烤烟连作障碍是指在正常的栽培管理条件下，同一块地里连续几年种植烟草，导致烟草的生育状况变差的现象^[1]。投入增加、病害加重、产量下降、品质劣化、效益下滑是烟田连作的常见问题，据统计，我国植烟连作面积占植烟总面积的 30%～60%，产生的经济损失高达数 10 亿元^[2]，影响烟草农业的可持续发展。近年来，蔬菜、花卉、药材、水果等产业不断发展壮大，基础设施配套好的基本烟田逐年被挤占，烤烟连作成为较普遍的现象^[3-4]。引起土壤连作障碍的因素主要归结为土壤理化性质的改变、生态环境的恶化、作物的化感自毒作用、土壤微生物区系变化等^[5]。化感自毒作用是指作物通过根系分泌物、残体分解、淋溶等方式分泌或释放有毒化学物质，对同茬或下茬、同种或近缘作物生长产生抑制作用的现象^[6]，成为作物连作障碍的研究热点和重点。化感物质主要来源于植物次生代谢产物，目前对化感物质的研究主要集中在分泌至根际的这类化感物质，对土壤理化性状及土壤微生物活性的影响方面^[7-8]，关于根系内积累的次生代谢产物在烤烟生长发育、品质及产值量形成方面尚未见相关报道。鉴于此，本研究对烤烟根系内积累的次生代谢产物进行因子分析，并对烤烟产值量进行典型相关分析，探究在连作条件下烤烟根系代谢产物积累情况及其对烤烟产值量的综合影响，以期为连作障碍机制研究及制定适宜的连作障碍消减配套措施提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验地点及材料

试验于 2019 年在泸西县开展，供试烤烟品种为云烟 87，试验地植烟土壤为红壤，103.8727°E， 24.6657°N，海拔 1803 m。不同处理试验地在同一连片地块，烤烟于 2018 年收获后，冬闲处理，漂浮育苗，膜下小苗移栽。试验地纯氮用量统一为 105 kg/hm²，于 4 月 18 日烤烟统一移栽时按 75 kg/hm² 进行环施复合肥，第 1 次追肥按 30 kg/hm² 进行浇施复合肥（N∶P₂O₅∶K₂O=12∶8∶25），第 2 次按 150 kg/hm² 浇施硫酸钾（K₂O ≥ 52%）。烤烟其他管理措施统一参照红河州烟草公司优质烟叶生产技术措施进行。

根系次生代谢产物检测仪器及设备：Agilent 6890-5973N 气质联用仪（美国 Agilent 公司），JP040S 型超声波萃取仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司），MS204E 型电子天平（感量 0.0001 g，瑞士 METTLER TOLEDO 公司），Ф13 mm×0.2 µm 微滤膜过滤器（天津腾达过滤器件厂）；Milli-Q 纯水仪 （美国 Millipore 公司）。

试剂：提取液：甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷（德国 Merck 公司，色谱纯）；从烤烟根系中选择对植物有化感作用的 14 种次生代谢产物作为对照品，分别为：苯甲酸、香草醛、十四酸、棕榈酸甲酯、莨菪亭、软酯酸、十七碳酸、亚油酸、亚麻酸、硬酯酸、花生酸、2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）、邻苯二甲酸二辛酯、芥酸酰胺（纯度均大于 98%，阿拉丁试剂公司），并对其进行定量检测；内标：丙酸苯乙酯（纯度大于 98.5%，Fluka 公司）；内标溶液：用丙酸苯乙酯配制相应的内标甲醇溶液。

1.2 烤烟根系取样及次生代谢产物检测方法

选取泸西县连作烤烟地块 12 块，于烤烟封顶后第 7 d，每个地块选取长势相近的烟株 3 株，挖取烤烟根系，仔细冲洗干净后，在 40℃烘干至恒重。磨碎过 0.15 mm 筛混匀后密封保存，备用。

烤烟根系样品中次生代谢产物的提取：称取 5.00 g 样品于具塞锥形瓶中，加 1.0 mL 内标溶液、加 20.0 mL 提取液试剂，提取液为甲醇∶乙酸乙酯∶二氯甲烷 =1∶1∶1 的混合溶液，室温下提取 24 h，3000 r/min 离心 10 min，将离心管内的提取液全部过滤至带 1 mL 尾管的浓缩瓶中，在真空条件下 50℃低温浓缩至 1 mL，用滤膜过滤器过滤，弃去前 0.5 mL 后，滤入进样瓶中，待上机检测。

仪器分析条件：根系中 14 种次生代谢产物采用 SIM 模式质谱定性、内标法定量^[9]。载气：He，2.0 mL/ min；色谱柱：HP-5MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm）； 进样量：1.0 µL；分流比：10∶1，恒流模式；接口温度：280℃；离子源温度：230℃；电离能：70 eV。进样口温度：260℃；程序升温：80℃下保持 1 min，以 5℃ /min 的速率升至 165℃，保持 2 min，再以 2℃ /min 的速率升至 185℃，保持 2 min，再以 10℃ /min 的速率升至 290℃保持 8min。

1.3 数据处理

数据使用 SPSS 21.0 进行相关性分析、主成分分析、因子分析以及典型相关分析，显著性水平取 0.05。

2 结果与分析

2.1 烤烟根系中次生代谢产物自相关分析及 KMO 和巴特利特检验

通过对烤烟根系内次生代谢产物进行分析和鉴定，共确定出 14 种主要次生代谢产物，分别为苯甲酸、香草醛、十四酸、棕榈酸甲酯、莨菪亭、软酯酸、十七碳酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、花生酸、2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）、邻苯二甲酸二辛酯、芥酸酰胺，涵盖了酸、醛、酯、酚、酰胺 5 大类，酸类物质种类最多。烤烟根系次生代谢产物自相关分析结果表明（表1），部分次生代谢产物相关系数在 0.5 以上，其中软酯酸与花生酸、莨菪亭相关系数达到 0.8 以上，可见，烤烟根系次生代谢产物间存在显著或极显著相关性，巴特利特球形度检验显著性达 0.000，KMO 值为 0.583，可进一步作因子分析。

注：* 表示相关性达到显著水平（P <0.05）；** 表示相关性达到极显著水平（P <0.01）。

2.2 烤烟根系次生代谢产物因子分析

对烤烟根系次生代谢产物进行因子分析，利用主成分分析法提取特征根大于 1 的特征因子，并采用正态化斜交法进行旋转。由表2 可知，旋转后提取的前 4 个因子包含了根际次生代谢产物变量总方差的 85.737%，它们对 14 种根际次生代谢产物的方差贡献率分别为 33.464%、18.803%、17.599% 和 15.871%（表2）。

因子载荷表明了原先次生代谢产物与因子间的关联度。由表2 和 3 可知，第 1 因子占有变量总方差的 33.464%，对莨菪亭、软脂酸和花生酸具有高的正载荷，相互之间呈正相关，十四酸具有较大负载荷，与第 1 因子呈负相关，该因子称之为酚酸类因子。表达式为：F1=-0.037× 苯甲酸-0.017× 香草醛-0.260× 十四酸-0.191× 棕榈酸甲酯 +0.303× 莨菪亭 +0.194× 软酯酸-0.049× 十七碳酸 +0.144× 亚油酸 +0.130× 亚麻酸 +0.057× 硬酯酸 ×+0.142× 花生酸 +0.064×2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）-0.098× 邻苯二甲酸二辛酯 +0.007× 芥酸酰胺；第 2 因子占变量总方差的 18.803%，香草醛、邻苯二甲酸二辛酯具有高的正载荷，称为醛酯类因子，表达式为：F2=0.167× 苯甲酸 +0.330× 香草醛-0.080× 十四酸 +0.050× 棕榈酸甲酯-0.033× 莨菪亭 +0.020× 软酯酸-0.056× 十七碳酸-0.109× 亚油酸 +0.136× 亚麻酸 +0.005× 硬酯酸-0.010× 花生酸-0.053×2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）-0.401× 邻苯二甲酸二辛酯 +0.285× 芥酸酰胺；第 3 因子占变量总方差的 17.599%，棕榈酸甲酯、十七碳酸具有高正载荷，称为酸酯类因子，表达式为：F3=-0.103× 苯甲酸 +0.037× 香草醛 + 0.204× 十四酸 +0.578× 棕榈酸甲酯-0.231× 莨菪亭 +0.030× 软酯酸 +0.326× 十七碳酸-0.032× 亚油酸 +0.040× 亚麻酸 +0.246× 硬酯酸 +0.104× 花生酸 +0.149×2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）+0.005× 邻苯二甲酸二辛酯-0.096× 芥酸酰胺；第 4 因子占变量总方差的 15.871%，仅对 2， 2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）有高的负载荷，称为酚类因子，表达式为：F4=0.369× 苯甲酸-0.093× 香草醛 +0.133× 十四酸-0.195× 棕榈酸甲酯-0.004× 莨菪亭-0.096× 软酯酸 +0.048× 十七碳酸 +0.190× 亚油酸 +0.129× 亚麻酸-0.077× 硬酯酸-0.028× 花生酸-0.492×2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）+0.144× 邻苯二甲酸二辛酯 +0.245× 芥酸酰胺。

2.3 烤烟根系公因子次生代谢产物与烤烟产值量典型相关分析

将根际次生代谢产物提取的公因子 F1、F2、 F3 和 F4 作为自变量，烤烟上等烟比例（y1）、中上等烟比例（y2）、产量（y3）、单叶重（y4）和产值（y5）为因变量，进行典型相关分析。由表5 可知，次生代谢产物与产值量的第 1 典型变量和第 2 典型变量的相关系数均达到极显著水平，因此针对第 1 对和第 2 对典型变量进行分析。

第 1 对典型变量 u1=-0.508F1+0.529F2-0.434F3-0.294F4；v1=1.654y1+0.197y2-0.413y3-0.023y4-0.566y5。u1 代表了根际次生代谢产物的综合情况， v1 代表了烤烟经济效益。从第 1 对典型变量可以看出，烤烟根系次生代谢产物中的酚酸类因子（莨菪亭、软酯酸、花生酸、十四酸）和醛酯类因子（香草醛、邻苯二甲酸二辛酯）对烟叶上等烟比例、产量和产值贡献较大。提高烤烟根系内莨菪亭、软酯酸、花生酸的含量，降低十四酸含量，有利于提升烤烟产量和产值，但不利于提高上等烟比例。提高烟根系内香草醛、邻苯二甲酸二辛酯的含量，有利于提升烤烟上等烟比例，但不利于提高烤烟的产量和产值。

第 2 对典型变量 u2=-0.156F1-0.820F2-0.113F3-0.415F4；v2=0.662y1-2.347y2+1.167y3-0.069y4+ 0.722y5。从第 2 对典型变量可看出，烤烟根系次生代谢产物中的醛酯类因子（香草醛、邻苯二甲酸二辛酯）和酚类因子[2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）]对烟叶中上等烟比例、产量和产值贡献较大。提高香草醛、邻苯二甲酸二辛酯和 2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）的含量，有利于提高中上等烟比例，但不利于提高烤烟产量和产值。

3 讨论

化感物质几乎全为次生代谢产物，有不饱和脂肪酸、长链脂肪酸、醌类、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸、香豆素类等。聂铭^[10]研究发现植物化感作用不是受某种单一次生代谢产物的影响，而是受多种次生代谢产物综合影响。且不同作物根系次生代谢产物存在差异，如花生根系次生代谢产物检测到 24 种主要成分^[11]、甜瓜根际土壤中检测到化感物质 16 种^[12]。本研究发现，烤烟根系次生代谢产物含量较大的主要有酸类物质 8 种，为苯甲酸、十四酸、软酯酸、十七碳酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、花生酸，占比最大；醛类 1 种，为香草醛；酯类 2 种，为棕榈酸甲酯、邻苯二甲酸二辛酯；酚类 2 种，为莨菪亭、2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）；酰胺类 1 种，为芥酸酰胺。于会泳等^[13]通过水培试验利用 GC—MS 在 K326 和 NC89 2 个烤烟品种根系检测出的化感物质的种类包括：有机酸类、酰胺类、酯类以及甘油和烟碱，与本研究略有出入，其原因可能是本研究主要分析根系内次生代谢产物积累情况，且烤烟品种不同，其代谢物质也会存在差异，对烤烟生长的影响也会有所不同^[14]。

本研究从烤烟根系内分离检测出 14 种次生代谢产物，且部分代谢产物间存在显著或极显著相关性，经巴特利特球形度检验显著性达 0.000，KMO 值为 0.583，适宜进行因子分析，通过因子分析提取 4 个公因子，基本保留了原变量的特征、差异和相互关系，其中酚酸类因子占原变量总方差的比例高于其他因子，说明该因子在次生代谢产物中的作用最大，对烤烟产值量影响最显著。陈玲等^[15]的研究表明，化感自毒作用主要来源于酚酸类物质，与本研究结果较为相似。本研究中醛酯类因子是第 2 类公因子，主要由香草醛、领苯二甲酸二辛酯解释该因子变量，前人在在松针、西芹中检出邻苯二甲酸二辛酯，且适量浓度下会抑制 2 种作物的生长^[16-17]。第 3 因子为酸酯类因子，由棕榈酸甲酯、十七碳酸解释该因子变量，棕榈酸甲酯在多种作物中发现有化感作用，如在一定浓度下该物质能够抑制玉米、黄豆、黄瓜、水稻的发芽能力^[18]，十七碳酸在胡杨根系分离出对胡杨生长有影响作用的化感物质^[19]。第 4 因子为酚类因子，2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）解释该因子大部分变量，该物质也是大葱根系化感物质，对黄瓜种子萌发有抑制作用^[20]。

以产值量指标为因变量，分析根内积累次生代谢产物对产值量的影响，典型相关分析结果表明，有 2 组典型相关变量关系达到了极显著水平，经分析发现，根系内莨菪亭、软酯酸、花生酸含量越高，十四酸含量越低，越有利于提升烤烟产量和产值，但不利于提高上等烟比例；而提高根系内香草醛、邻苯二甲酸二辛酯、2，2′-亚甲基双-（4-甲基 6-叔丁基苯酚）含量，有利于提高中上等烟比例，但不利于提升烤烟产量和产值。由于烟草香气物质绝大多数是次生代谢产物，如萜烯、醇类、酸类、酚类等，它们对提高烟叶品质和卷烟质量具有重要意义^[21]，但烤烟长期连作，根内积累大量酚酸类次级代谢产物，影响烤烟正常生长，成为烤烟产生连作障碍的主要因子^[22]，这与本研究发现的几种酚酸类物质有助于提升烤烟产量和产值，但不利于提升烟叶上等烟比例的结果较为相似。由此我们推断，烤烟地上部积累次生代谢产物是突出烤烟香气风格、改善烤烟品质的重要物质，但在根内积累量增加可能会影响烟叶外观质量，降低上等烟比例。而香草醛^[23]、邻苯二甲酸二辛酯^[24-25]和 2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）^[26] 已经被报道是多种作物的化感自毒物质，会对作物生长和产量造成负面影响。本研究结果也说明这些物质的积累会对烤烟的产量和产值造成负面影响。因此，如何有效降低根内有害次生代谢产物[如：香草醛、邻苯二甲酸二辛酯和 2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）]的积累，提升对产量和产值有促进作用的次生代谢产物（如：莨菪亭、软酯酸、花生酸）积累，可能是解决烤烟连作障碍的另一途径，也是后续研究的重点内容，为缓解烤烟连作障碍提供技术指导和支持。

4 结论

本研究烤烟根系内检测出 14 种主要次生代谢产物，通过因子分析，提取 4 个公因子，第 1 公因子为酚酸类因子，占有变量总方差的 33.464%，莨菪亭、软脂酸和花生酸具有高的正载荷，十四酸具有较大负载荷。第 2 因子为醛酯类因子，占变量总方差的 18.803%，香草醛、邻苯二甲酸二辛酯具有高的正载荷。第 3 因子为酸酯类因子，占变量总方差的 17.599%，棕榈酸甲酯、十七碳酸具有高的正载荷。第 4 因子占变量总方差的 15.871%，仅对 2， 2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）有高的负载荷，称为酚类因子。以 4 个公因子为自变量，烤烟产值量指标为因变量，分析烤烟根内积累次生代谢产物与产值量之间的相关关系。结果表明，烤烟根系内莨菪亭、软酯酸、花生酸等含量越高，十四酸含量越低，有利于提高烤烟产量和产值，但不利于提高上等烟比例；而提升根系内香草醛、邻苯二甲酸二辛酯和 2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）的含量，有利于提高烟叶等级结构，但不利于提高烤烟产量和产值。

参考文献