烤烟（Nicotiana tabacum L.）作为重要的经济作物，是卷烟工业的主要原料，其质量和产量在烟草生产中起着至关重要的作用^[1-2]。受耕地资源、经济利益和栽培习惯等因素影响，宜烟地区连作现象普遍^[3]，导致植株发育不良，烟叶产、质量下降，吸食安全性降低^[3]，造成每年经济损失高达40亿元^[4]，严重影响了烟草产业可持续发展。

根际微生态失衡可能是连作障碍发生的主要原因^[5-6]。土壤微生物群落的改变可以改变群落的功能，进而反应在植物的生长和发育方面。此外，由于微生物群落与土壤条件和土地管理的密切关系，其可作为土壤健康的生物指标^[7]。许自成等^[8]研究发现，长期连作导致烤烟根际土壤真菌菌群结构发生变化，致病菌增多。She等^[9]研究连作12年的烤烟根际土壤时发现微生物OTU、Shannon、 Pielou evenness和Chao1等指数与对照相比显著下降。Wang等^[10]报道了烤烟连作显著降低了根际土壤有益细菌和真菌的相对丰度。作为土壤微生物区系的重要成员，土壤真菌与其他微生物一起参与土壤生态系统中物质循环和能量流动，包括碳、氮、磷和硫的循环，以及为植物提供营养等^[11-12]。相反，真菌也可引起烤烟作物的土传病害^[13-14]，导致烤烟根、茎和叶的生长发育受阻^[15]。

强还原土壤灭菌法（RSD）是一种在作物种植前的土壤处理方法，采用淹水 + 闷棚 + 有机物料的方式，阻隔土壤与大气气体交换，创造土壤强烈还原条件，短期内杀灭土传病原菌^[16]。目前，强还原土壤灭菌方法是防治土传病害和消除连作障碍广泛应用的新方法。周开胜^[17]在西瓜连作土壤中发现RSD处理可明显抑制致病尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）生长，西瓜的发病率和死亡率显著低于对照组。朱同彬等^[18]在研究连作黄瓜地时，发现RSD处理与未处理对比，显著改善了土壤理化性质并且提高了黄瓜的产量。Butler等^[19] 报道了RSD对多种土传病原菌有杀菌效果，如番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum Schlechtend）、白娟病菌（Sclerotium rolfsii Sacc）等。RSD对连作土壤具有良好的修复效果，但在烤烟土壤中的应用与效果却少有报道。

受限于技术手段，对烟草根际真菌群落的研究目前主要集中在群落组成、多样性以及接种内生菌上^[20]。FUNGuild是一个进行真菌功能比对的数据库，对真菌进行具体的功能分类。本研究联合使用Illumina高通量测序技术^[21]和FUNGuild，研究不同连作年限及RSD处理下对烤烟根际土壤真菌群落的影响，旨在为烤烟根际真菌群落的变化和缓解烤烟连作障碍提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究区概况与试验设计

试验于2019年9～11月在河南省襄城县汾陈乡（113°31′E，33°58′N）进行。该地区主要气候类型为大陆季风气候，年平均气温约为14.7℃，年降水量约为453.13mm，土壤类型为黄褐土。选取连续种植3年“中烟100”的烟田，采用淹水添加可溶性糖溶液覆膜法创造强还原环境，修复烤烟连作土壤，共设置2个处理：连作未处理（3年）和强还原处理（RSD），每个处理3组平行，共6个小区，小区面积为2.4m×3m，各个小区之间设置保护行，间距3m。具体处理方法为：每个小区淹水至饱和，均匀投加糖溶液（0.5%添加量，糖溶液/土壤），覆盖6丝地膜，60d后揭膜，自然晾晒7d。于2019年11月对上述小区土壤进行取样，同时在试验区采集烤烟连作3、5、7年根际的土壤。所有土样于冰盒中保存，运回实验室，分为两部分，一部分置于室内自然风干用于测定土壤理化性质，一部分置于-80℃冰箱保存用于提取DNA。

1.2 土壤理化性质测定

土壤理化性质按如下方法测定。土壤pH（水土质量比为2.5∶1）使用pH计（Starter 3100，上海奥豪斯仪器有限公司）测定。土壤总碳（TOC） 和总氮（TN） 由C/N元素分析仪（Vario-micro，德国Elementar公司） 测定^[22]。总磷（TP） 由硫酸-盐酸消解，钼蓝比色法测定。总钾（TK） 由HF-HClO₄ 消解，ICP-OES（Optima8300，美国PerkinElmer有限公司）测定^[23]。所有结果均按105℃烘干土重量计算。

1.3 土壤DNA提取及PCR扩增

土壤总DNA使用DNeasy PowerSoil试剂盒 （QIAGEN GmbH，Germany），根据试剂盒说明提取。1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，NanoDrop 2000（ 赛默飞世尔科技有限公司） 检测DNA纯度和浓度，真菌18S用SSU0817F（5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’）和1196R （5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）引物对V5～V7可变区进行PCR扩增，采用GeneAmp® 9700型 （ 美国ABI公司）PCR仪，使用反式Gen AP221-02（反式启动FastPfu DNA聚合酶），反应体积为20 μL，包括4μL 5×FastPfu缓冲液、2μL 2.5mol/L dNTPs、0.8μL正向和反向引物（5μmol/L）、 0.4 μL FastPfu聚合酶、0.2 μL BSA，模板DNA 10ng，适量ddH₂O，27次循环周期的PCR程序如下：95℃ 3min，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，最后在72℃下延伸10min，10℃直到仪器停止。2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）提取PCR产物，Tris-HCl洗脱产物。纯化后的产物经QuantiFluorTM-St-blue荧光定量系统（Promega公司）定量，然后根据测序量的要求进行混合，最后由上海美吉生物制药技术公司（中国上海）完成测序。

1.4 Illumina测序及序列处理

使用Illumina MiSeq PE250测序平台对扩增产物进行双端测序。测序数据经过Flash和Trimmomati进行拼接和质控后，使用微生物生态学定量研究平台QIIME（Quantitative Insights into Microbial Ecology）进行处理。使用UCLUS对各序列在97%的相似性水平下聚类操作分类单位（OTUs），各个OTU的代表序列使用UNITE数据库（https：//unite.ut.ee/）进行物种信息比对。

1.5 数据处理与分析

真菌的功能分组使用FUNGuild 1.0进行比对， FUNGuild是一款通过微生态Guild对真菌群落进行分类分析的工具，其基于目前已发表的文献或权威网站数据，对真菌进行功能分类，主要步骤为：（1）将QIIME输出的OTU表和物种信息表合并，将物种信息附加在OTU表的最后一列并命名为“taxonomy”；（2）将第（1）步得到的表格上传到FUNGuild网站，开始比对；（3）比对完成后下载输出结果到本地。输出结果包含原始的OTU表，并依据序列数量进行排序。运用R 3.5.1分析土壤理化性质与真菌群落的相关性，绘制相关性热图。相关性热图可根据颜色梯度的变化直观看出各指标与菌种之间的相关性，颜色梯度由红色到绿色表示相关性由近到远。样本的描述性分析、组间差异的显著性分析使用SPSS 19.0中的独立 t 检验完成。图片由Origin 9.1制作。显著性检验水准均为 P<0.05。

2 结果与分析

2.1 长期连作及RSD处理对烤烟根际土壤理化性质的影响

对不同连作年限及RSD处理的烤烟根际土壤理化性质分析（表1）可知，随着连作年限的增加，pH呈显著下降趋势，其中连作5和7年处理显著低于其他处理；连作处理TOC呈下降趋势，未达到显著水平，RSD处理较未处理（3年）显著提升TOC含量；连作7年处理总氮含量呈显著下降，RSD处理较未处理（3年）显著提升总氮含量；总钾、总磷含量在各处理间无显著变化。表明长期连作导致土壤质量退化，养分比例失衡。

注：平均值 ± 标准误差（n=3），同行不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。

2.2 长期连作及RSD处理对真菌群落多样性和结构的影响

对各样品中测序得到的OTU进行分类表明，所有样品共得到478个OTU，整体上随连作年限呈明显上升趋势。与未处理（3年）相比，RSD处理降低了OTU数量（图1）。4个处理中共有的OTU为65个，其中3年、5年、7年、RSD处理中特异的OTU分别为9、13、27、6个；连作处理样品中特异的OTU随着连作年限呈上升趋势，其中RSD处理降低特异OTU数量（图2）。

本试验中，各处理的覆盖率都在99.98%以上，表明本次测序结果接近样本中微生物的实际情况，可进行Alpha多样性分析。ACE、Jack指数代表真菌群落丰富度，Shannon、Invsimpson指数代表真菌群落多样性。由图3可知，其丰富度指数，连作7年处理显著高于其他处理，连作3、5年处理间无显著差别，RSD处理较未处理（3年）显著降低群落丰富度指数；连作3和7年处理Shannon指数无显著差异，显著高于连作5年处理，RSD处理显著低于未处理（3年）；Invsimpson指数在连作处理下呈升高趋势，但未达到显著水平，RSD处理显著低于未处理组（3年）。

对测序结果主坐标分析发现（图4），前两个主坐标的方差贡献率分别为43.14%和33.47%。在第1主坐标排序中，所有处理可分为连作7年处理、连作3和5年处理、RSD处理3组，在第2主坐标排序中，RSD处理与连作3和5年处理显著分离。表明连作达7年后根际土壤真菌群落结构发生显著变化； RSD处理较未处理（3年）显著改变群落结构。由聚类分析（图5）可知，在距离0.025处，可将RSD处理聚为一类，连作处理聚为一类。进一步表明RSD处理较未处理（3年）显著改变群落结构。

注：误差棒代表标准误差（n=3），同一指数不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

2.3 长期连作及RSD处理对真菌群落相对丰度的影响

由图6统计分析发现，Sordariomycetes相对丰度随连作年限呈先下降后上升的趋势，但5、7年处理与3年处理相比都显著下降，与未处理（3年）相比，RSD处理使其相对丰度升高；连作处理Dothideomycetes、Eurotiomycetes、Leotiomycetes和Intramacronucleata相对丰度逐年升高，连作年限时间愈长，升高幅度愈大，与未处理（3年）相比，RSD处理使其相对丰度显著下降；连作处理下Mucoromycetes、Agaricomycetes呈先升后降的趋势，与未处理（3年）相比，RSD处理使其相对丰度显著升高；Tremellomycetes相对丰度在各处理下无显著变化。结果显示，各处理土壤样品中真菌纲水平相对丰度发生显著变化，表明长期连作及RSD处理显著影响真菌群落结构。

进一步对相对丰度排名前20的真菌属分析发现，连作处理导致 Chaetomium、Solicoccozyma、 Plectosphaerella 相对丰度先降低后上升，RSD处理与未处理（3年） 相比显著降低 Solicoccozyma、Plectosphaerella 相对丰度；连作处理显著提高 Fusarium、Cladosporium、unclassified-Pleosporales、 norank-Leotiomycetes、Aspergillus、Colpoda、unclassified-Onygenales 的相对丰度，与未处理（3年） 相比，RSD处理降低其相对丰度，其中 Fusarium 相对丰度下降达显著水平（P<0.05）；连作导致norank-Mucoromycota、norank-Pyronemataceae、 Sistotrema 先增加后降低，RSD处理较未处理（3年）显著增加其相对丰度；连作处理显著降低unclassified-Microascaceae、Phymatotrichopsis 相对丰度，除unclassified-Microascaceae、norank-Aphelidea 外，RSD处理较未处理（3年）显著降低其相对丰度；norank-Aphelidea、norank-Helotiales、Hypocrealla、norank-Pezizaceae、norank-Sordariomycetes 相对丰度在各处理下无显著变化。

注：对于被定义为未分类（unclassified）或某一分类学水平上没有明确名称（norank）的物种，其之后为准确较高分类学水平的名称。

2.4 长期连作及RSD处理对不同功能真菌相对丰度的影响

将测序结果与FUNGuild真菌数据库进行比对，在测定的所有土壤样本中主要发现4种功能真菌 （表3）。统计分析表明，连作处理显著提高烤烟根际土壤植物病原菌的相对丰度，与未处理（3年） 相比，RSD处理显著降低连作处理植物病原菌的相对丰度；植物内生菌相对丰度随着连作年限呈先下降后上升的趋势，连作5年处理其相对丰度明显低于其他处理，但未达到显著水平；连作处理下外生菌根相对丰度无显著变化，与未处理（3年）相比，RSD处理显著提高外生菌根相对丰度；各处理下动物病原菌相对丰度无显著变化。表明连作显著改变了植物功能菌的相对丰度，RSD处理对其具有良好修复效果。

2.5 真菌群落与环境因子相关性热图分析

由图7可知，Solicocozyma 相对丰度与根际土壤总氮含量呈显著负相关，Cladosporium、unclassified-Pleosporales、norank-Leotiomycetes、Colpoda、Fusarium、 Aspergillus、unclassified-Onygenales 的相对丰度与根际土壤pH、有机质和总氮的含量呈显著负相关；Sistotrema 和norank-Zoopagomycota 相对丰度与根际土壤pH、有机质和总氮的含量呈显著正相关；Pyronemataceae 与根际土壤总钾含量呈显著正相关，norank-Aphelidea 与根际土壤总钾、总磷含量呈显著正相关。

注：* 表示 P<0.05显著水平，** 表示 P<0.01显著水平，*** 表示 P<0.001显著水平。对于被定义为未分类（unclassified）或某一分类学水平上没有明确名称（norank）的物种，其之后为准确较高分类学水平的名称。

3 讨论

3.1 长期连作导致烤烟根际土壤质量退化

前人在研究烤烟^[24-25]、草莓^[26]、黄连^[27]和水稻^[28]等连作时发现，土壤pH和养分随着连作年限显著下降，且连作年限愈久，土壤质量退化愈严重。本研究表明，长期连作导致烤烟根际土壤pH、土壤总碳和总氮显著下降，说明长期连作烤烟导致土壤质量退化。根际土壤pH的降低可能是由于长期连作导致根系释放的化感物质大量累积导致的^[29-30]。土壤总碳和总氮含量显著降低可能是因为烤烟在长期连作的胁迫下，为保证其生长发育和内在品质，选择性吸收大量元素^[31]。土壤总碳具有保水保肥、促进土壤团聚体形成、改善土壤物理性质等作用^[32]，因此，总碳在保持土壤质量和作物生产力方面起着关键作用。氮是植物生长发育必不可少的元素，Lisuma等^[31]发现氮素影响烟叶的颜色、口感、烟气和香气，进而影响烟叶的内在品质。同时氮是蛋白质的组成元素，在植物体内合成各种结构和酶^[33]。缺氮会导致叶绿素含量^[34]、同化能力、酶活性和酶含量下降^[33，35]，进而导致植物生物量和质量的下降。本研究结果表明，总磷和总钾长期连作无显著变化，其归因于豫中烟区常年施肥模式，为追求高产量和优质烟叶，烟农忽视养分平衡，大量施用钾肥和磷肥。

3.2 长期连作导致烤烟根际土壤真菌群落显著变化

长期连作导致烤烟根际土壤微生态偏向真菌型^[3，36]。张笑宇等^[37]研究烤烟轮作与连作时发现连作烟田真菌数量显著高于轮作烟田，进一步分析微生物群落结构发现连作烟田根腐病病菌 Pythium 相对丰度较高。许自成等^[8]研究发现长期连作烤烟导致土壤真菌群落结构发生变化，腐霉科、盘菌科和镰刀菌属等致病菌增多。Liu等^[38]在研究其他旱作作物长期连作时发现了11种潜在病原真菌，大多数潜在病原真菌的相对丰度显著增加。本研究结果发现，长期连作烤烟导致根际土壤真菌群落丰富度指数和多样性指数显著上升，群落结构显著变化； Fusarium^[14]、Cladosporium^[39]、Plectosphaerella^[40] 等是已知植物病原菌，Pleosporales 目中有些真菌易引起严重的植物病虫害^[41-42]，而 Aspergillus 在果实病害、采后病害^[43-44]以及秋葵病虫害中均有报道^[45]，烤烟连作显著促进上述5种菌种的相对丰度。同时FUNGuild数据库比对结果发现，长期连作导致植物病原菌相对丰度显著增加，外生菌根真菌相对丰度显著下降，表明长期连作导致致病菌增多，有益微生物减少。前人研究表明，土壤质量能够直接或间接影响微生物群落，土传病害是由于连续单作导致土壤质量退化而发生的，土壤微生物群落对环境变化反应迅速，与土壤条件和土地管理密切相关^[6]。潘义宏等^[15]研究云烟105时发现，土壤营养趋于协调、健康，降低了土传病害的发病率。马少兰等^[46]研究连作枸杞地时发现土壤pH、电导率、硝态氮和有效磷含量是解释再植枸杞根际真菌群落变化的主要因素。叶浩等^[47]研究贵州烟区时指出pH与烤烟土传病发病率呈负相关。土壤有机质含量与有益细菌呈正相关^[48]，与土壤疾病发病率呈负相关^[49]，这可能表明土壤有机质在疾病抑制中具有潜在作用^[50]。本研究也得到类似的结果，Fusarium、Cladosporium、Plectosphaerella 等已知植物病原菌以及unclassified-Pleosporales 和 Aspergillus 相对丰度与pH、总碳和总氮呈显著负相关，表明长期连作导致pH、总碳和总氮含量下降是真菌群落病原菌增多、群落结构变化的主要因素。在豫中烟区实际生产中，大量施用磷肥、钾肥，导致磷、钾元素过量，碳、氮元素匮乏，长期土壤养分失衡导致烤烟根际微生态恶化。

越来越多的研究表明，连作过程中，根际分泌物不会累积到直接毒害作物的浓度，往往通过影响病原菌萌发、繁殖等造成连作障碍^[51]。病原菌的相对丰度逐年增加，可能的原因是根际分泌物为其提供了基质，导致连作系统中大量病原菌富集。桑正林等^[52]研究发现，烤烟在生长发育前期通过根系分泌较多的单糖到根际土中，为土壤中黑胫病菌的生长发育提供了物质和能源，促进了烟草黑胫病菌的生长；Morris等^[53] 发现大豆根系分泌异黄酮可以吸引一种病原菌；Hao等^[54]还发现西瓜的根系分泌物促进了病原菌的生长。

3.3 RSD处理修复烤烟根际土壤

强还原土壤灭菌法（RSD）已被广泛应用于作物连作系统中。朱同彬等^[55]研究表明RSD应用于设施蔬菜系统中，可有效消除硝酸盐和硫酸根，显著提高土壤pH。周开胜^[17]研究发现强还原灭菌法应用于西瓜连作土壤中能有效杀死病原菌。本研究发现，RSD处理显著提高土壤总碳和总氮含量，改善土壤质量。RSD通常选取易降解的有机物料作为碳源添加，大部分有机物料都取得了较好的灭菌效果，但是呈现差异性，这与有机物料本身理化性质有很大关系，如易降解碳和难降解碳的比重、碳氮比等。有研究指出，虽然RSD处理选用易降解的有机物料，但由于施用量大、纯度高，处理后仍有相当数量的有机物质残留在土壤中，成为土壤有机质的一部分，可提高土壤有机质含量、改善土壤结构^[56]。有学者指出，经RSD处理后蔬菜地土壤氮的转化过程发生显著变化，加快无机氮周转速率，提高氮的有效性^[16]。本研究中选用的有机物料为蔗糖和玉米粉混合糖溶液，含有大量碳、氮元素，增加根际土壤总碳和总氮含量。本研究中RSD处理对pH无显著影响，蔡祖聪等^[16]研究表明，对于酸化土壤经过强烈还原处理后，pH均大幅度提高，随有机物料施用量的增加而升高。但是，对于并未酸化的土壤，RSD处理对pH的影响很小，在处理过程中由于有机酸的生成甚至可能使土壤pH有所下降。

本试验中，RSD处理显著降低真菌群落OTU数量、多样性指数和丰富度指数，改变真菌群落结构，降低 Fusarium、Cladosporium、Plectosphaerella 等已知植物病原菌以及unclassified-Pleosporales 和 Aspergillus 等可能引起植株、果实病害菌种的相对丰度，表明RSD处理对烤烟连作土壤真菌群落具有一定的修复效果。其原因可能如下^[16，56-59]：首先，烤烟致病菌大多数为好氧菌，RSD处理创造强烈的厌氧环境使得这些病原菌无法生存；其次，有机物料厌氧发酵产生对土传病原菌有毒有害的物质，如有机酸、氨气、硫化氢和生物活性物质等，杀灭土传病原菌。当RSD处理结束时，这些有毒有害物质可以快速分解或快速再氧化，一般其浓度已经下降至对作物无害的程度。

本试验结果表明，RSD处理较未处理（3年） 显著提高总碳和总氮含量。主坐标轴分析和聚类分析表明，RSD处理较未处理（3年）显著改变真菌群落结构。FUNGuild数据库比对分析表明，RSD处理较未处理（3年）显著降低植物病原菌相对丰度（降低46.08%）。整体来讲，RSD处理对连作3年烤烟根际土壤质量具有良好的修复效果，对真菌群落具有一定的修复效果。温度对强还原灭菌处理效果显著影响，且温度越高修复效果越好^[18]。前人的研究通常在作物休耕一年或种植休闲期，选取夏季高温时间（5～8月）进行试验^[17-18]。本试验中考虑到当地烟农经济收入，并未休耕，RSD处理时间选为烤烟作物收获之后（9～11月）进行。温度较前人试验较低。再者，对不同连作年限根际土壤分析发现，连作年限时间愈长，土壤质量和真菌群落恶化程度愈严重。本试验选取连作3年烟田 （考虑到豫中烟区实际生产中，以连作3年最为普遍）进行RSD处理，其对真菌群落修复效果一般。由图3～5分析可知，RSD处理与5、7年处理差异程度很大，RSD处理对连作年限超过3年的烟田可能具有良好的潜在修复效应。

4 结论

烤烟长期连作导致根际土壤质量显著退化；测序结果表明，连作促进根际土壤真菌群落Alpha多样性水平升高，真菌群落结构变化，病原菌丰度增加，当连作年限达5年时，其变化达到显著水平； 土壤质量退化导致根际土壤病原菌增多可能是豫中烟区连作障碍的主要原因之一。RSD处理对烤烟连作土壤的质量具有良好的效果，对真菌群落具有一定的修复效果。如果烤烟作物休耕1年，选取夏季高温天气作为RSD修复时间，将取得更好的修复效果。同时，选取连作年限较长（>3年）的烟田作为RSD处理样地，可能具有更好的修复效果。

参考文献