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硒是世界卫生组织确认的人和动物必需的14种微量元素之一[1]，被称为“长寿元素”。世界上40多种疾病都与缺硒有关，如克山病、大骨节病以及一些心脑血管疾病、糖尿病、心脏病、癌症、高血压等[2-4]。中国营养学会建议中国居民膳食营养中成年人每天对硒的适宜摄入量为60～250μg，安全摄入量为400μg，而我国平均每人每日对硒的摄入量还达不到40μg[5-6]。硒的生物活性及生理功能不仅取决于硒的总浓度水平，更取决于其存在的化学形态[7-9]。一般有机态硒的毒性要远小于无机态的硒，在生物可利用性以及生物活性上有机态硒远远高于无机态的硒[10]。硒代氨基酸是人日常膳食中获取硒的主要来源，其中硒代蛋氨酸来自植物体，硒代半胱氨酸来自动物体。
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中国是水稻种植大国，水稻产量世界排名第一，每年稻谷产量有2×108 t，我国一半以上人口都以大米作为主食[11]，因此大米富硒后可作为日常非常重要的硒元素摄入源。中国约一半地区土壤属于缺硒状态，同时受种植的水稻品种和土壤环境的影响，产出的大米中硒的含量非常低，难以满足人们日常所需的硒摄入量[12-13]。因此，研究施加外源硒提高稻米硒含量，对从大米主食途径提高并满足人们日常硒的摄入量具有重要意义。有大量研究证实，叶面施加硒肥可以提高大米中硒的含量[14-16]。而有关叶面喷施氨基酸螯合硒并综合分析外源硒供给对水稻硒吸收和稻米硒形态的影响研究却鲜见报道。
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本研究以水稻品种百香139为材料，通过大田试验，以氨基酸螯合硒作为外源硒，采用叶面喷施方式，考察不同的施硒量及在水稻不同的生育期施硒对水稻硒吸收分配、籽粒硒含量及其形态的影响，为富硒水稻的安全生产提供参考依据和指导。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料
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供试水稻品种为百香139，外源硒为实验室自制的氨基酸螯合硒（氨基酸含量≥ 100g/L，含硒≥ 8g/L）。试验地点为广西壮族自治区南宁市宾阳县古辣镇联泉村朱沙屯。所选稻田地块的土壤基本性质为：pH 5.30；有机质28.41g/kg；铵态氮8.19mg/kg；总硒0.424mg/kg；有效硒0.018mg/kg；有效磷20.07mg/kg；速效钾40.41mg/kg。
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1.2 试验设计
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1.2.1 叶面喷施不同量的外源氨基酸螯合硒
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试验设置10个处理，每个处理小区面积为74m2，每个处理3次重复，随机区组排列。在水稻破口期叶面喷施氨基酸螯合硒溶液的量分别为0、3.375、6.75、13.5、27.0、54.0、81.0、108.0、 135.0、162.0g/hm2 （以硒计），兑水量675L/hm2 喷施。其他的水稻田间管理措施按当地习惯生产技术操作。
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1.2.2 不同生育期喷施外源氨基酸硒
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采用单因素随机区组试验设计，在水稻拔节孕穗期、始穗期、扬花授粉期、灌浆期、蜡熟期5个时期叶面喷施氨基酸硒，同时设置叶面喷施清水对照（CK），共6个处理，每个处理重复3次，每个处理小区面积为74m2。在各处理试验区水稻进入相应时期时叶面喷施外源氨基酸螯合硒1次，用量为13.5g/hm2 （以硒计）。其他的水稻田间管理措施按当地习惯生产技术操作。
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1.3 样品采集与制备
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土壤样品采集与制备：利用土钻在种植水稻前的试验大田中随机选择15个采样点采取其耕作层土壤，将土壤中混有的杂草、根系和石块等杂物除去，并充分混匀，风干，用四分法取适量样品，将其全部粉碎后过0.149mm筛，混匀将其密封在密封袋中，用于大田试验供试土壤基础理化性质的测定。
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植株样品采集与制备：本次试验水稻播种时间为2018年3月17日，移栽插秧时间为2018年4月9日，水稻成熟收获时间为2018年7月20日。水稻成熟后，用蛇形法采集，用镰刀将整棵水稻植株地上部分割下，先放至塑料袋中，带回实验室后依次用清水、去离子水清洗，将水稻茎、叶、穗分开。茎、叶放在烘箱105℃杀青30min，65℃烘干后磨碎，用于检测水稻不同组织中硒含量。穗晒干后，将籽粒剥出，并逐步加工至精米，用于检测水稻籽粒中的硒含量和硒形态。
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1.4 样品测定
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土壤理化性质测定参照国家标准测定方法，其中土壤有机质含量采用浓硫酸-重铬酸钾外加热法进行测定；土壤全硒含量采用原子荧光光谱法（参照NY/T1104-2006中华人民共和国农业行业标准 《土壤中全硒的测定》）进行测定；土壤有效硒含量采用氢化物发生原子荧光光谱法进行测定，土壤有效硒浸提方法为：称取土壤样品1.0g（精确到0.001g）于离心管中，准确加入10mL 0.25mol/L KH2PO4 浸提液，于30℃、1500r/min振荡提取60min，3000r/min离心15min，取上清液5mL于微波消解罐中，加入HNO3 7mL、H2O2 1mL，样品消解完毕后，在赶酸板上160℃左右加热赶酸至约2mL，加入5mL 6mol/L盐酸，再赶酸至2mL以下，转入10mL容量瓶中，用5%盐酸溶液定容。
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水稻茎、叶和籽粒中全硒含量测定采用氢化物原子荧光光谱法，参照国家标准方法《食品安全国家标准食品中硒的测定》（GB 5009.93-2017）进行测定；水稻籽粒中硒形态的测定方法采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱法进行测定。取一定量的富硒稻米试样进行粉碎、混匀，过0.850mm筛，称取0.4g（精确至0.0001g）富硒稻米样品于250mL锥形瓶中，称取40mg链霉蛋白酶E溶于40mL超纯水，涡旋混匀，置于水浴振荡器中，水温37℃，2h超声提取。待提取结束后，于10000r/min离心30min，吸取上清液37℃旋转蒸发浓缩35倍，用1mL超纯水超声复溶后于10000r/min离心15min，过0.22 μm的双层有机滤膜，然后上机进行检测，同时做样品空白。实验以生物成分分析标准物质-玉米（GBW10012）为参照，对试验结果进行检验。采用空白试验、标准物质分析，校正曲线、平行双样方法进行质量控制。将质控样和样品一起测定，并将质控样和被检测样品数据进行比照，被检测样品的数据落在质控样标准数据的合理范围内，则数据有效。
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2 结果与分析
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2.1 不同施硒量对水稻各组织器官中硒含量的影响
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为了研究不同氨基酸螯合硒施用量对水稻植株硒吸收的影响，对成熟期水稻的茎、功能叶及籽粒进行硒含量的测定，如表1所示，在破口期随叶面喷施氨基酸螯合硒施用量的增加，水稻茎、功能叶和籽粒中硒含量均呈现先上升后下降的趋势。已有研究表明，适量浓度的硒可促进植物的生长，而过量的硒对植物有毒害作用[17]，这也可能是在高硒条件下水稻植株硒含量下降的原因。在氨基酸螯合硒用量为135.0g/hm2 时水稻的功能叶和籽粒硒含量达到最大，分别为7.984和1.349mg/kg；水稻茎的硒含量在氨基酸螯合硒用量为81.0g/hm2 时达到最大，为2.139mg/kg。除3.375、13.5g/hm2 施硒量外，在相同的硒施用量时，水稻功能叶相较于其他器官硒含量最高。
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注：表中数据为3个平行处理的平均值 ± 标准差，同列数据后不同大、小写字母分别表示处理间差异极显著（P< 0.01）、显著（P< 0.05）。
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籽粒中的硒含量随氨基酸螯合硒的施用量增加而增加，但当外源硒用量过高时（162.0g/hm2）稻米籽粒中硒含量有所下降，这可能是过量的外源硒对水稻有毒害作用，在高硒胁迫条件下水稻外源硒吸收转化下降导致籽粒中硒含量下降，虽然与喷施135.0g/hm2 的差异不显著，但也能够说明硒用量过高反而抑制水稻籽粒对硒的吸收。外源硒用量为6.75、13.5、27.0g/hm2 的处理，水稻籽粒的硒含量分别为0.167、0.431、0.439mg/kg，均达到广西富硒农产品粮食类地方标准（DB45/T1061-2014）（硒含量0.15～0.50mg/kg）。因此，从富硒效果、硒的安全用量和经济方面综合考虑，在富硒水稻生产中，氨基酸螯合硒最佳叶面施用量为13.5g/hm2。
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为明确氨基酸螯合硒施用量与水稻地上部各组织器官硒含量的关系以及各组织器官中硒含量之间的关系，对施硒量和水稻各器官含硒量之间进行了相关性分析。相关性分析表明，氨基酸螯合硒施用量与水稻茎、功能叶、籽粒的相关系数（R）分别是0.888、 0.919、0.934，水稻地上部各组织器官硒含量与氨基酸螯合硒施用量存在极显著相关（P ≤ 0.01）。
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2.2 不同施硒量对水稻籽粒中硒形态的影响
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分析水稻破口期喷施不同用量氨基酸螯合硒后水稻籽粒中硒的形态（图1），结果表明水稻籽粒中有机硒主要以硒代蛋氨酸的形态存在，有微量L硒-甲基硒代半胱氨酸和极少量L-硒代胱氨酸，并有极少量无机硒为亚硒酸钠。随着施用外源氨基酸螯合硒量的增加，水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量有增加的趋势，在氨基酸螯合硒用量为135.0g/hm2 时达到最大，为1.034mg/kg；而在氨基酸螯合硒用量大于等于54.0g/hm2 时，才检测出L-硒-甲基硒代半胱氨酸；只在氨基酸螯合硒用量为162.0g/hm2 时，检测出极少量的L-硒代胱氨酸。
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通过对水稻籽粒中硒代蛋氨酸占总硒含量比例（图2）分析可知，施用外源硒后水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量比例有所下降，这与马洁等[18]的研究结果相一致。不施外源硒时，水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占总硒含量的85.3%，随着施用外源硒量的增加，不同施硒量水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占总硒的比例为51.3%～69.0%，方差分析表明， 3.375、13.5、27.0、108.0、162.0/hm2 施硒量处理与对照相比差异显著，表明不同施硒量对水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占比有较大影响。
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2.3 不同生育期施用氨基酸螯合硒对水稻籽粒中硒含量的影响
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结果如图3所示，相比对照的水稻籽粒硒含量（0.070mg/kg），在水稻不同生育期叶面喷施氨基酸螯合硒13.5g/hm2 （以硒计）均显著提高了水稻籽粒硒含量（P<0.05），而灌浆期喷施处理的水稻籽粒硒含量最高（达到0.320mg/kg）。不同生育期叶面喷施外源硒后水稻籽粒硒含量不同，水稻不同生育期叶面喷施外源硒籽粒硒含量由大到小依次为：灌浆期> 扬花授粉期> 始穗期> 蜡熟期> 拔节孕穗期。水稻籽粒硒含量均达到国家富硒大米的硒含量标准（GB/T22499-2008）（富硒稻谷，硒含量0.04～0.30mg/kg）或广西富硒农产品硒含量分类要求的地方标准（DB 45/T1061-2014）中的富硒大米硒含量的要求（硒含量0.15～0.50mg/kg）。
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图1 喷施不同用量外源硒水稻籽粒中硒形态含量
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图2 不同外源硒用量水稻籽粒中硒代蛋氨酸占总硒含量比例
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注：图柱上不同字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。
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图3 不同时期喷施氨基酸螯合硒水稻籽粒硒含量
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2.4 不同生育期施用氨基酸螯合硒对水稻籽粒硒形态的影响
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结果表明，在水稻不同生育期喷施氨基酸螯合硒13.5g/hm2 （以硒计），水稻籽粒中硒形态除了硒代蛋氨酸，其他形态硒均未检出。由图4可知，在5个不同生育期水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量均比对照高，方差分析表明除蜡熟期外均比对照有显著差异。始穗期喷施外源硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量最高，为0.178mg/kg。不同时期喷施外源硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量由大到小依次为始穗期> 灌浆期> 扬花授粉期> 拔节孕穗期> 蜡熟期> 对照处理。
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图4 不同时期喷施氨基酸螯合硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量
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对水稻籽粒中硒代蛋氨酸占总硒量比例（图5） 的分析发现，硒代蛋氨酸占比随着施硒时间越靠近成熟期占比越低，拔节孕穗期喷施籽粒硒代蛋氨酸占比最高达到91%，暗示水稻叶片中硒转化时间的长短对水稻籽粒中硒形态有显著影响，不同生育期中越早喷施氨基酸螯合硒，籽粒中硒代蛋氨酸含量比例越高，提早喷施外源硒有利于硒代蛋氨酸有机态硒的形成，可提高籽粒中有机态硒的比例。
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图5 不同时期喷施氨基酸螯合硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占比
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3 讨论
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3.1 不同用量和不同时期外源硒处理对水稻籽粒含硒量的影响
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本研究喷施不同浓度的外源硒可提高水稻不同器官中硒的含量，在一定范围内喷施外源硒浓度越高水稻植株硒含量越高。但当外源硒用量为162.0g/hm2 时稻米籽粒中硒含量反而下降，可能与外源硒用量过高产生毒害作用而影响硒的吸收转化有关。本研究结果中硒在茎、叶中比在籽粒中较容易富集，这与文献[19-22]报道基本一致，但也与有些文献报道叶面喷硒后籽粒硒含量比水稻茎秆高不同[18]。本试验在水稻破口期氨基酸螯合硒施用量分别为6.75、13.5、27.0g/hm2 时水稻籽粒的硒含量均达到广西富硒农产品粮食类地方标准 （DB45/T1061-2014）（0.15～0.50mg/kg）。分别在水稻不同生育期叶面喷施13.5g/hm2 （以硒计）的氨基酸螯合硒，水稻籽粒硒含量由大到小依次表现为：灌浆期> 扬花授粉期> 始穗期> 蜡熟期> 拔节孕穗期，且均达到国家或广西富硒大米标准硒含量的要求。这说明叶面喷施氨基酸螯合硒外源补硒方式对水稻籽粒富硒具有一定效果，且可以到达生产富硒水稻的目的。这对利用叶面喷施氨基酸螯合硒生产富硒水稻的实践中，明确最佳的施硒量和时期以及硒的安全用量具有重要的指导意义。
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3.2 不同外源硒处理对水稻籽粒硒形态的影响
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本研究发现，外源硒处理水稻籽粒中硒主要以有利于人体吸收的硒代蛋氨酸有机硒形态赋存，这与现有文献[17，23-26]报道基本一致。水稻籽粒中硒代蛋氨酸和L-硒-甲基硒代半胱氨酸有机硒含量随喷施外源氨基酸螯合硒用量的增加而增加。在5个不同生育期叶面施硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量均比对照高，除蜡熟期外均比对照有显著效果。硒代蛋氨酸含量占总硒含量的43%～91%，硒代蛋氨酸含量占比随着施硒量的增加有下降的趋势，随着施硒时期越靠近水稻成熟期硒代蛋氨酸占比越低，说明在水稻生育期越早施硒对提高硒代蛋氨酸有机硒的比例越有利。
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4 结论
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在水稻破口期叶面喷施不同用量外源氨基酸螯合硒，适量范围内可显著提高水稻的硒含量，外源氨基酸螯合硒用量过高会抑制水稻籽粒对硒的吸收。水稻籽粒中硒的形态主要为硒代蛋氨酸有机态硒，硒代蛋氨酸含量随喷施外源硒用量的增加而增加，籽粒中硒代蛋氨酸含量变化与总硒含量的变化规律相一致。外源氨基酸螯合硒喷施量为6.75、13.5和27.0g/hm2 时水稻籽粒中硒含量分别为0.167、0.431和0.439mg/kg，达到广西富硒农产品粮食类的地方标准（DB45/T1061-2014）富硒大米硒含量的要求（硒含量0.15～0.50mg/kg）。水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占总硒含量的比例为51.3%～69.0%，与对照相比，其占比有所降低。
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在水稻5个不同生育期喷施氨基酸螯合硒量为13.5g/hm2，水稻籽粒硒含量由大到小依次为：灌浆期> 扬花授粉期> 始穗期> 蜡熟期> 拔节孕穗期，对应的硒含量依次为0.320、0.293、0.250、0.180和0.123mg/kg，均达到国家富硒大米或广西富硒大米标准硒含量的要求。水稻籽粒中硒形态主要为硒代蛋氨酸，不同生育期喷施氨基酸螯合硒可提高硒代蛋氨酸含量，硒代蛋氨酸含量占总硒含量的比例为43%～91%，硒代蛋氨酸比例随着施硒时期越靠近水稻成熟期越低。
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综上所述，本研究在水稻破口期叶面喷施外源氨基酸螯合硒生产富硒水稻的最佳用量为13.5g/hm2，在水稻5个不同生育期喷施13.5g/hm2 外源氨基酸螯合硒均能生产出富硒大米，最佳喷施时期为水稻的灌浆期，研究获得了氨基酸螯合硒肥的科学合理施肥方式，为富硒和低硒地区生产富硒稻米提供科学指导。
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摘要
为研究叶面喷施氨基酸螯合硒对水稻籽粒硒含量及形态的影响，以水稻品种百香 139 为材料，通过大田试验，在水稻破口期叶面喷施不同用量的氨基酸螯合硒，并在水稻拔节孕穗期、始穗期、扬花授粉期、灌浆期、 蜡熟期 5 个不同生育期叶面喷施 13.5 g/hm2 （以硒计）的氨基酸螯合硒，在水稻成熟期测定、分析各处理组水稻地上部不同组织器官硒含量和籽粒硒形态。结果表明，喷施外源氨基酸螯合硒可提高水稻各器官硒含量，在适量范围内水稻植株各器官硒含量随着喷硒浓度的增加而提高；水稻籽粒中硒主要以硒代蛋氨酸存在，水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量与总硒含量的变化规律相一致。喷施氨基酸螯合硒用量为 6.75、13.5、27.0 g/hm2 时水稻籽粒中硒含量分别为 0.168、0.431、0.439 mg/kg，均达到《富硒农产品硒含量分类要求》（DB45/T 1061-2014）的要求。拔节孕穗期至灌浆期喷硒处理水稻籽粒硒含量呈现增高趋势，灌浆期喷硒处理的水稻籽粒总硒含量最高，达到 0.320 mg/kg；水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占总硒含量的比例为 43% ～ 91%，硒代蛋氨酸含量占总硒含量的比例由大到小依次为： 拔节孕穗期 > 始穗期 > 扬花授粉期＝灌浆期 > 蜡熟期，硒代蛋氨酸比例随着施硒时期越靠近水稻成熟期越低，表明水稻叶片中硒的转化时间对稻米中硒形态有显著影响，提早喷施硒有利于有机态硒的形成，提高稻米中有机态硒的比例。在硒的生物强化生产富硒水稻中，水稻破口期叶面喷施氨基酸螯合硒的最佳用量为 13.5 g/hm2 ，在 5 个不同生育期喷施 13.5 g/hm2 的氨基酸螯合硒均能生产出富硒大米，且最佳喷施外源硒的时期为灌浆期。
Abstract
In order to study the effects of amino acid chelated selenium fertilizer on selenium content and speciation in rice grain，a field experiment was carried out with the rice variety Thyme 139 as the material. Exogenous selenium application with different concentration gradients were set up，and the leaf surface sprayed with amino acid chelated selenium was carried out in the fracture stage of rice. The leaves of rice was sprayed with 13.5 g/hm2 of exogenous selenium（calculated as selenium）at five different growth stages，i.e. jointing booting stage，beginning heading stage，flowering stage，grouting stage and wax-ripening stage. The selenium content in different tissues and organs of rice and grain selenium speciation were measured and analyzed in the mature stage. The result showed that sprayed with amino acid chelated selenium increased the content of selenium in different tissues and organs of rice，the selenium content in rice organs increased with the increase of sprayed selenium concentration within the proper range. Selenomethionine（SeMet）was the main form of selenium in rice grains，and the variation of SeMet content in rice grains was consistent with that of total selenium content. The selenium content in rice grains was 0.168，0.431 and 0.439 mg/kg when treated with 6.75，13.5 and 27.0 g/hm2 of exogenous selenium，respectively，which reached the local standard of selenium-rich agricultural products in Guangxi，Classification Requirements of Selenium Content in Selenium-rich Agricultural Products（DB45/T 1061-2014）. The selenium content in rice grains increased with spraying selenium from the jointing booting stage to the grouting stage，the highest selenium content in rice grains was 0.320 mg/kg which appeared at the selenium treatment sprayed at the grouting stage. The content of SeMet in rice grains accounted for 43% ～ 91% of the total selenium content，the ratio of SeMet content to the total selenium content in rice grains showed：the jointing booting stage>the beginning heading stage>the flowering stage=the grouting stage>the waxripening stage. The ratio of SeMet decreased with the period of selenium application closer to the maturity of rice，showed that the transformation time of selenium in rice leaves had a significant effect on the speciation of selenium in rice. Early spraying of exogenous selenium at rice growth period was beneficial to the formation of organic selenium and increased the proportion of organic selenium in rice grains. In this study，the application of selenium bioaugmentation in the production of selenium-rich rice，and the optimal amount of amino acid chelated selenium sprayed on the leaves of selenium enriched rice at the break stage was 13.5 g/hm2 . By spraying 13.5 g/hm2 of amino acid chelated selenium at five different growth stages could produce selenium-rich rice，and the best spraying time of exogenous selenium was at the grouting stage.