、氨基酸类和羧酸类在PC2中的权重较大。这与2.2中不同处理对6类碳源类型利用的分析结果基本一致，即不同施肥处理土壤微生物功能多样性的区别主要在于对糖类碳源利用的差异。

注：* 表示P<0.05。

3 讨论与结论

3.1 无机肥是影响荔枝园土壤微生物功能多样性的主要因素

施肥制度对土壤微生物功能多样性的影响较大，添加粪肥、植物残体等有机肥可维持土壤肥力和微生物系统的稳定，微生物群落多样性是反映土壤质量的重要指标^[23-25]。土壤微生物群落碳源代谢强度和代谢类型的变化能较早预测土壤养分的变化趋势，被认为是预测土壤质量变化最有潜力的敏感性生物指标^[26]。Biolog方法能获得微生物群体的总体活性与代谢功能^[27]。本研究为探讨枝叶还田方式、化肥减施和配施有机肥3个因素对荔枝园土壤微生物多样性的影响，在荔枝采后第一次施肥时采用L₉（3⁴）正交试验设计，枝叶还田方式、有机肥和无机肥种类及用量3个因素设3个水平，利用Biolog方法进行研究。AWCD值反映了土壤微生物群落碳源代谢能力的高低，是土壤微生物活性和多样性大小的一个重要指标^[28]。本研究以培养120h时T1～T9的AWCD值为指标进行正交试验方差分析，3个因素对AWCD值的影响表现为无机肥> 枝叶还田方式> 有机肥，考虑枝叶还田方式与有机肥施用的互作影响，最优方案是T2处理[枝叶粉碎后覆盖、有机肥用量最多（羊粪20kg）、无机肥减施（磷肥投入最多）]。AWCD值最低的是T9处理[枝叶粉碎填埋、有机肥用量最少（豆饼1.5kg）、无机肥最少（磷肥投入最少）]。本研究采用正交试验设计，获得了集成枝叶还田方式、化肥减施和配施有机肥的较优施肥处理。

3.2 磷肥的合理施用促进土壤微生物功能多样性

施肥措施是影响土壤微生物群落的重要因素，合理的施肥措施能显著促进土壤微生物代谢活性，提高土壤微生物多样性^[8]。本研究发现，化肥减施处理T2的AWCD值和McIntosh多样性指数最大，而T9和T0的AWCD值和McIntosh多样性指数最小，可见T2处理土壤中微生物群落对31种碳源的代谢能力最强，多样性指数也最高。施肥处理中T2的有机肥用量、有机无机肥中总磷施用量是最高的，而T9和T0中有机肥用量、有机无机肥中总磷施用量较低，这可能是导致微生物碳源利用能力和多样性呈显著差异的原因。进一步相关性分析发现，土壤中有效磷与微生物对氨基酸类碳源的利用和McIntosh多样性指数呈显著正相关（P<0.05）。高明霞等^[29]认为施磷处理（磷钾、氮磷和氮磷钾）对微生物代谢活性具有较大的促进作用。长期不同化肥处理土壤微生物的碳源利用能力和类型出现显著差异，氮磷养分的差异是产生分异的主要原因，其中磷肥是引起差异的主要原因。张逸飞等^[30]也发现施磷后土壤酶活性、微生物功能多样性大于未施磷的土壤，与本研究结果一致。

尽管Biolog方法能得到很大的微生物代谢功能信息量，但无法得到微生物群落结构的信息。因此，我们仅通过此方法分析不同化肥减施处理下微生物活动与碳代谢功能，而不考虑微生物类群的变化，尤其与土壤碳氮比等理化性质密切相关的土壤微生物真菌细菌比的变化。下一步，可考虑借助高通量测序等分子生物学手段研究不同化肥减施措施间微生物群落结构的多样性。

综上，不同化肥减施处理对荔枝园土壤微生物功能多样性的影响不同。不同施肥处理微生物功能多样性的区别在于对糖类、胺类、酚酸类和聚合物类4类碳源利用的差异。枝叶粉碎覆盖、增施有机肥、高磷肥的化肥减施处理（T2）较果农习惯施肥处理（T0）显著提高了土壤微生物群落的碳源利用能力和多样性。从土壤微生物功能的多样性角度分析，T2是较为合理的化肥施肥处理，该结果可为当地荔枝园化肥减施提供理论依据。

参考文献