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全球气候变化已毋庸置疑。随着人口的剧增和工农业的发展，大气 CO2 浓度已从工业革命前的 280μmol·mol-1 上升至 415μmol·mol-1[1]，如不采取有效减排措施，预计 2050 年将达到 550 μmol·mol-1，2100 年将会增加至 936μmol·mol-1[2]。温室气体 CO2 浓度的快速升高对大气环境的影响加快了全球变暖的趋势，不同预测模型显示，到 21 世纪全球地表平均气温仍将上升 1.8～4℃[1]。气候变化通过影响植物光合生理、碳氮代谢影响植物生长发育，植物又通过营养吸收、根系分泌物等影响土壤微生物群落。土壤微生物是陆地生态系统中的重要组成部分，能够推动土壤养分的生物化学循环，促进植物生长发育，维持生态系统稳定性[3]。细菌作为土壤中种类繁多、数量庞大的微生物物种之一，在土壤有机质分解、腐殖质形成、养分矿化方面起重要功能性作用[4]。真菌是土壤中重要的分解者，可分解土壤中的植物残体和很多难降解的有机物（如纤维素、半纤维素、木质素），改善土壤结构，防治植物病虫害，促进植物生长[5]。土壤中微生物（细菌和真菌）受环境因子的干扰较为敏感，在一定程度上其群落组成、相对丰度等指标可反映作物对养分的吸收利用情况及其生长发育状况[6]。
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我国是世界上氮肥施用量最多的国家之一，氮肥施用量的增加、肥料利用率低、不合理的施肥方式等不仅造成资源的浪费，而且会造成土壤酸化或盐碱化、地下水 NO3- 超标、N2O 等温室气体排放量增加的一系列环境污染问题[7]。缓释氮肥化学养分释放的速率缓慢，释放的周期长，能够满足作物在各个生长阶段对养分的需求，其溶淋挥发损失量少[8]，具有提高氮肥利用率、减少氮肥次数、节省劳动力、减轻病虫害、提高作物产量和品质等优点[8-9]。施用缓释肥还能减少农田 CO2、N2O、CH4 等温室气体的排放，从而减少氮肥施用对环境的压力[10]。目前，关于施肥对土壤微生物影响的研究有很多[11-12]，但关于施用缓释肥对土壤微生物影响的研究较少[13]，而气候变化背景下相关研究还未见报道。开展气候变化背景下缓释肥对土壤微生物影响的研究可为评估未来气候变化下施用缓释肥农田土壤微生物对生态系统的响应提供理论参考，为农业应对全球气候变化提供科学依据。
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传统研究土壤微生物的方法如微生物平板培养法、磷脂脂肪酸法、核酸分析法、Biolog 鉴定法等无法准确反映土壤微生物群落结构组成的差异。随着现代生物信息技术的发展，具有通量高、自动化、准确率高和成本低等优点的高通量测序技术逐渐成为研究环境微生物群落变化的不二选择，其更能真实地揭示其复杂度和多样性[14-15]。本研究利用控制气室试验平台模拟未来气候变化环境，通过基于半导体芯片技术的 IonS5TMXL 测序平台并结合相关生物信息学分析，开展气候变化背景下土壤细菌和真菌群落对缓释肥的响应研究。
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1 材料与方法
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1.1 试验地概况
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本试验于山西农业大学农作站旱作小麦研究所内的控制气室中进行，试验地点位于山西省晋中市太谷区（37.42°N，112.58°E，海拔 767～900 m）。该地区属温带大陆性气候，年平均气温 7～9℃，平均日照时数 2500～2600 h。年平均积温 3250～3500℃，无霜期 130～160 d，年平均地温 13℃，年降水量 450～500 mm。试验区土壤类型为褐潮土，播前有机质含量 23.7 g·kg-1，全氮含量 1.4 g·kg-1，碱解氮含量 45.28 mg·kg-1，有效磷含量 25.65 mg·kg-1，速效钾含量 280.5 mg·kg-1， pH 8.5。
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1.2 试验平台与试验设计
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1.2.1 试验平台
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控制气室为铝合金钢结构，外罩钢化玻璃，可透射 80%～90% 的自然阳光，每个气室的大小为 4 m×8 m，高 3.2 m。每个气室面积一致，共 4 个室。分别为 T0C0（对照温度，对照 CO2 浓度 400 μmol·mol-1）、T0C1（对照温度，高 CO2 浓度 600 μmol·mol-1）、T1C0（对照温度 +2℃，对照 CO2 浓度 400μmol·mol-1）、T1C1（对照温度 +2℃，高 CO2 浓度 600μmol·mol-1），对照气室气温与室外温度一致。采用人工气候调控系统（邯郸，盛炎科技有限公司）自动控制模块调控 CO2 浓度和温度。每个气室内安装 1 台 4000 瓦的空调，根据室内外气温差异通过主控电脑控制大功率空调达到目标温度。气室内的 CO2 浓度传感器（Vaisala，芬兰）采集室内的空气并测定其 CO2 浓度，将数据传输到主控电脑上，按其上的程序来控制各气室电磁阀的开闭，使各个气室的 CO2 浓度控制在目标浓度。每个气室都安装有环流风机，可保证气温和 CO2 浓度的均匀一致。系统还会自动进行空气湿度和土壤湿度的监测。
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1.2.2 试验设计
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试验在控制气室条件下采取盆栽设计，在塑料整理箱（长 × 宽 × 高：60 cm×40 cm×30 cm）中进行，播前取农田耕层土壤过筛混匀，每箱装土 30 kg，约 28 cm 深。在每个整理箱中纵向开两排小沟播种小麦种子，出苗后每排间苗到 40 株左右。小麦品种为良星 99（山东良兴种子研究所选育的高产小麦品种）。在每个气室下分别各设两个施肥处理，分别为普通尿素（CK，N 46%）、树脂包衣缓释尿素（CR，N 45%）。播种时按 105.32、65.49 和 74.00 kg·hm-2 分别施底肥氮肥、磷肥和钾肥，在拔节期按 105.32 kg·hm-2 分别施用普通尿素和缓释尿素。每个处理设置 3 个重复，在气室中完全随机排列。小麦于 2017 年 10 月 10 日播种，2018 年 6 月 10 日收获，期间视土壤含水量状况进行灌水，每次灌水量约为 20 mm，保证无干旱胁迫。
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1.3 土壤样品采集
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土壤取样在小麦孕穗期进行，用于土壤基本理化性质和土壤微生物 16S rRNA 测序。采用不锈钢土钻每箱（共 3 箱作为 3 个重复）在靠近根 10 cm 部位取 3 钻，剔除杂草、石砾与根系等杂物，混匀作为一个样品。一部分立即放入无菌袋并置于冰盒中，立即送往实验室于-80℃保存，用于 DNA 提取和微生物测序；一部分装入密封袋带回实验室过 1 mm 筛，常温下保存，用于土壤理化性状分析。
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1.4 土壤理化性质测定方法
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土壤的理化性质采用土壤常规分析方法测定[16]。pH 值采用 2.5∶1 的水土比，用电位计测定； 全盐采用重量法测定；有机质采用重铬酸钾容量法测定；总磷采用 NaOH 熔融-钼锑抗比色法测定；有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定；碱解氮采用碱解扩散法测定；全氮采用凯氏定氮法测定。
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1.5 土壤 DNA 提取及高通量测序
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采集的土壤样品送于北京诺禾致源科技股份有限公司，由该公司进行土壤 DNA 的提取并通过 IonS5TMXL 测序平台进行微生物细菌和真菌高通量测序。具体方法如下：
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土壤 DNA 提取采用天根公司的磁珠法土壤和粪便基因组 DNA 提取试剂盒（DP712），具体操作按说明书进行。之后对其浓度及纯度通过 1% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格后用于构建文库。
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以土壤样品总 DNA 为模板，对细菌 16S V4 区引物 515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）、真菌 18S ITS1 区引物 ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG-3′）和 ITS2-2043R（5′-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3′）进行 PCR 扩增。PCR 扩增体系：2×taq PCR mix 25μL，Primer F（10μmol·L-1） 1μL，Primer R（10μmol·L-1）1μL，DNA 模板 2μL，dd H2O 补足至 50μL。PCR 扩增程序：95℃ 5 min；94℃ 1 min；57℃ 45 s；72℃ 1 min，34 个循环；72℃ 10 min；16℃ 5 min。PCR 产物使用 GeneJET 胶回收试剂盒（Thermo Scientific 公司）进行回收。文库的构建使用 Thermofisher 公司的 Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒进行，之后经过 Qubit 定量和文库检测合格后，使用 Thermofisher 的 Ion S5TMXL 进行上机测序。
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1.6 数据处理
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使用 Cutadapt[17]对获得的样品数据剪切低质量部分，截去 Barcode 和引物序列，从而得到原始数据，然后去除嵌合体序列最终得到有效数据。利用 Uparse（Uparse v7.0.1001，http：//www.drive5.com/ uparse/）[18] 对所有样本的有效数据在 97% 的一致性下聚类为 OTUs。然后用 Mothur 与 SILVA132 （http：//www.arb-silva.de/） 的 SSUrRNA 数据库[19] 对代表序列进行物种注释（设定阈值为 0.8～1），获得在界、门、纲、目、科、属、种各个分类水平上的群落信息。使用 Qiime（Version 1.9.1）计算 Chao1、Shannon 及 Goods-coverage 指数，采用 Excel2010 进行数据统计，采用 SPSS 20.0 进行方差分析。使用 R（Version 2.15.3）绘制稀释曲线。使用 R 中的 ade4 和 ggplot2 包进行 PCA 分析。使用 R 中 vegan 包的 rda 函数进行排序分析，通过 envfit 函数计算出每个环境因子对物种分布影响的 r 2 和 P 值，然后用筛选出具有显著影响的环境因子做 RDA 分析。使用 R 中 psych 包的 corr.test 函数计算物种和环境因子的 Spearman 相关系数值并检验其显著性。
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2 结果与分析
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2.1 土壤理化性质分析
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由表2 可以看出，在不同气候条件下土壤 pH、含盐量无明显差异。与普通尿素相比，缓释氮肥处理在各气候变化环境下土壤有机质、碱解氮和全氮几乎均有所降低，而土壤有效磷和总磷含量几乎均升高。与对照环境（T0C0）相比，各气候变化环境条件下土壤含盐量、有机质、有效磷、总磷和碱解氮含量几乎均有所升高。
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2.2 土壤细菌真菌 OTUs 丰度及 Alpha 多样性
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本研究对 24 个土壤样品进行 IonS5TMXL 平台测序后，共获得细菌序列数为 2038389，真菌序列数为 2008014。过滤优化去掉低质量序列后，共获得细菌有效序列数为 1933001，各处理平均有效序列数为 80543，在 97% 的水平上聚类获得细菌平均 OTUs 数为 3149，处理 T1C1.CK 下细菌 OTUs 数与 T0C0.CK 相比显著降低；共获得真菌序列数为 1925268，各处理平均有效序列数为 64303，在 97% 的水平上聚类获得真菌 OTUs 平均数为 1161 （表3）。稀释曲线和覆盖率用来评估和反映测序深度和数量的合理性。可以看到土壤细菌的稀释曲线随着测序量增加虽未饱和但逐渐趋于平坦（图1a），处理 T1C1 下稀释曲线最低；土壤真菌稀释曲线随测序量的增加逐渐趋于平缓（图1b）。土壤细菌文库覆盖率为 99.1%～99.9%；土壤真菌文库覆盖率接近 100%（表3）。因此该样品测序数据量合理，能够真实地反映土壤样品中的微生物群落。
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注：同列不同字母表示处理间差异显著（P <0.05）；C 代表 CO2；T 代表温度；F 代表肥料；* 表示 CO2、温度、氮肥及其交互作用在 0.05 水平显著； ** 表示 CO2、温度、氮肥及其交互作用在 0.01 水平显著。下同。
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Shannon 和 Chao1 指数用来分析土壤细菌和真菌群落的 Alpha 多样性，一般 Shannon 指数值越大，表明群落的多样性越高；Chao1 指数值越大，表明群落的丰富度越高[20]。由表3 可知，土壤细菌在处理 T0C1 和 T1C1 下的 Shannon、Chao1 指数相比处理 T0C0 和 T1C0 分别下降 2.05%、3.51%，说明大气 CO2 浓度升高，土壤细菌 Alpha 多样性降低。方差分析结果表明，CO2 对 Shannon 指数的影响达显著水平，CO2 和温度的交互作用对 Chao 1 指数的影响达显著水平。与对照环境 T0C0 相比，土壤真菌的 Shannon 指数在温度升高下有所升高，但未达显著水平；土壤真菌 Chao1 指数未发生显著变化，方差分析表明温度对真菌 Shannon 指数有显著影响。与普通尿素（CK）相比，缓释氮肥（CR） 处理土壤细菌和真菌 Shannon 及 Chao1 指数均未有显著变化，结合多因素方差分析得出，缓释肥未影响气候变化下麦田土壤细菌和真菌群落 Alpha 的多样性（表3）。
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图1 土壤细菌（a）和真菌（b）OTUs 丰度稀释度曲线
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2.3 土壤细菌和真菌群落结构组成 PCA 分析
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主成分分析（PCA）用来分析缓释氮肥处理下麦田土壤细菌和真菌的群落结构。PCA 图中样本距离越接近，表示物种组成结构越相似[21]。图中横纵坐标各表示一个主成分，百分比为各主成分对样品差异的贡献值。在土壤细菌群落中主成分 1（PC1）的贡献率为 8.16%，主成分 2（PC2） 的贡献率为 7.01%；在土壤真菌群落中主成分 1（PC1）的贡献率为 8.80%，主成分 2（PC2） 的贡献率为 6.97%。贡献率值比较小，说明样品之间的群落组成比较相似。可以看到在土壤细菌 PCA 分析结果（图2a）中，各个处理之间分离均不明显，表明各处理下土壤细菌群落结构差异不明显。环境处理 T1C0、T1C1 与对照 T0C0 距离较远，分离明显，表明气温升高下土壤真菌群落结构差异明显（ 图2b）。缓释氮肥（CR） 和普通尿素（CK）处理下细菌和真菌群落结构差异不明显（图中椭圆所示）（图2），表明缓释肥对气候变化下的土壤细菌、真菌群落结构影响较小。
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图2 细菌（a）和真菌（b）群落组成的 PCA 分析
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2.4 土壤细菌优势群落组成及丰度
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根据物种注释结果，将细菌和真菌的门和属分类水平上最大丰度排名前 10 的物种生成物种分布图 （图3，4）。门水平上变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes） 和酸杆菌门（Acidobacteria）为土壤细菌明显优势菌群，其相对丰度所占比例分别为 36.93%、14.13%、 13.30%、15.45%。排名前 10 的依次还有芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，7.62%）、绿弯菌门（Chloroflexi，4.60%），厚壁菌门（Firmicutes，1.57%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，1.17%）、unidentified_Bacteria（0.70%）和浮霉菌门（Planctomycetes，0.35%），共占总类群的 94.43%～95.85%（图3a）。进一步分析处理间的差异表明，施用普通尿素在 CO2 浓度升高（T0C1）条件下、温度和 CO2 浓度同时升高 （T1C1）的条件下比对照环境（T0C0）变形菌门的相对丰度分别增加 14.49%、19.48%（P <0.05），而施用缓释氮肥在各气候环境下变形菌门的相对丰度均没有变化。方差分析表明，CO2、CO2 和缓释肥的交互作用对变形菌门的影响达显著水平（表4）。
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图3 细菌门（a）和属（b）水平上群落相对丰度
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图4 真菌门（a）和属（b）水平上群落相对丰度
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从属分类水平上看 8 个处理共检测分类出 485 个细菌属（图3b），8 个处理中鞘氨醇单胞菌属 （Sphingomonas）为优势菌群，其平均相对丰度最高 （7.17%）。其余为溶杆菌属（Lysobacter，5.81%）、芽球菌属（Blastococcus，2.30%）、unidentified_ Acidobacteria（6.13%）、节杆菌属（Arthrobacter， 4.36%）、斯科曼氏球菌属（Skermanella，2.55%）、赭黄嗜盐囊菌属（Haliangium，2.17%）、拟杆菌属 （Bacteroides，0.71%）、不动杆菌属（Acidibacter， 1.39%）和藓杆菌属（Bryobacter，2.08%）。未被分类的原核微生物类群占到 80.55%。差异分析结果显示，施用普通尿素在 CO2 浓度升高（T0C1）条件下、温度和 CO2 浓度同时升高（T1C1）的条件下比对照环境（T0C0）下鞘氨醇单胞菌属的相对丰度分别显著增加 45.33%、69.69%（P <0.05），而施用缓释氮肥在各气候环境下鞘氨醇单胞菌属的相对丰度均没有显著变化。方差分析表明，CO2、CO2 和缓释肥的交互作用对鞘氨醇单胞菌属的影响达显著水平（表4）。
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2.5 土壤真菌优势群落组成及丰度
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土壤真菌在门分类水平上的类群分布及相对丰度分析表明：优势真菌门为子囊菌门（Ascomycota， 23.68%） 被孢霉门（Mortierellomycota，6.75%）、担子菌门（Basidiomycota，5.44%），其中子囊菌门物种丰度最高。相对丰度排名 >1% 的还有壶菌门（Chytridiomycota，1.78%）、毛霉门（Mucoromycota，1.34%）和球囊菌门（Glomeromycota，1.58%） （图4a）。进一步分析处理间差异表明，在对照环境 （T0C0）及升高温度、CO2 浓度不变（T1C0）的环境条件下，缓释氮肥（CR）处理比普通尿素（CK） 处理子囊菌门分别显著增加 39.84% 和 33.16% （P <0.05）。CO2 和缓释肥的交互作用对真菌子囊菌门的影响达显著水平（表4）。
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8个处理下土壤共检测分类出 271 个真菌属（ 图4b），相对丰度 >1% 的有：毛壳菌属 （Chaetomium，3.48%）、产油菌属（Solicoccozyma， 3.82%）、赤霉菌属（Gibberella，3.35%）、镰刀菌属（Fusarium，4.57%）、被孢霉属（Mortierella， 4.15%）、侵管新赤壳菌属（Neocosmospora，3.61%）、管柄囊霉属（Funneliformis，1.33%）（图4b）。进一步分析处理间的差异表明，在对照环境条件下 （T0C0）和升高温度 CO2 浓度不变（T1C0）条件下，缓释氮肥（CR）处理比普通尿素（CK）处理毛壳菌属分别显著增加 295.33% 和 154.79% （P <0.05）。与对照环境（T0C0）缓释肥（CR）处理相比，CR 处理在 T0C1 和 T1C1 环境条件下毛壳菌属的相对丰度分别显著降低 74.10% 和 79.38% （P <0.05）。方差分析表明，CO2 对真菌毛壳菌属的影响达显著水平（表4）。
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2.6 土壤细菌、真菌群落与土壤理化性质的相关性分析
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基于距离矩阵分析（dbRDA）用来分析微生物群落组成与土壤理化性质之间的关系。在细菌门水平上第一、二轴的解释量分别是 61.61%、24.28%，两轴共解释了 85.98%，基本覆盖了土壤的环境信息。结果显示，土壤总氮、盐分（r 2 =0.38*、r 2 = 0.26*）显著影响了细菌门水平的群落组成。环境因子对门水平的影响顺序从大到小为全氮、盐分、有效磷、碱解氮、pH、总磷、有机质（图5a）。结合表5 可知优势细菌变形菌门与土壤有机质、全氮、碱解氮呈正相关关系，与含盐分、有效磷 （P <0.05）和总磷呈负相关关系。酸杆菌门与土壤全氮显著负相关；芽单胞菌门与碱解氮显著正相关，与全氮显著负相关；厚壁菌门与盐分显著正相关。
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图5b 为真菌在门水平上群落与土壤理化性质的 dbRDA 分析结果，其第一、二轴的解释量分别是 52.11%、26.08%，共解释了 78.19%。结果显示土壤有效磷、pH 显著影响真菌群落门水平 （r2 =0.29*、r 2 =0.22*）的群落组成，且二者呈负相关关系。环境因子对门水平真菌群落的影响顺序从大到小为有效磷、pH、有机质、碱解氮、总磷、盐分。结合表5 可知优势真菌子囊菌门与土壤 pH、有机质、碱解氮和全氮呈负相关，与土壤含盐量和有效磷呈正相关。
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图5 门水平土壤细菌（a）和真菌（b）群落与土壤理化因子的冗余分析
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注：箭头射线代表不同的环境因子，射线越长表示该环境因子影响越大；样本 / 菌群连线与箭头之间的夹角代表了样本 / 菌群与环境因子之间的相关关系，夹角为锐角时表示呈正相关关系，夹角为钝角时表示呈负相关关系。
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3 讨论和结论
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3.1 对细菌和真菌多样性和群落结构的影响
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大气 CO2 浓度升高促进植物光合产物的积累，使根际分泌物增加，会提供给土壤微生物更多的有机底物[22]，从而加快土壤微生物的生长。CO2 升高的条件下微生物会对土壤中诸如氮等矿质养分吸收增加，可能导致土壤硝酸盐和总氮的减少，土壤细菌的生长可能会受到抑制[23]。本研究中，大气 CO2 浓度升高使土壤细菌 Alpha 多样性均降低，且 CO2 对多样性指数 Shannan 产生显著影响。 Hayden 等[24]利用 T-RFLP 技术对澳大利亚草地土壤微生物群落研究发现，CO2 浓度升高和升温环境下土壤真菌多样性也会发生很大改变，可能是由于真菌对土壤氮、碳底物获利强。本研究结果表明，土壤真菌 Alpha 多样性在各气候变化下无显著变化，温度对真菌多样性 Shannan 指数产生显著影响 （表3），可能是作物类型、土壤特性或升高的 CO2 和温度不同所致。升高温度会加快植物根系的衰老过程，从而增加根系分泌物及凋落物数量，加快土壤中有机物的积累，能够使土壤微生物很快的利用充足的碳源[25]。真菌丝状的特性使其可以通过细胞质的流动加强土壤碳、氮养分的利用[26]，会导致土壤微生物群落结构变为真菌占优势[27]。本研究 PCA 分析结果表明，土壤真菌群落结构在气温升高的条件下差异明显，土壤细菌群落结构在各气候环境条件下均无显著差异。这可能是由于温度升高真菌的特殊丝状体结构对土壤碳、氮底物的影响比细菌大所导致。
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Pan 等[28]研究表明，与常规施肥相比，施用缓释肥料基本不会改变黑土的性质，并且对土壤细菌多样性和丰富度无显著影响。张翰林等[29]研究发现秸秆还田 + 缓释肥处理和秸秆还田 + 常规施肥处理在土壤细菌和真菌群落多样性方面均无显著差异。 Wu 等[13]研究显示与常规施肥相比，施用缓释肥并没有显著改变酸性土壤微生物群落的结构。本研究中，缓释氮肥处理与普通氮肥相比，土壤细菌和真菌 Alpha 多样性及群落结构在各气候变化条件下均没有显著变化，说明缓释肥和常规氮肥都可以维持土壤微生物群落的稳定，改善土壤肥力和环境状况。
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3.2 对细菌和真菌优势菌群的影响
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高通量测序结果表明，变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、酸杆菌门为小麦土壤细菌的优势菌门，其中变形菌门相对丰度最高，为 36.93%。研究报道细菌中最大门为变形菌门（Proteobacteria），其中的许多类群能够进行固氮作用，在生态环境构建和物质循环过程中起重要作用，能够适应各种复杂多变的环境[30]。在细菌属水平上，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）为 8 个处理中最大的优势菌属，它在土壤中可降解芳香化合物[31]，产生赤霉素等生长激素来促进植物生长；还能够分泌过氧化氢酶提高植物抗逆性，为植物益生菌[32]。本研究发现大气 CO2 浓度升高条件下，施用普通尿素显著提高了细菌群落中变形菌门和鞘氨醇单胞菌属的相对丰度，这可能是高 CO2 带来的有利因素条件下，小麦根系对土壤环境所产生的适应[33-34]。而与普通氮肥相比，CO2 浓度升高条件下，缓释氮肥处理没有提高变形菌门和鞘氨醇单胞菌属的相对丰度，这可能是由于缓释氮肥养分释放速度缓慢，释放到土壤中的养分数量较少，CO2 浓度升高对土壤碳、氮底物变化的影响还不显著。本研究中 CO2、CO2 和缓释肥的交互作用对土壤变形菌门和鞘氨醇单胞菌属的影响达显著水平，且与普通尿素相比，缓释肥处理下土壤有机质、碱解氮和全氮含量几乎均有所降低，同样可以得到验证。
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从真菌门来看，优势真菌门为子囊菌门、被孢菌门、担子菌门，其中子囊菌门占比最大。子囊菌门大都为陆生腐生菌，很多难降解的有机质如纤维素、木质素和角质素等能够被它分解，在生态系统的养分循环中扮演着重要角色[35]。本研究发现，在对照温度对照 CO2 浓度（T0C0）及升高温度 CO2 浓度不变（T1C0）的条件下，缓释氮肥（CR）处理相比普通尿素（CK）处理子囊菌门丰度均显著增大，同时 CO2 和缓释肥的交互作用对其的影响达显著水平，说明缓释氮肥处理在 CO2 浓度未升高时有利于土壤碳氮养分的循环。从属水平上来看毛壳菌属为最大优势菌属，它是防治植物病害的有益腐生真菌，可分布在植物残体、土壤、粪便、木材等中，并能促进植物生长，诱导植物产生抗性，提高作物产量[36]。本研究发现，与对照环境（T0C0） 缓释肥（CR）处理相比，在 T0C1 和 T1C1 环境条件下，CR 处理毛壳菌属的相对丰度显著降低，在 T0C0 及 T1C0 下缓释肥与常规氮肥相比显著增高了土壤真菌毛壳菌属丰度，且 CO2 对其的影响达显著水平，说明在 CO2 浓度未升高时缓释氮肥处理或许可以通过改善农田土壤肥力、促进作物生长并提高作物的抗病能力来提高产量。本研究中，与普通尿素相比，缓释氮肥处理下土壤有效磷和总磷含量升高，从而为微生物提供了代谢底物。可能由于缓释肥中含有解磷菌，作用于土壤中难溶或不溶的磷，促进土壤有效磷的释放[37]。
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3.3 环境因子对土壤群落的影响
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大气 CO2 浓度和温度的改变，缓释肥的施用，势必会影响到植物生长的土壤系统正常结构及理化特性。本研究中，与对照环境（T0C0）相比，各气候变化环境条件下土壤含盐量、有机质、有效磷、总磷和碱解氮含量几乎均有所升高，这与气候变化对谷子生长的正效应相一致[38]。与普通尿素相比，施用缓释氮肥养分释放慢，在各气候变化环境下土壤有机质、碱解氮和全氮含量几乎均有所降低，而土壤有效磷和总磷含量几乎均升高。土壤理化性质的改变会导致土壤微生物在群落结构、多样性和丰度上的发生改变[39-40]。
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大量研究证实，土壤全氮含量和有机质含量显著影响细菌群落结构[41-42]。土壤微生物群落与土壤理化因子的冗余分析（图5a）表明，土壤全氮对微生物群落的影响最显著，这与 Liu 等[30]的研究结果一致。Juraeva 等[43]研究发现，土壤全氮含量能够影响固氮菌群的分布。本研究中芽单胞菌门与土壤碱解氮和全氮显著相关。研究表明芽单胞菌门对土壤氮素循环中反硝化作用具有重要意义[44]。其次为土壤盐分对细菌群落的影响较大，与盐分影响土壤对水的吸持并影响作物对水分的吸收有关。
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土壤 pH 是影响微生物群落结构组成最重要的因素之一[40]，本研究中，RDA 结果表明土壤 pH 对真菌微生物群落的影响最显著，其次为有效磷。土壤有效磷含量与 pH 呈负相关关系。其主要原因是土壤 pH 会对土壤磷的利用及其有效性产生一定影响[45]，随着 pH 的提高，土壤对磷的吸附降低[46]。土壤其他理化因子对微生物群落结构都有着重要的影响，说明土壤微生物群落结构与土壤环境关系密切。
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本研究首次利用高通量测序技术研究缓释肥处理下麦田土壤细菌和真菌群落对气候变化的响应，得出缓释肥对土壤细菌和真菌的多样性、群落结构的影响均小于气候变化，其可以通过调节有益真菌的相对丰度来改善土壤微生物系统的结构功能。本研究反映了该领域的最新成果，具有一定的科学意义，可为未来气候背景下缓释肥的推广使用提供理论依据。由于本研究主要基于小麦在控制气室内一个生长季的盆栽试验，后续仍需要进行连续多年的深入研究以更好地揭示施用缓释肥下土壤环境微生物对气候变化的响应机制。
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摘要
采用控制系统来模拟未来大气 CO2 浓度和气温升高的气候变化情景，借助基于半导体芯片技术的 IonS5TMXL 测序平台并结合相关生物信息学方法对气候变化背景下缓释肥处理的麦田土壤进行 16S rRNA 细菌 V4 区和 18S rRNA 真菌 ITS 区测序分析，探究了缓释肥处理下麦田土壤细菌和真菌对气候变化的响应。结果显示，所有样品测序后获得细菌和真菌平均有效序列数分别是 80543 和 64303 个，平均 OTUs 分别是 3149 和 1161 个。 Alpha 多样性分析显示，大气 CO2 浓度升高小麦土壤细菌的 Shannon 和 Chao1 指数均降低，而土壤真菌在各气候环境下均无显著差异。主成分分析显示，各处理下土壤细菌群落结构差异不明显，真菌群落结构在气温升高时差异明显。缓释肥处理与普通肥相比，土壤细菌和真菌的 Alpha 多样性及群落结构在不同气候条件下均没有差异。菌群分类学表明，小麦土壤的优势细菌门为变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和酸杆菌门，主要的优势细菌属有 9 种；优势真菌门为子囊菌门、被孢菌门和担子菌门，主要的优势真菌属有 7 种。大气 CO2 浓度升高条件下，施用普通尿素使变形菌门和鞘氨醇单胞菌属的相对丰度分别增加 10.34% 和 46.27%。在对照温度对照 CO2 浓度条件下，缓释肥处理比普通肥处理使子囊菌门和毛壳菌属相对丰度分别显著增加 39.85% 和 295.33%；在升高温度对照 CO2 浓度条件下，缓释肥处理比普通肥处理使子囊菌门和毛壳菌属分别增加 33.16% 和 154.49%。CO2 对变形菌门、鞘氨醇单胞菌属和毛壳菌属的影响达显著水平。在各气候变化环境下，各土壤理化性质均有所改善；与普通氮肥相比，缓释氮肥处理在各气候环境下土壤有机质、碱解氮和全氮含量降低，土壤有效磷和总磷含量升高。冗余分析表明，土壤细菌群落结构主要受土壤全氮和盐分含量的影响，而真菌群落结构主要受土壤 pH 和有效磷含量的影响。研究结果表明，未来气候环境变化对土壤微生物群落的影响大于缓释肥处理。该结果加深了缓释肥对土壤微生物群落结构和多样性影响的认识，为未来气候环境变化下缓释肥推广使用提供理论依据。
Abstract
The controlled gas chamber was used to simulate the future growth environment of increased air temperature and elevated atmospheric CO2 concentration in the future．With the help of IonS5TMXL sequencing platform based on semiconductor chip technology and combined with relevant btoinformatics methods，the 16S RNA gene bacteria V4 region and 18S RNA fungus ITS region of wheat soil treated with slow release fertilizer under the background of climate change were sequenced and analyzed，and response of wheat soil bacteria and fungi to climate change under slow-release fertilizer treatment is explored．The result showed that the average effective sequences of bacteria and fungi were 80543 and 64303， and the average OTUs were 3149 and 1161，respectively．Alpha diversity analysis showed that the Shannon index and Chao1 index of soil bacteria were decreased with the increase of atmospheric CO2 concentration，but there was no significant difference among soil fungi under different environment conditions．Principal component analysis showed that there was no obvious difference in soil bacterial community structure under different treatments，but there was obvious difference in fungal community structure when air temperature increased．Compared with ordinary fertilizer，slow-release fertilizer treatment had no obvious effect on the Alpha diversity and community structure of soil bacteria and fungi no matter what the environment was．At phylum level，the dominant bacteria were Proteobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes，Acidobacteria and the dominant fungi were Ascomycota，Mortierellomycota，Basidiomycota．At genera level，there were 9 genera of dominant bacteria and 7 genera of dominant fungi．Under the condition of increasing atmospheric CO2 concentration，ordinary fertilizer application made the relative abundance of Proteobacteria and Sphingomonas increased significantly by 10.34% and 46.27%．Under the control temperature and control CO2 concentration，the slow-release fertilizer treatment made the relative abundance of Ascomycota and Chaetomium increased by 39.85% and 295.33%，respectively，compared with ordinary fertilizer．Similarly，under the high temperature and control CO2 concentration，the slow-release fertilizer treatment increased Ascomycota and Chaetomium by 33.16% and 154.49%，respectively，compared with ordinary fertilizer． CO2 had significant effects on Proteobacteria，Sphingomonas and Chaetomium．The physical and chemical properties of soil were improved under various climate change environments．Compared with ordinary nitrogen fertilizer，slow-release nitrogen fertilizer treatment decreased the contents of soil organic matter，alkali hydrolyzable nitrogen and total nitrogen， and increased the contents of soil available phosphorus and total phosphorus．Redundancy analysis showed that soil bacterial community structure was mainly affected by the contents of total nitrogen and salt，while fungal community structure was mainly affected by pH and the contents of available phosphorus．The results showed that the impact of future climate change on soil microbial community was greater than that of slow-release fertilizer treatment．The results deepen the understanding of slow-release fertilizer on soil microbial community structure and diversity，and provide a theoretical basis for the popularization and application of slow-release fertilizer for climate change.