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甲壳素（Chitin）是地球上数量仅次于纤维素的天然有机化合物，是地球上数量最大的含氮有机化合物[1]，主要存在于节肢动物，如虾、蟹、昆虫等的外壳，软体动物如乌贼等的内壳及软骨中，被称之为动物纤维素[2-3]。壳聚糖（Chitosan，CTS）化学名称为β-1，4-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，又称脱乙酰甲壳素、甲壳胺、壳多糖、可溶性甲壳素等，是甲壳素脱乙酰基后得到的衍生物[4]。脱乙酰度（DD）反映了线性分子链上的氨基含量，一般而言，甲壳素DD值大于55%就可称之为壳聚糖[1]。
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壳聚糖是自然界天然多糖中大量存在的唯一碱性氨基多糖，具有优异的生物相容性、良好的生物降解性以及多种生物活性等优点[2]，被认为是最有前途的功能性生物聚合物之一[5]，已在生物医学[6-8]、食品工业[9-10]、水处理[11-12]以及农业[13-20]等领域显示出其广阔的开发应用前景。由于壳聚糖能够促进作物生长发育、改善作物品质、提高作物抗逆性[14-16]，因此以现代生物技术分解、提取得到的壳聚糖为原料制成的肥料及其研究应用也逐渐引起了人们的关注[21-22]。
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目前，测定壳聚糖的方法有高效液相色谱法[23-26]、分光光度法[27-28]、毛细管电泳法[29-30]、红外光谱法[31-32]、气相色谱法[33]、共振瑞利散射法[34]等。其中，高效液相色谱法是测定壳聚糖的一种主流分析方法，该方法通常是先用酸把壳聚糖水解为氨基葡萄糖，然后用衍生试剂进行衍生，最后用液相色谱技术对衍生产物进行分析；分光光度法虽然可以作为壳聚糖的一种定量方法，但是它在测定过程中干扰因素较多，导致检测结果准确性不高、稳定性较差；其他方法通常只是测定壳聚糖的脱乙酰度，并没有对壳聚糖进行定量分析，或者仅适用于试剂、药品等基质简单的样品检测[29，31，34]。以上方法中仅有分光光度法[27]应用于肥料中壳聚糖含量测定的报道，但该方法并没有对壳聚糖水解条件进行研究分析。本研究以盐酸溶液作为壳聚糖的水解介质，建立了高效液相色谱法和分光光度法测定水溶肥料中壳聚糖含量的不同分析方法。
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1 材料与方法
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1.1 方法原理
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1.1.1 高效液相色谱法
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壳聚糖经盐酸水解生成氨基葡萄糖，氨基葡萄糖用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行衍生，萃取除去过量PMP后，衍生物经高效液相色谱分离，用紫外检测器检测，外标法测定。
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1.1.2 分光光度法
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壳聚糖经盐酸水解生成氨基葡萄糖，氨基葡萄糖在碱性条件下与乙酰丙酮缩合形成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物。生色原与对二甲氨基苯甲醛在酸性条件下反应生成紫红色化合物，在波长525nm处测定其吸光度，在一定浓度范围内，该化合物的吸光度与氨基葡萄糖浓度成正比，由此可以用分光光度法测定。
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1.2 试剂
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所用试剂和溶液的配制，在未注明规格和配制方法时，均按HG/T3696规定执行。高效液相色谱法用水为超纯水，分光光度法用水为三级去离子水。
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乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；三氯甲烷；浓盐酸；氨基葡萄糖盐酸盐标准品；无醛乙醇（95%以上）；乙酰丙酮；壳聚糖1（脱乙酰度80%～95%）；壳聚糖2（脱乙酰度大于95%）。
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盐酸溶液（1+1）：盐酸与水体积比为1∶1。
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盐酸溶液（0.3mol/L）：量取盐酸27mL，再加水稀释至1L。
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盐酸溶液（8mol/L）：量取盐酸680mL，再加水稀释至1L。
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氢氧化钠溶液（10mol/L）：称取氢氧化钠400g，先用少量水溶解后，再加水稀释至1L。
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氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取氢氧化钠40g，先用少量水溶解后，再加水稀释至1L。
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氢氧化钠溶液（0.3mol/L）：称取氢氧化钠12g，先用少量水溶解后，再加水稀释至1L。
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PMP甲醇溶液（0.5mol/L）：称取8.71g PMP，用甲醇溶解后，转移至100mL容量瓶中用甲醇定容。
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磷酸二氢钾溶液（0.1mol/L）：采用超纯水配制，调节pH至6.7，过0.45 μm水系微孔滤膜后备用（现用现配）。
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碳酸钠溶液（0.5mol/L）：称取碳酸钠53g，置于500mL烧杯中，用水溶解后，转移至1000mL容量瓶中用水定容。
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乙酰丙酮溶液：移取乙酰丙酮2.0mL，用碳酸钠溶液（0.5mol/L）定容至50mL，于冰箱中放置过夜。
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对二甲氨基苯甲醛溶液：称取对二甲氨基苯甲醛0.8g，溶于无醛乙醇15mL及浓盐酸15mL中，混匀（现用现配）。
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氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液（1.00g/L）：称取氨基葡萄糖盐酸盐0.100g，置于100mL烧杯中，用水溶解后，转移至100mL容量瓶中用水定容。
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氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液（20.0 μg/mL）：移取氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液（1.00g/L）2.00mL至100mL容量瓶中，用水定容（现用现配）。
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1.3 仪器
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2695高效液相色谱仪，配紫外检测器（美国Waters公司）；TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），配1cm比色皿； AE 100S型电子分析天平（瑞士梅特勒公司，精度0.0001g）；SevenMulti pH计[梅特勒-托利多仪器 （上海）有限公司]；PH-240A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SWB3D数字控温水浴锅（Bibby Scientific有限公司）；SK8200HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；微孔滤膜 （水系和有机系，0.45 μm）。
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1.4 供试样品
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样品来源于肥料生产企业的肥料产品。
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1.5 样品前处理
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1.5.1 试样的制备
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将固体样品采用四分法缩分至约100g，将其迅速研磨至全部通过0.50mm孔径试验筛（如样品潮湿，可通过1.00mm孔径试验筛），混合均匀，置于洁净、干燥的容器中；液体样品经摇动均匀后，迅速取出约100mL，置于洁净、干燥的容器中。
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1.5.2 试样溶液的制备
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称取混合均匀的0.5～1g固体试样或5～10g液体试样（精确至0.0001g，以含壳聚糖200～400mg为佳），置于100mL容量瓶中，先加入1.0mL浓盐酸，然后加入水溶解后定容。移取1.00mL溶液至水解管中，加入1.0mL浓盐酸和8.0mL盐酸溶液（1+1），封管后于100℃水解24h。水解完成后，转移至烧杯中，加入氢氧化钠溶液（10mol/L） 6mL后用盐酸溶液（0.3mol/L）和氢氧化钠溶液 （0.3mol/L）调节pH至7.0，然后转移至100mL容量瓶中，用水定容。
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1.5.3 衍生化（高效液相色谱法）
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吸取试样溶液0.50mL于具塞试管中，加入0.50mL氢氧化钠溶液（0.3mol/L）和0.50mL PMP甲醇溶液（0.5mol/L），盖塞混匀后，置于70℃恒温水浴中反应70min，取出后冷却至室温，加入0.50mL盐酸溶液（0.3mol/L）中和。用4mL三氯甲烷萃取，弃去有机相（下层）。重复萃取3次，将得到的上层溶液过0.45 μm有机系微孔滤膜后待测。
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1.6 仪器条件（高效液相色谱法）
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色谱柱：SunFire C18（150mm×4.6mm，粒径5 μm）；流动相：乙腈 + 磷酸二氢钾溶液（0.1mol/L，pH 6.7）=18+82；流速：1.0mL/min；柱温： 25℃；进样量：20 μL；检测波长：250nm。
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1.7 标准曲线的绘制
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1.7.1 高效液相色谱法
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分别吸取氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液（1.00g/L） 0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00和5.00mL于7个100mL容量瓶中，用水定容。该标准系列溶液氨基葡萄糖盐酸盐的质量浓度分别为0、5.0、10.0、 20.0、30.0、40.0和50.0mg/L。分别吸取上述标准溶液各0.50mL于7个具塞试管进行衍生化反应，按浓度由低到高进样检测，以标准系列溶液氨基葡萄糖盐酸盐的质量浓度（mg/L）为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
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1.7.2 分光光度法
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分别移取氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液（20.0 μg/mL）0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL置于7个具塞试管中，用水补充至5.00mL，该标准系列溶液含氨基葡萄糖盐酸盐的量分别为0、10.0、 20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg。分别加入乙酰丙酮溶液1.00mL，混匀，置于沸水浴中（1min后盖塞）放置25min，取出，用冰水迅速冷却至室温，加入无醛乙醇3.00mL，再加入对二甲氨基苯甲醛溶液1.00mL，混匀，于60℃水浴中（5min后盖塞） 放置1h，取出立即用冷水冷却至室温，在波长525nm处，用1cm比色皿进行比色，以含氨基葡萄糖盐酸盐0 μg的标准溶液调零，读取吸光度。以标准系列溶液含氨基葡萄糖盐酸盐的质量（μg）为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
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1.8 试样溶液的测定
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1.8.1 高效液相色谱法
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将待测液在与测定标准系列溶液相同的条件下测定，在标准曲线上查出相应试样溶液中氨基葡萄糖盐酸盐的质量浓度（mg/L）。
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1.8.2 分光光度法
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准确移取试样溶液1.00～5.00mL（含氨基葡萄糖盐酸盐10～100 μg）置于具塞试管中，用水补充至5.00mL，在与测定标准系列溶液相同的条件下显色、比色，以空白实验溶液调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应氨基葡萄糖盐酸盐的质量（μg）。在测定过程中，若试样溶液在加入显色剂之前有颜色，则应于另一具塞试管中，加入相同体积的试样溶液，除显色阶段用1.00mL盐酸溶液 （1+1）代替对二甲氨基苯甲醛溶液外，其余操作相同，测定吸光度，计算时扣除该吸光度。
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2 结果与分析
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2.1 实验条件的确定
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2.1.1 壳聚糖水解条件
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壳聚糖一般采用盐酸水解，盐酸浓度越高，水解温度越高，水解速度越快，但同时对水解产物氨基葡萄糖的破坏也越严重[23]。因此，选用较温和的水解条件（1+1盐酸溶液，100℃）进行最佳水解时间实验，具体操作为：分别称取样品1（含壳聚糖约70%）约1g、样品2（含壳聚糖约4%）约10g、样品3（含壳聚糖约80%）约1g，均定容至100mL。吸取1mL溶液（含壳聚糖4～8mg）至水解管中，加入1.0mL浓盐酸和8.0mL的1+1盐酸溶液，封管后于100℃水解不同时间。按规定测定壳聚糖的含量，结果见图1。
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图1 1+1盐酸溶液水解时间实验结果
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根据测定结果，初步判断样品没有水解完全。因此，减小称样量后再次进行最佳水解时间实验，具体操作为：分别称取样品1约0.5g、样品2约5g、样品3和样品4（含壳聚糖约80%）约0.5g，均定容至100mL。吸取1mL溶液（含壳聚糖2～4mg）至水解管中，加入1.0mL浓盐酸和8.0mL的1+1盐酸溶液，封管后于100℃水解不同时间。按规定测定壳聚糖的含量，结果见图2。
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图2 减小称样量后1+1盐酸溶液水解时间实验结果
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测定结果显示，2～4mg的壳聚糖采用1+1的盐酸溶液在100℃水解24h的效果最好。为验证1+1盐酸溶液的水解效果，进行了采用8mol/L盐酸溶液进行水解的实验。具体操作为：分别称取样品1约0.5g、样品2约5g、样品3和样品4约0.5g，均定容至100mL。吸取1mL溶液（含壳聚糖2～4mg）至水解管中，加入2.0mL浓盐酸和7.0mL的8mol/L盐酸溶液，封管后于100℃水解不同时间。按规定测定壳聚糖的含量，结果见图3。
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图3 8mol/L盐酸溶液水解时间实验结果
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测定结果显示，2～4mg的壳聚糖采用8mol/L的盐酸溶液在100℃水解6h的效果最好，但结果比1+1的盐酸溶液水解24h的略低，因此，最终选择了采用1+1的盐酸溶液水解24h。
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2.1.2 测定波长和衍生条件（高效液相色谱法）
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在210～400nm波长范围内对氨基葡萄糖衍生物溶液进行全波长扫描，结果发现，氨基葡萄糖衍生物在250和320nm处均有较大的紫外吸收，其中250nm为其最大紫外吸收波长，且溶剂、基质的干扰较小，故选择250nm作为测定波长。
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此外，根据文献[25]和实验结果，确定了壳聚糖水解产物氨基葡萄糖的衍生条件为：c（NaOH）=0.3mol/L、c（PMP）=0.5mol/L、衍生温度70℃、衍生时间70min。
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2.1.3 显色条件（分光光度法）
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结合之前的研究报道[27]，考察了乙酰丙酮-碳酸钠溶液浓度和配制时间对实验的影响，比较了分别使用前一日配制的4%的乙酰丙酮-碳酸钠溶液、现用现配的4%的乙酰丙酮-碳酸钠溶液和现用现配的7%的乙酰丙酮-碳酸钠溶液的3条标准曲线，发现使用7%的乙酰丙酮-碳酸钠溶液的标准曲线最高点吸光值仅有0.27，而使用4%的乙酰丙酮-碳酸钠溶液的标准曲线最高点吸光值均可达0.45，其中，使用现用现配的4%的乙酰丙酮-碳酸钠溶液的标准曲线的相关系数为0.9987，使用前一日配制的4%的乙酰丙酮-碳酸钠溶液的标准曲线的相关系数为0.9996。由此，确定显色时使用4%的乙酰丙酮-碳酸钠溶液，且应于使用前一日配制。
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2.2 干扰实验
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2.2.1 硝酸根对壳聚糖测定的影响
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在干扰因素研究过程中，发现硝酸根会对壳聚糖经盐酸水解生成氨基葡萄糖的过程产生干扰。为考察硝酸根对壳聚糖测定的影响，在2个样品中分别添加不同质量的硝酸根进行水解和测定，结果见表1。
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注：“—”表示没有进行该实验。
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测定结果显示，极少量的硝酸根对壳聚糖的测定没有影响，但随着硝酸根含量不断增大，壳聚糖的测定结果会越来越低。因此，本研究的高效液相色谱法和分光光度法不适用于含硝酸根的水溶肥料壳聚糖含量的测定。
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2.2.2 蛋白质对壳聚糖测定的影响
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根据壳聚糖的生产工艺，壳聚糖产品中可能含有未除净的蛋白质，而蛋白质会被盐酸水解成与氨基葡萄糖结构类似的氨基酸。因此，为考察蛋白质对壳聚糖测定的影响，向2个样品（均含壳聚糖约80%）中添加不同质量的玉米粉（蛋白质含量约8%）进行水解、测定，结果见表2。
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结果显示，当样品与玉米粉质量比为1∶2和1∶6，即样品中蛋白质含量为壳聚糖含量的20%和60%时，两个样品的回收率达到97%～101%。因此，实际样品中可能残留的少量蛋白质对壳聚糖的测定没有影响。
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2.3 方法评价
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2.3.1 线性相关性和检出限
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高效液相色谱法：对一系列不同浓度的氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液进行测定，以氨基葡萄糖盐酸盐质量浓度 x（mg/L）为横坐标、峰面积 y 为纵坐标，绘制标准曲线，并以3倍信噪比（S/N）估算检出限，结果见表3。
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分光光度法：对一系列不同浓度的氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液进行测定，以标准系列溶液含氨基葡萄糖盐酸盐的质量 x（μg）为横坐标，相应的吸光度 y 为纵坐标，绘制标准曲线。利用20个空白样品的测定结果计算标准偏差，并以3倍空白值的标准偏差估算检出限[35]，结果见表3。
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2.3.2 准确度和精密度
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通过加标回收实验来评价高效液相色谱法和分光光度法的准确性。经两次平行测定，统计这两个方法的回收率。结果显示，这两个方法的壳聚糖回收率分别为95%～101%和94%，结果见表4。
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为了考察高效液相色谱法和分光光度法的精密度，分别称取2个样品各6份，定容至100mL，吸取1mL溶液至水解管中，按规定水解后测定壳聚糖含量。结果显示，测定值的相对标准偏差分别为1.2%和3.6%，结果见表5。
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2.4 方法比对
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分别采用高效液相色谱法和分光光度法对10个水溶肥料样品壳聚糖含量进行测定，以考察这两种方法所测结果是否具有一致性。此外，还以氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）为衍生剂的高效液相色谱法[36]对这些样品进行检测，前处理采用本研究的方法。结果见表6。氨基葡萄糖PMP衍生物的色谱图见图4。
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图4 氨基葡萄糖PMP衍生物的色谱图
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注：氨基葡萄糖盐酸盐浓度为30.0mg/L。
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结果显示，采用这3种方法所测结果有良好的一致性。此外，本研究也发现，以氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）为衍生剂的高效液相色谱法由于氨基葡萄糖1位的-OH有两种不同的构型，在衍生化后产生两种同分异构体，从而在色谱图中出现双峰，这与之前有关的研究报道一致[26，36]，这样会给壳聚糖的定量检测带来一定的影响，相关问题有待进一步深入研究。
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3 结论
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建立了高效液相色谱法和分光光度法这两种方法测定水溶肥料中壳聚糖含量，并对这两种方法所测的结果进行了比较。结果表明，这两种方法均能满足水溶肥料中壳聚糖含量的分析要求，从而为该产品的规范生产提供了技术保障，为行政管理和市场监管提供了技术依据。相比之下，分光光度法所需实验仪器简单、适用性广，而高效液相色谱法在操作性、灵敏度、稳定性以及可靠性等方面更具优势，检测人员可以根据实际情况选择相应的检测方法。
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摘要
建立了高效液相色谱法和分光光度法测定水溶肥料中壳聚糖含量的不同分析方法，对壳聚糖的水解条件进行了系统的考究。结果表明，以 1+1 的盐酸溶液，温度 100℃，时间 24 h 水解效果最佳。以 1- 苯基 -3- 甲基 -5- 吡唑啉酮（PMP）作为衍生剂的高效液相色谱法的线性范围、检出限和加标回收率分别为 1 ～ 200 mg/L、 0.07 mg/L 和 95% ～ 101%，分光光度法相应的指标分别为 0 ～ 100 μg、0.47 μg 和 94%。经比较，这 2 种方法对水溶肥料样品的测定结果一致性较好，均能满足水溶肥料中壳聚糖含量的分析要求。其中，高效液相色谱法干扰因素更少，效率更高。此外，也尝试采用氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）作为衍生剂对壳聚糖水解产物进行衍生，然后用高效液相色谱法进行检测，发现所测结果也与上述 2 种方法基本相符，但本研究所建立的高效液相色谱法和分光光度法不适用于含硝酸根的水溶肥料壳聚糖含量的测定。
Abstract
Different analytical methods for the determination of chitosan in water-soluble fertilizers by high performance liquid chromatography and spectrophotometry were established．The hydrolysis conditions of chitosan were systematically investigated，and the test results showed that chitosan could be quantitatively hydrolyzed into glucosamine in 24 h with hydrochloric acid（1+1）at 100℃．The linearity range，limit of detection and recovery rate of high performance liquid chromatograply with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）as the derivatizing agent were 1 ～ 200 mg/L，0.07 mg/L and 95% ～ 101%，respectively．For spectrophotometry，they were 0 ～ 100 μg，0.47 μg and 94%，respectively． By comparison，the results of the two methods for the determination of water-soluble fertilizers were consistent，and both methods could meet the requirements for the analysis of the chitosan content in water-soluble fertilizers，and high performance liquid chormatography had less interference factors and higher efficiency．In addition，9-fluorenylmethoxycarbonyl chloride was used as another derivatizing agent，and the results were basically consistent with the two methods mentioned above. However，the methods of high performance liquid chormatography and spectrophotometry established in this study are not suitable for the determination of chitosan in water-soluble fertilizers containing nitrate nitrogen.