磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，参与植物体内光合作用、能量代谢、酶促反应和信号传导等过程^[1]。然而，土壤中的磷酸盐容易被铁铝氧化物和氢氧化物以及Ca²⁺ 吸附，形成难溶性化合物，导致土壤中的有效磷含量很难满足植物正常的生长需求^[2]。在农业生产中，为提高农作物产量，大量的磷肥被施入农田。但是过量的、不合理的磷肥施用，导致磷肥利用率降低、磷矿资源日渐枯竭和环境污染等一系列问题^[3-5]。绿肥通过吸收和活化土壤中的矿物质为作物提供养分，其还田后能有效提高土壤肥力、降低肥料用量和改善土壤质量^[6]。绿肥是生态农业的重要组成部分，发展绿肥产业符合绿色发展理念，对于推动化肥减量增效、提升耕地质量和促进农业可持续发展有着重要意义^[7]。当前绿肥作物的研究热点集中在绿肥养分释放规律、绿肥专性根瘤菌以及绿肥环境效益评价等方面。总体来说，绿肥作物研究侧重于氮素养分方面，对磷素养分方面的关注较少。

毛叶苕子（Vicia villosa）是三大豆科绿肥作物之一，具有地域适应性强、产草量高、营养价值高等特点，且其根瘤具有固氮作用。毛叶苕子在田间腐解速度快，在翻压112d后其植株中的氮、磷和钾释放量分别可达其总量的91.8%、95.1%和90.0%^[8-10]，毛叶苕子还田能显著提高土壤肥力，但是毛叶苕子对磷肥敏感，吸收利用土壤中难溶性磷酸盐的能力较差^[11]。因此，挖掘毛叶苕子高效利用磷的潜力，选育耐低磷、磷高效的品种，对减少磷肥施用量和促进农业可持续发展具有重要意义。

筛选和应用耐低磷和磷高效品种，是提高作物磷素利用效率的有效途径之一^[12-13]。已有研究表明，植物耐低磷品种的筛选评价指标有很多，如生物量^[14]、根长^[15]、酸性磷酸酶活性^[16]、磷累积量^[17]等。然而，目前植物耐低磷品种的筛选及耐低磷相关生理特性的研究主要集中在水稻^[18]、玉米^[16]、大豆^[19]、苜蓿^[20]和紫云英^[21]等植物上，有关毛叶苕子耐低磷品种的筛选则少有报道。故本研究采用水培试验的方法，分析22个毛叶苕子品种在正常供磷和低磷胁迫下的主根长、株高、地上部干重、根系干重、地上部全磷含量和磷累积量的差异，通过各指标权重和磷效率综合值，确立毛叶苕子品种磷素利用的评价指标体系，评估毛叶苕子品种的耐低磷特性并划分不同磷效率类型。进一步挑选2个耐低磷及2个低磷敏感品种进行盆栽试验，验证水培筛选结果的可靠性。本文旨在筛选出耐低磷且磷高效的品种，优化筛选指标，为选育毛叶苕子磷高效品种和研究绿肥作物耐低磷胁迫的生理机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为生长在中国北方的22个毛叶苕子品种（新疆毛苕、1399毛苕、内毛叶苕、徐苕2号、特早熟毛苕、徐苕1号、81-244毛苕、法国毛苕、沪3-1毛苕、78-103毛苕、关中毛苕、苏联苕子、74-60毛苕、葡萄牙苕子、徐苕3号、 81-84毛苕、78-171毛苕、山东早熟苕、81-243毛苕、81-245毛苕、青苕1号、土库曼毛苕），由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所曹卫东研究员提供。

供试土壤为轻质潮土，采于中国农业科学院德州盐碱土改良实验站禹城试验基地（36°49′ N， 116°34′ E）中未施磷肥的试验地。其基本理化性质：全氮1.07g/kg，有效磷3.7mg/kg，速效钾206.70mg/kg，有机质8.93g/kg，pH 7.61。

1.2 试验方法

耐低磷品种的筛选试验于2020年进行。筛选试验设置2个处理：1）正常磷（NP，200 μmol/L Pi），2） 低磷（LP，2 μmol/L Pi），每个处理重复3次。在智能光照培养箱（型号：PRX-1000DLED-30）中，采用漂浮育苗的方法，在Hoagland改良营养液中进行培养，营养液pH统一调为6.3±0.1，试验每隔3d更换1次营养液。具体步骤如下：1）称取0.3～0.4g饱满的毛叶苕子种子，用75%的酒精消毒后晾干，置于含有纱布的培养皿中，在25℃光照培养箱中进行催芽；2）待胚根露出3cm后，移至1/2Hoagland营养液中培养7d，再移至不同磷浓度（NP，200 μmol/L Pi；LP，2 μmol/L Pi）的营养液中培养；3）连续处理14d后分别测定正常磷和低磷条件下毛叶苕子的主根长、株高、地上部干重、根系干重和地上部全磷含量。光照培养箱条件为：12h光照，25℃，光照强度30000LX；12h黑暗，22℃；60%湿度。正常磷条件下营养液组分为1.3mmol/L NH₄NO₃、0.19mmol/L K₂SO₄、200 μmol/L NaH₂PO₄·2H₂O、0.37mmol/L CaCl₂·2H₂O、0.38mmol/L MgSO₄·7H₂O、 50 μmol/L H₃BO₃、10 μmol/L MnCl₂·4H₂O、 0.76 μmol/L ZnSO₄·7H₂O、0.32 μmol/L CuSO₄·5H₂O、 0.016 μmol/L（NH₄）₆MO₇O₂₄·4H₂O、77 μmol/L Na₂Fe-EDTA。低磷处理营养液中NaH₂PO₄·2H₂O为2μmol/L，其余养分含量与正常磷处理相同。

盆栽试验于2021年进行。将备好的营养液作为基肥添加到低磷土壤中，添加量如下：50mg/kg N，100mg/kg K₂O。试验采用双因素随机区组试验设计，设置两个磷水平：1）正常磷（NP，添加200mg/kg P₂O₅），2） 低磷（LP，添加0mg/kg P₂O₅）；4个毛叶苕子品种，5次重复，共种植40盆，试验于温室进行。具体步骤如下：1）土壤经过风干后过2mm土筛，过筛后混合均匀，每盆放入2kg风干土；2）每盆土浇灌含氮、磷、钾养分的营养液800mL[NP处理：0.2g CO（NH₂）₂、0.4g K₂SO₄、2g CaH₂PO₄；LP处理：0.2g CO（NH₂）₂、 0.4g K₂SO₄]，使营养液完全浸润土壤；3）毛叶苕子种子放于培养箱进行催芽；4）每盆种植5株长势一致的毛叶苕子，并于表面覆盖100g干土； 5）种植30d后分别测定正常磷和低磷条件下毛叶苕子的株高、地上部干重和地上部全磷含量。试验期间，土壤含水量保持在田间持水量的20%左右。

1.3 测定指标

取不同供磷条件下水培培养14d的毛叶苕子幼苗，每组取10株植株测量株高及主根长；取毛叶苕子根和地上部，105℃下杀青30min，80℃烘干至恒重后，分别称量地上部及根干重，并计算根冠比；采用H₂SO₄-H₂O₂ 消煮法和钼锑抗比色法测定毛叶苕子地上部全磷含量^[22]。

取盆栽条件下培养30d的毛叶苕子植株，每组取5株植株进行株高、地上部干重和全磷含量的测定。

涉及公式如下：

耐低磷系数=低磷处理下某性状测定值/正常磷处理下某性状测定值；

根冠比=根系干重/地上部干重；

地上部磷累积量=地上部干重 × 地上部全磷含量；

地上部磷利用率=地上部干重/地上部磷累积量^[23]。

1.4 指标权重计算公式

$\begin{array}{c}{W}_j=\left(W_j^{*}/\sum _{j=1}^7{W}_j^{*}\right)\times 100\\ W_j^{*}=\sum _p^3\left|W_{jp}^{*}\right|\times F_p(p=\mathrm{1,2},3,\cdots ,10)\end{array}$

式中：W_j 为指标权重；$W_j^{*}$为权重分配系数；F_p 为主成分 p 的方差贡献率占总贡献率的比重^[13]。

1.5 磷效率综合值计算

利用隶属函数法^[24-25]，以磷效率综合值^[26] 来表示不同供磷条件下不同毛叶苕子品种的磷素营养状况^[13]。隶属函数值计算：

${\mathrm{U}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}=\left({\mathrm{X}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}-{\mathrm{X}}_{\mathrm{j}min}\right)/\left({\mathrm{X}}_{\mathrm{j}max}-{\mathrm{X}}_{\mathrm{j}min}\right)$

式中，U_ij 表示i品种j评价指标磷效率隶属函数值；X_ij 表示i品种j评价指标的综合值；X_{j min}、 X_{j max} 分别表示j综合评价指标的最小、最大综合值。

各综合指标权重：

${\mathrm{W}}_{\mathrm{j}}={\mathrm{r}}_{\mathrm{j}}/\sum {\mathrm{r}}_{\mathrm{j}},\mathrm{j}=\mathrm{1,2},3,\cdots ,\mathrm{n}$

式中，W_j 表示第j个综合评价指标在所有综合评价指标中的重要程度，即权重；r_j 表示各基因型第j个综合指标的贡献率。

磷效率综合值计算：

$\mathrm{D}=\sum _{j=1}^n\left[{\mathrm{U}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}\times {\mathrm{W}}_{\mathrm{j}}\right](\mathrm{j}=\mathrm{1,2},3,\cdots ,\mathrm{n})$

式中，D表示不同毛叶苕子品种的磷效率综合值。

1.6 数据分析

用Excel 2019和SPSS 22进行数据处理，利用最大方差正交旋转法进行主成分分析，运用Rstudio和GraphPad Prism 8进行聚类热图分析，并绘制散点图和柱形图。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫对不同毛叶苕子品种苗期性状的影响

如表1所示，毛叶苕子株高的耐低磷系数变化范围为0.55～0.95，所有品种都小于1；地上部干重的耐低磷系数变化范围为0.41～1.23，其中有17个品种小于1，这说明低磷胁迫明显降低了毛叶苕子的地上部干重和株高。根冠比和根系干重的耐低磷系数变化范围分别为0.66～3.22和0.46～1.61，其中分别有15个和11个品种大于1，这表明了低磷胁迫可以促进毛叶苕子的根系生长；主根长的耐低磷系数变化范围为0.44～1.18，其中仅仅有2个品种大于1；地上部全磷含量和磷累积量的耐低磷系数均小于1，变化范围分别为0.19～0.91和0.09～0.91。

如表2所示，在低磷条件下，变异系数表现为地上部磷累积量> 地上部干重> 根系干重> 根冠比> 地上部全磷含量> 主根长> 株高；在正常磷条件下，变异系数表现为地上部磷累积量> 地上部全磷含量> 地上部干重> 根冠比> 根系干重> 主根长> 株高。综合分析，不同供磷水平下，地上部干重和地上部磷累积量的变异系数较大，在不同品种间存在显著性差异。因此，初步选择这2个指标作为筛选毛叶苕子耐低磷品种的评价指标。

2.2 毛叶苕子苗期各性状的主成分分析

对上述7个指标的耐低磷系数进行主成分分析，利用最大方差正交旋转法提取3个主成分，其贡献率分别为37.612%、24.701%和16.490%（表3）。其中第1主成分的特征值为2.633，对应较大的特征向量是地上部全磷含量和地上部干重；第2主成分特征值为1.729，载荷较高的是地上部磷累积量和根系干重；第3主成分特征值为1.154，载荷较高的是主根长和株高。将7个单项指标转化为3个相互独立的综合指标，这些综合指标可以代表原始指标78.803%的信息。分析各指标权重发现，地上部干重和磷累积量这2个指标的权重较大，因此选用这2个指标作为毛叶苕子耐低磷能力的评价指标，这与通过变异系数筛选出的指标相一致。

注：不同小写字母表示同一指标在不同处理间差异显著（P<0.05）。

2.3 毛叶苕子耐低磷品种筛选及其磷效率类型评价

2.3.1 不同毛叶苕子品种的聚类分析

将不同供磷水平下毛叶苕子的地上部干重和磷积累量进行标准化后，采用平方欧式距离法将22个毛叶苕子品种聚类划分为3类：A类属于低磷敏感型品种，包括81-245毛苕、青苕1号、苏联苕子和毛苕74-60，其地上部干重和磷积累量在不同供磷条件下均偏低；B类属于中间型品种，有12个，表现出地上部干重和磷积累量在不同供磷条件下处于中等水平；C类属于耐低磷型品种，分别为徐苕3号、法国毛苕、78-171毛苕、山东早熟苕、沪3-1毛苕和78-103毛苕，其地上部干重和磷累积量在不同供磷条件下均较高（图1）。

2.3.2 不同毛叶苕子品种的磷效率类型评价

根据磷效率综合值，将不同基因型的毛叶苕子分成4类（图2）：第Ⅰ类属于正常磷低效低磷高效型（低磷高效型），有5个品种；第Ⅱ类属于正常磷高效低磷高效型（双高效型），包括徐苕3号、法国毛苕、徐苕2号、沪3-1毛苕、特早熟毛苕和山东早熟苕；第Ⅲ类属于正常磷低效低磷低效型（双低效型），包括葡萄牙毛苕、苏联苕子、 81-243毛苕、新疆毛苕、青苕1号、内毛叶苕、关中毛苕、81-84毛苕和81-245毛苕；第Ⅳ类属于正常磷高效低磷低效型（正常磷高效型），包括毛苕74-60和78-171毛苕。

2.4 不同供磷水平对盆栽毛叶苕子苗期性状的影响

挑选耐低磷品种（法国毛苕、徐苕3号），低磷敏感品种（81-245毛苕、青苕1号）进行不同供磷水平下的盆栽试验。如图3A和B所示，同一供磷水平下，不同毛叶苕子品种地上部长势差异明显，而耐低磷品种的株高在不同供磷水平下无显著差异。在正常磷及低磷胁迫条件下，法国毛苕的株高较青苕1号分别增加16.54%和22.83%，这表明青苕1号受到低磷胁迫的抑制作用较大，对低磷处理较敏感。如图3C所示，与低磷条件相比，在正常磷条件下，徐苕3号和法国毛苕的地上部干重分别增加了60.80%和62.83%，青苕1号和81-245毛苕的地上部干重分别增加了41.34%和56.01%。在正常磷条件下，徐苕3号和法国毛苕的地上部干重较青苕1号分别高44.15%和55.30%，这表明徐苕3号和法国毛苕在养分充足时能高效利用磷养分。如图3D所示，在正常供磷条件下，法国毛苕和徐苕3号的地上部磷累积量显著高于青苕1号和81-245毛苕，而在低磷条件下，各品种间地上部磷累积量没有显著差异，这表明徐苕3号和法国毛苕有较强吸收磷素的能力。如图3E可知，与正常磷相比，低磷胁迫会提高植物的磷利用率，法国毛苕和徐苕3号在低磷条件下的地上部磷利用率分别增加了64.39%和68.64%，青苕1号和81-245毛苕的地上部磷利用率分别增加了62.87%和51.35%。在低磷条件下，徐苕3号和法国毛苕的磷利用率较青苕1号分别高出40.99%和25.29%。综上，法国毛苕和徐苕3号属于磷高效型品种，青苕1号和81-245毛苕属于磷低效型品种，该结果也证明了利用地上部干重和磷累积量对不同毛叶苕子品种的筛选评价是有效且可信的。

注：LP-SDW为低磷胁迫下地上部干重；LP-SPA为低磷胁迫下地上部磷累积量；NP-SDW为正常供磷条件下地上部干重；NP-SPA为正常供磷条件下地上部磷累积量。

注：不同小写字母表示在同一处理下不同品种差异显著（P<0.05）。

3 讨论

植物的生命活动离不开磷素，低磷胁迫会阻碍植物的生长发育，降低植物的净光合速率，从而出现植株生长迟缓、矮小，地上部生物量减少和全磷含量降低等现象^[20，27-31]。植物根系是吸收养分的主要器官，所以在应对低磷胁迫时植物通常采用增加根冠比、促进主根生长和刺激侧根发育等策略来扩大吸收磷的表面积，以吸收更多的磷^[32]。低磷胁迫对耐低磷小麦的长势、地上部干重影响较小，而对磷敏感材料的生长抑制作用较大^[33]。所以植株形态、地上部干重、生物量分配和全磷含量等指标对揭示品种间耐低磷特性具有重要意义。曾进等^[23] 通过测定地上部干重、根系干重、根冠比、地上全磷含量及磷积累量等14个指标筛选出耐低磷油茶，刘允熙等^[34]利用干重和全磷含量筛选出磷高效型柱花草。因此本研究选用主根长、株高、地上部干重、根系干重、地上部全磷含量和磷累积量作为毛叶苕子筛选的评价指标。在不同磷浓度条件下，毛叶苕子的生长发育发生了一系列变化（表1），低磷胁迫降低了毛叶苕子的株高、地上部干重、地上部全磷含量和磷累积量，增加了根冠比，而对不同毛叶苕子品种的主根长和根干重有抑制或促进两种不同影响，可能的原因是低磷对不同毛叶苕子品种根系发育的影响程度不同，这与禾本科植物在低磷条件下的响应相一致^[35]。

由于植物应对低磷胁迫是由多个基因参与的，为避免采用单一指标无法准确反映植物耐低磷特性，本文通过主成分分析将7个毛叶苕子筛选指标转化为3个综合指标，并分析各指标权重，发现地上部干重和磷累积量的权重较大（表3）。此外本研究也发现毛叶苕子在不同供磷水平下，地上部干重和磷累积量的变异系数较大，在不同品种间存在显著差异（表2）。结合苑乂川等^[35]、刘允熙等^[34]和龚丝雨等^[13]采用低磷胁迫时的生物量和磷累积量等指标作为植物耐低磷能力评价的标准，最终确定地上部干重和磷累积量可作为毛叶苕子耐低磷的评价指标。

植物磷效率包含两种含义，一种是在低磷条件下植物能够利用有限的磷养分维持正常生长的能力，即耐低磷；另一种是在正常供磷条件下，植物吸收磷素并转化为干物质的能力，即磷高效^[36]。本文对耐低磷评价指标进行聚类分析，将22个毛叶苕子品种对低磷胁迫的耐受性划分为低磷敏感型，中间型和耐低磷型3类（图1）。已有研究表明水稻^[18]、玉米^[16]和大豆^[19]等作物不同基因型品种的磷素利用效率存在显著差异，本研究依据磷效率综合值，将22个毛叶苕子品种的磷效率类型划分为正常磷高效低磷高效型（双高效型）、正常磷低效低磷低效型（双低效型）、正常磷高效低磷低效型和正常磷低效低磷高效型4类（图2）。综合耐低磷品种的聚类分析与磷效率类型划分结果表明：1）在耐低磷型品种中，有4个双高效型品种（徐苕3号、法国毛苕、沪3-1毛苕和山东早熟苕）；2）在不耐低磷型品种中，有3个双低效型品种（81-245毛苕、青苕1号和苏联苕子）。耐低磷能力强的品种在磷素供应不足时能维持正常生长，如磷高效且耐低磷型的玉米表现出较强的吸收磷素的能力，并能对体内的磷进行有效分配，磷利用效率高，在低磷条件下仍能保持较高的生物量^[37]。本文盆栽试验结果也表明，在正常磷处理下，磷高效品种徐苕3号和法国毛苕的株高、地上部干重和地上部磷累积量均显著高于磷低效品种青苕1号和81-245毛苕；在低磷胁迫下，耐低磷品种徐苕3号和法国毛苕的地上部干重和磷利用率显著高于低磷敏感品种青苕1号和81-245毛苕 （图3）。

4 结论

本研究对22个毛叶苕子品种进行耐低磷性及磷效率的筛选和评价，综合低磷筛选指标的聚类分析及磷效率类型的评价结果，最终筛选出徐苕3号、法国毛苕、沪3-1毛苕和山东早熟苕为耐低磷且磷高效型品种，81-245毛苕、青苕1号和苏联苕子为低磷敏感且磷低效品种。地上部干重和磷累积量可作为苗期筛选耐低磷毛叶苕子品种的参考指标。

参考文献