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枯草芽孢杆菌KD03液态菌剂的保存方法研究

  • 赵国群1,2

    机 构：

    1. 河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050018

    2. 河北省发酵技术创新中心，河北石家庄 050018

    ×
  • ， 胡伟1

    机 构：

    1. 河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050018

    ×
  • ， 白敬1,2

    机 构：

    1. 河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050018

    2. 河北省发酵技术创新中心，河北石家庄 050018

    ×

1. 河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050018；
2. 河北省发酵技术创新中心，河北石家庄 050018；

Study on storage of liquid microbial inoculant of Bacillus subtilis KD03 at normal temperature

  • ZHAO Guo-qun1,2

    Affiliation：

    1. College of Food Science and Biology，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018

    2. Fermentation Engineering Center of Hebei Province，Shijiazhuang Hebei 050018

    ×
  • ， HU Wei1

    Affiliation：

    1. College of Food Science and Biology，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018

    ×
  • ， BAI Jing1,2

    Affiliation：

    1. College of Food Science and Biology，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018

    2. Fermentation Engineering Center of Hebei Province，Shijiazhuang Hebei 050018

    ×

1. College of Food Science and Biology，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018；
2. Fermentation Engineering Center of Hebei Province，Shijiazhuang Hebei 050018；

作者简介:

赵国群(1963-),教授,博士,研究方向为工业微生物技术。E-mail:gqzhao18@126.com。同时为通讯作者。

DOI:10.11838/sfsc.1673-6257.21408

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目录contents

    摘要

    保质期短是限制液态微生物菌剂在农业生产上广泛应用的主要因素。枯草芽孢杆菌 KD03 是一株具有良好抗黄瓜枯萎病的生防菌。为了提高 KD03 液态菌剂的菌体存活率、延长保质期，采用单因素试验研究了添加防腐剂、碳氮源、醇类物质以及菌剂 pH 值对菌体存活率的影响，在此基础上采用正交试验设计优化菌剂的保存条件。试验结果表明：KD03 液态菌剂中添加防腐剂（山梨酸钾和苯甲酸钠）、碳源（葡萄糖）、氮源（酵母浸粉）、醇类物质（甘油和聚乙二醇）均可显著提高 KD03 的存活率。菌剂 pH 值为 7.0 或为接近 7.0 的弱酸性时，KD03 菌体存活率高。KD03 液态菌剂的最佳保存条件为：山梨酸钾 1.0 g/L、甘油 0.5 g/L、葡萄糖 3.0 g/L，菌剂 pH 值自然（pH 值 6.7）。在此条件下，KD03 液态菌剂室温保存 6 个月后，菌剂活菌数为 3.98×109 CFU/mL，菌体存活率为 82.2%。

    Abstract

    Liquid microbial inoculant has a short shelf life，which is one of main factors that limits its use in agriculture． Bacillus subtilis KD03 has a perfect resistance against Fusarium wilt of cucumber．In order to improve the cell survival of B. subtilis KD03 and increase the shelf life，the effects of preservatives，carbon source，nitrogen source，alcohols and pH value on the cell survivals were investigated using single factor experiments．On this basis，storage conditions of KD03 inoculant were optimized by using orthogonal tests．The result showed that addition of preservatives（potassium sorbate and sodium benzoate），carbon source（glucose），nitrogen source（yeast extract）and alcohols（glycerol and polyethylene glycol）could significantly reduce the cell death and improve the cell survival of B. subtilis KD03．When the pH value of KD03 microbial inoculant was 7.0 or close to 7.0，the cell survival of B. subtilis KD03 was the highest．The best storage condition of KD03 inoculant at room temperature was at 1.0 g/L potassium sorbate，0.5 g/L glycerol，3.0 g/L glucose and the pH value of inoculum is natural（pH value 6.7）．KD03 microbial inoculant was stored under the obtained best storage condition at room temperature for six months，the viable cell number of KD03 microbial inoculant was 3.98×109 CFU/mL， and the cell survival was 82.2%．

  • 农用微生物菌剂是指目标功能菌经过发酵扩繁后加工制成的一种活菌制剂。施用农用微生物菌剂可以改善土壤结构、减少土传病害、促进作物生长、提高作物产量和质量[1-3]。芽孢杆菌是一类重要的生防菌，具有繁殖快、抗逆性强和存活时间长等特点，同时还能够产生抗菌物质或促生物质，有些芽孢杆菌还具有固氮、溶磷和解钾的能力[4]。

  • 生防菌在田间应用时，只有在根际土壤有效定殖并建立起优势种群时才能发挥其生物防治的作用[5-6]。因而，活菌数是微生物菌剂一个非常重要的指标，也是影响其使用效果的最主要因素之一。按照剂型，农用微生物菌剂可分为固态和液态两种类型。目前国内外的农用微生物菌剂市场上以固态菌剂为主，然而，相比于固态菌剂，液态菌剂制备工艺简单，生产成本更低，使用更方便，故此，在国内外市场上仍占有相当大的比重[7-8]。液态菌剂在储存、运输及销售过程中，由于营养贫乏、温度胁迫和低氧等不利的环境条件造成菌剂活菌数快速降低、保质期短，影响了其在农业生产上的应用[9-11]。因此，如何减少菌体在常温储存条件下的死亡，从而获得较长的保质期，是液态菌剂生产及应用上一个亟待解决的问题。目前国内关于液态农用微生物菌剂的保存方法或技术开展的研究还很少。

  • 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KD03是本研究室筛选出来的一株具有良好抗黄瓜枯萎病的芽孢杆菌。在常温储存条件下，本文研究了防腐剂、碳氮源、醇类物质、菌剂pH等对KD03液态菌剂的菌体存活率的影响，并通过正交优化试验获得其最佳的保存条件。

  • 1 材料与方法

  • 1.1 菌种

  • 枯草芽孢杆菌KD03：由本研究室筛选、鉴定并自藏。

  • 1.2 培养基

  • 种子培养基：葡萄糖20.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、磷酸二氢钾4.5g/L、硫酸铵2.5g/L、碳酸钙2.0g/L，pH值自然（pH值6.7）。

  • 发酵培养基：麸皮20.0g/L、蛋白胨5.0g/L、硫酸锰0.3g/L、碳酸钙3.0g/L，pH值8.0。

  • 1.3 试验方法

  • 1.3.1 枯草芽孢杆菌KD03 液态菌剂的制备

  • 挑取2～3环斜面保藏的KD03接种至装有100mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃、 200r/min摇床振荡培养14h，即为芽孢杆菌种子液。以3%的接种量将种子液接种到装有150mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、 200r/min摇床振荡培养3d，即获得KD03液态菌剂。

  • 1.3.2 室温储存条件下KD03 菌体存活率的变化

  • 将制备好的KD03液态菌剂放置于实验室内室温（20～25℃，下同）下静置保存，定时取样，测定菌液中的活菌数，计算菌体存活率。

  • 1.3.3 添加防腐剂对KD03 存活率的影响

  • 向KD03液态菌剂中分别添加苯甲酸和山梨酸钾，使其浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5g/L，未添加防腐剂的菌剂为对照；KD03液态菌剂于室温下静置保存60d。

  • 1.3.4 添加葡萄糖对KD03 存活率的影响

  • 向KD03液态菌剂中添加灭菌50%葡萄糖溶液，使葡萄糖浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0g/L，未添加葡萄糖的作为对照；KD03液态菌剂于室温下静置保存60d。

  • 1.3.5 添加酵母浸粉对KD03 存活率的影响

  • 向KD03液态菌剂中添加灭菌20%酵母浸粉溶液，使其在菌剂中浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5g/L，未添加酵母浸粉的作为对照；KD03液态菌剂于室温下静置保存60d。

  • 1.3.6 添加醇类物质对KD03 存活率的影响

  • 向KD03液态菌剂中添加灭菌20%甘油水溶液，使其在菌剂中浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5g/L；向KD03液态菌剂中添加灭菌聚乙二醇（PEG），使其在菌剂中浓度分别为6.0、8.0、10.0、12.0和14.0g/L，未添加醇类物质的作为对照；KD03液态菌剂于室温下静置保存60d。

  • 1.3.7 菌剂pH对KD03 存活率的影响

  • 将KD03液态菌剂的pH值分别调至4.0、5.0、 6.0、7.0和8.0，以不调pH值的作为对照，KD03液态菌剂于室温下静置保存60d。

  • 1.3.8 KD03 液态菌剂保存条件的优化

  • 为了获得KD03液态菌剂的最高存活率，采用正交试验设计进行保存条件的优化。在单因素试验的基础上，选择了对KD03存活率影响最大的3个因素：山梨酸钾添加量、甘油添加量、葡萄糖添加量，以菌体存活率为指标，设计了3因素3水平的正交优化试验，正交试验设计见表1。按照试验设计，将山梨酸钾、甘油和葡萄糖添加到KD03液态菌剂中，室温下储存6个月。

  • 表1 正交设计试验因素与水平

  • 1.4 活菌数的测定及菌体存活率的计算

  • 活菌数的测定：采用平板菌落计数法[12]测定KD03液态菌剂的活菌数（CFU/mL）。

  • 菌体存活率计算公式如下：

  • W(%)=ml/m2×100

  • 式中：W —菌体存活率；m1—保存后活菌数；m2 —保存前活菌数。

  • 1.5 数据处理

  • 每组做3个平行，变量以平均值 ± 标准差表示，采用SPSS 19.0对每组之间的差异显著性进行 F 检验。

  • 2 结果与分析

  • 2.1 室温储存条件下KD03 菌体存活率的变化

  • 经过检测，室温储存前KD03液态菌剂的活菌数为4.88×109 CFU/mL，芽孢率为99.2%。图1为KD03液态菌剂室温储存期间菌体存活率的变化。从图1可以看出，在菌剂储存之初（储存前10d），菌体死亡率较低（<5.0%），然而，随着储存时间的延长，KD03菌体存活率逐渐降低。当保存时间达60d时，KD03存活率为69.0%，菌体死亡率达到31.0%。本研究在储存期间菌剂没有遭遇过高温，然而，在实际的菌剂生产、储运及销售过程中，特别是夏季会遇到高温。在高温条件下，估计菌体的死亡率会更高。储存期间的菌体死亡与菌液营养逐渐耗尽、溶氧逐渐降低有关[9]，还可能是由于微生物细胞排泄物或毒素的积累所造成的[13]。芽孢是产芽孢菌在生长发育后期在细胞内形成的圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠构造[14]。芽孢具有耐热、耐旱和抗紫外线等多种抗逆性，有利于芽孢杆菌在环境中存活和定殖[15]。通常在干燥的条件（如粉剂）下，芽孢杆菌是耐储存的，但从本试验结果来看，在有大量水分存在的环境下，芽孢杆菌室温储存仍有较高的死亡率，其机理有待进一步研究。

  • 图1 KD03液态菌剂室温储存期间菌体存活率的变化

  • 2.2 添加防腐剂对KD03 存活率的影响

  • 防腐剂通常是指能抑制微生物活动，防止食品腐败变质的一类物质。在液态菌剂中添加防腐剂的目的是让菌体处于生理活性很低的休眠状态，以提高储存期间的菌体存活率。图2为在液态菌剂中添加山梨酸钾和苯甲酸钠对KD03存活率的影响。

  • 如图2所示，经过60d的常温储存，发现与未添加防腐剂的对照相比，添加山梨酸钾和苯甲酸钠可显著提高KD03的存活率，菌体存活率提高了25.8%以上。当山梨酸钾添加量为0.5～1.0g/L时，随着添加量的增加，KD03存活率逐渐上升；当山梨酸钾添加量为1.0g/L时，存活率达到峰值，为93.2%。当山梨酸钾添加量高于1.0g/L时，KD03存活率逐渐下降。Aouadhi等[16]研究表明，山梨酸钾浓度在0.2%时能有效抑制芽孢杆菌及其他微生物的生长。张荣胜等[17]研究发现，添加0.1%山梨酸钾可显著提高解淀粉芽孢杆菌Lx-11液态菌剂的菌体存活率，该结果与本研究的结果类似。苯甲酸钠的效果稍差于山梨酸钾（图2B），当苯甲酸钠添加量为1.0g/L时，KD03的存活率为91.5%。尽管山梨酸钾与苯甲酸钠均属于酸性防腐剂，但山梨酸钾在接近中性（pH=6.0～6.5）的环境中仍然具有较好的防腐效果，对霉菌、酵母菌和好氧细菌均有较好的抑制效果[18]。KD03液态菌剂的自然pH值为6.7，因而添加山梨酸钾更为适宜。

  • 2.3 添加葡萄糖对KD03 存活率的影响

  • 葡萄糖是微生物生长所需的常用碳源之一，向KD03液态菌剂中添加灭菌50%的葡萄糖溶液，使其葡萄糖浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0g/L，室温下保存60d，试验结果见图3。

  • 由图3可以发现，与对照相比，5种浓度的葡萄糖均可明显减少菌体死亡，提高了KD03的存活率，菌体存活率提高了13.3%～22.1%。Taurian等[19]研究发现添加蔗糖可以改善溶磷细菌液态菌剂的菌体存活率，添加糖类物质减少菌体死亡的原因可能是由于改善了菌体的营养条件。当葡萄糖浓度为2.0g/L时，KD03的存活率最高，为91.0%； 当葡萄糖浓度高于2.0g/L时，KD03的存活率反而降低，其原因可能是充裕的营养会将休眠态的细胞转为生长态，从而造成菌体的死亡率增加。因此，适宜的葡萄糖浓度为2.0g/L。

  • 图2 山梨酸钾、苯甲酸钠对KD03存活率的影响

  • 注：柱上不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。

  • 图3 葡萄糖对KD03存活率的影响

  • 2.4 添加酵母浸粉对KD03 存活率的影响

  • 酵母浸粉是培养微生物的常用氮源之一，向KD03液态菌剂中添加不同浓度的酵母浸粉，室温下保存60d，试验结果见图4。

  • 图4 酵母浸粉对KD03存活率的影响

  • 从图4中可以看出，与对照相比，5种浓度的酵母浸粉均可显著提高KD03的存活率，菌体存活率提高了12.6%～18.4%。酵母浸粉在菌剂中的浓度影响其添加效果。当酵母浸粉浓度为1.5g/L时， KD03的存活率最高，为87.3%。添加酵母浸粉提高菌体存活率的原因应与添加葡萄糖相似，也是由于改善了菌体营养条件的缘故，但其效果稍差于葡萄糖。

  • 2.5 添加醇类物质对KD03 存活率的影响

  • 添加甘油对KD03存活率的影响见图5A。如图5A所示，与对照相比，5种浓度的甘油均显著改善了KD03的存活率，菌体存活率提高了12.1%～20.1%。液态菌剂在常温储存期间会遭受营养贫乏和低氧等环境胁迫，细菌菌体会产生胞外多糖来保护细胞，减少死亡[20]。在本研究中甘油可能有类似多糖的保护作用。当甘油浓度在0.5～2.5g/L范围内时，随着甘油浓度的增大，其菌体存活率逐渐下降，这表明甘油浓度较高时反而不利于菌体的存活。在本研究条件下，当甘油浓度为0.5g/L时，KD03的存活率最高，达到了89.0%。

  • 添加PEG对KD03存活率的影响见图5B。从图5B中可以看出，与对照相比，5种浓度的PEG均提高了KD03的存活率，菌体存活率提高了6.1%～14.1%。当PEG浓度为10.0g/L时，KD03的存活率最高，达到了83.0%。Gokul等[21]也发现添加PEG对4种植物促生菌均具有保护作用，可以延长其货架期。从本研究的结果来看，PEG对KD03的保护作用弱于甘油。因此，其它醇类物质或多糖的保护作用还有待更多的研究。

  • 图5 甘油、PEG对KD03存活率的影响

  • 2.6 菌剂pH值对KD03 存活率的影响

  • 如图6所示，当菌剂pH值为4.0～7.0时，随着pH值的升高，KD03的存活率随之增加。当菌剂pH值为7.0时，KD03的存活率最高，达到70.0%。当菌剂pH值增加为8.0时，KD03的存活率下降为65.1%。造成这种结果的原因可能是：无论是酸性环境，还是碱性环境，均对菌体有一定的环境胁迫作用，不利于菌体的存活。因此，菌剂适宜的pH值为7.0。KD03液态菌剂的自然pH值为6.7（对照）。从图6还可发现，对照的菌体存活率与pH值7.0时的差异不显著，因而在本研究条件下，无需调整KD03液态菌剂的pH值。此外，当在菌剂中添加山梨酸钾时，不宜将菌剂pH值调整至7.0，而应调整为接近于7.0的弱酸性，例如，pH值6.5～6.7，以便使其较充分地发挥抑菌作用。

  • 图6 菌剂pH值对KD03存活率的影响

  • 2.7 KD03 液态菌剂保存条件的优化

  • 按照正交试验设计，将山梨酸钾、甘油和葡萄糖添加到KD03液态菌剂（自然pH值）中，储存前有效活菌数为4.84×109 CFU/mL，室温储存6个月，试验结果见表2。从表2的极差分析结果可以发现，各因素对KD03存活率的影响从大到小依次为B、A、C，即甘油> 山梨酸钾> 葡萄糖。正交试验结果得出的最佳保存条件为A2B2C3，即山梨酸钾1.0g/L、甘油0.5g/L、葡萄糖3.0g/L。在此条件下，保存6个月后，菌剂活菌数为3.98×109 CFU/mL，其存活率为82.2%。

  • 表2 正交试验结果

  • 3 结论

  • 枯草芽孢杆菌KD03液态菌剂经过60d的室温 （20～23℃）储存后，菌体存活率为69.0%，菌体死亡率达到了31.0%。为了提高KD03菌体的存活率、延长其保质期，在室温储存条件下，研究了添加防腐剂、碳氮源、醇类物质以及菌剂pH值对菌体存活率的影响，试验结果表明，KD03液态菌剂中添加防腐剂、营养物质及醇类物质均可显著提高KD03的存活率。菌剂pH值为7.0或接近7.0的弱酸性时，KD03菌体的存活率最高。通过正交优化试验，KD03液态菌剂的最佳保存条件为：山梨酸钾1.0g/L、甘油0.5g/L、葡萄糖3.0g/L，菌剂pH值自然（pH值6.7）。在此条件下，室温保存6个月后，KD03液态菌剂的活菌数为3.98×109 CFU/mL，其菌体存活率为82.2%。如何进一步提高菌体存活率、延长液态菌剂的保质期，还有待深入的研究。

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  • 基本信息

    DOI: 10.11838/sfsc.1673-6257.21408

    基金信息

    河北省科技计划项目(19226920D)；

    引用信息

    稿件历史

    收稿日期: 2021-07-31
    录用日期: 2021-09-10

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