测量不确定度定义为“与测量结果相联系的参数，表征合理的赋予被测量之值的分散性”，通过对测量不确定度的合理评定可以定量评价测量结果的质量，并表示出测量的可信程度^[1]。实际检测工作中，测量结果的不确定度可能有很多来源，如定义不完整、取样、基体效应和干扰、环境条件、质量和容量仪器的不确定度、参考值、测量方法和程序中的估计和假定以及随机变化等，反映出实验室的测量条件、人员差异、认识水平以及置信水平等对测量结果的影响^[2]。国家标准 GB/T27025-2020 《检测和校准实验室能力的通用要求》在技术要求方面强化了评定测量不确定度，指出在必要时，要对测量结果不确定度进行评定。

利用植物生长调节剂调控植物生长发育是农业生产的一项重要措施。植物生长调节剂与肥料复配使用能有效提高肥料利用率，提高肥效。近年来，随着水肥一体化及喷灌、滴灌等技术的发展，植物生长调节剂与肥料，尤其是水溶性肥料的复配制剂成为新的研究方向^[3-4]。随着植物生长调节剂的应用增多，其安全问题也受到广泛关注。肥料中植物生长调节剂的不合理施用可能会造成作物生长受抑、产量降低、品质下降，高残留量可能对人体健康带来风险^[5-6]。

2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）是一种在农林生产上广泛应用的人工合成植物激素，常用作除草剂、植物生长调节剂、水果蔬菜防腐保鲜剂^[7]。2， 4-D 的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法 （HPLC）、气相色谱质谱联用法以及高效液相色谱串联质谱法^[8-10]。GB/T37500-2019《肥料中植物生长调节剂的测定高效液相色谱法》规定了肥料中复硝酚钠、2，4-D、脱落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑、吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸等植物生长调节剂含量的测定方法。段路路等^[11]采用 HPLC 法测定水溶性肥料中脱落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑 4 种植物生长调节剂的含量，从人、仪器、物料、方法、环境 5 个方面对测量结果的不确定度开展评定。但 HPLC 法测定水溶肥料中 2，4-D 含量的测量不确定度评定鲜有报道。

本实验参照 CNAS-GL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》^[12]、CNAS-CL01-G003： 2019《测量不确定度的要求》^[13]、JJF1059.1-2012 《测量不确定度评定与表示》^[14]对肥料中植物生长调节剂 2，4-D 测量不确定度进行分析，评估测量参数的相对标准不确定度、合成标准不确定度和扩展不确定度，确定 HPLC 法测定肥料中 2，4-D 结果的分散性与置信范围，以期为控制 HPLC 法测定水溶肥料 2，4-D 含量数据的准确性和可靠性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪，型号 Waters 2695，配二极管阵列检测器 PDA2998，美国沃特世；高速离心机，型号 Avanti J-26XP，美国贝克曼库尔特；涡漩混合器，型号 IKA MS 3 basic，德国艾卡；超声清洗器，型号 SK8200HP，上海科导；电子天平，型号 XS105DU，精度 0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多；微孔滤膜，型号 0.22 µm，有机系，美国安捷伦。

2，4-D 农药纯度标准物质，国家农药质量监督检验中心；甲醇，色谱纯；乙酸铵，色谱纯。

1.2 试验方法

1.2.1 2，4-D 标准溶液的配制

（1）用分析天平称取 2，4-D 标准物质 0.0204 g 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为 2040 μg/mL 的标准储备溶液。

（2）用移液枪准确移取 2.5 mL 的 2，4-D 标准储备溶液至 25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为 204.00 μg/mL 的 2，4-D 标准溶液。

（3）分别用移液枪吸取 2，4-D 标准溶液 0.05、 0.5、1.0、2.5 和 5.0 mL 于 5 个 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到质量浓度分别为 1.02、 10.20、20.40、50.10、102.00 μg/mL 的标准工作液系列。

1.2.2 乙酸铵溶液（0.77 g/L）的配制

称取 0.77 g 乙酸铵，用水溶解并定容至 1000 mL。

1.2.3 样品处理

称取 0.1～1.0 g（精确至 0.0001 g）混合均匀的试样于 10 mL 离心管中，加入 10 mL 甲醇，涡旋振荡 1 min，超声提取 30 min 后冷却至室温，用甲醇定容，高速离心 10 min，取 1 mL 上清液过 0.22 µm 有机相滤膜，待测。

1.2.4 加标样品制备

称取水溶肥料空白样品 6 份各 0.5 g 左右，精密加入浓度为 204.00 μg/mL 的 2，4-D 标准工作液各 1.00 mL，其余步骤同 1.2.3 样品处理。

1.2.5 高效液相色谱条件

色谱柱：150 mm×4.6 mm（内径）不锈钢柱，内装 Atlantis dC18、5.0 µm 填充物； 进样量：10 µL；流速：0.8 mL/min；柱温：35℃；流动相：甲醇 + 乙酸铵溶液 =60+40（体积比）。检测波长： 283 nm。

1.2.6 测量数学模型

按照 GB 37500-2019 的测定方法及结果计算， 2，4-D 含量按下式计算：

$X=\frac{C\times V}{m}$

式中：X—样品中 2，4-D 含量，μg/g；

C—从标准工作曲线得到的被测组分溶液含量，μg/mL；

V —样品溶液定容体积，mL；

m —样品质量，g。

1.2.7 样品测定的不确定度来源分析

根据实验方法和分析步骤，HPLC 法测定肥料中 2，4-D 含量的不确定来源因果图如图1 所示。

2 不确定度评定

2.1 标准溶液引入的不确定度评定

2.1.1 标准物质纯度引入的不确定度

由标准证书可知，标准物质 2，4-D 纯度标准值 98.3%，扩展不确定度为 0.5%（k =2），则相对不确定度为：

$u_{rel}\left(p\right)=\frac{0.5\mathrm{\%}}{2\times 98.3\mathrm{\%}}=0.00254$

2.1.2 标准物质称量引入的不确定度

查校准证书，标准物质称量使用天平的扩展不确定度为 0.3 mg（k =2），实际称量标准物质的质量为 0.0204 g，则天平引入的相对不确定度为：

$u_{\text{rel}}\left(m_{\text{标}}\right)=\frac{0.3}{2\times 0.0204\times 1000}=0.00735$

2.1.3 标准工作溶液配制过程引入的不确定度

2，4-D 标准工作溶液配制过程中使用了 100 µL （吸取 50 µL）、500 µL、1.00 mL、2.50 mL（2 次）、 5.00 mL 移液枪头和 10 mL（6 次）、25 mL 容量瓶。依据 JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》^[15]和 JJG 646-2006《移液器检定规程》^[16]，配制过程中所使用的移液器取矩形分布，玻璃器皿容量瓶取三角分布，温度变化取矩形分布，不确定度见表1 和 2。

按 A 类评定，标准工作溶液配制过程引入的相对不确定度为：

$\begin{array}{c}{u}_{rel}\left(V_{\text{标}}\right)=\sqrt{\begin{array}{c}{u}_{rel}^2（V1）+u_{rel}^2（V2）+u_{rel}^2（V3）+u_{rel}^2（V4）\\ \times 2+u_{rel}^2（V5）+u_{rel}^2（V6）\times 6+u_{rel}^2（V7）\end{array}}\\ =0.0127\\ \end{array}$

2.1.4 标准曲线拟合引入的不确定度

测量 5 个校准标准溶液，以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，采用最小二乘法拟合而成的线性回归方程、测定数据及计算结果见表3。对试样测定 6 次，其试样液 2，4-D 的平均值浓度为： c =19.71 μg/mL。由最小二乘法引入拟合的标准曲线引入的不确定度为：

$u\left(c\right)=\frac{S}{b}\sqrt{\frac{1}{p}+\frac{1}{n}+\frac{(c-\stackrel{-}{c}{)}^2}{S_{cc}}}$

其中：

$S=\sqrt{\frac{\sum _{i=1}^n{\left[A_i-\left(a+b{c}_i\right)\right]}^2}{n-2}}$

$S_{cc}=\sum _{i=1}^n{\left[c_i-\stackrel{-}{c}\right]}^2$

$\stackrel{-}{c}=\sum _{i=1}^n\frac{c_i}{n}$

式中：S 为残差标准差，a 为线性回归方程的截距， b 为斜率，p 为对试样溶液的测定次数，A_i 为标准溶液第 i 个质量浓度点测定的响应值（峰面积）， （a +bc_i）为按回归方程计算得出的第 i 个点的响应值，即理论峰面积值，n 为标准溶液浓度点，c_i 为第 i 个点的质量浓度。

按照上述公式计算得到 S =4232，S_cc =7175，$\stackrel{-}{c}$= 36.744，u（c）= 0.3759，故$u_{rel}（c）=\frac{u（c）}{c}=0.0191$。

综合以上分析，标准溶液引入的相对不确定度为：

$\begin{array}{c}{u}_{rel}（C）=\sqrt{u_{rel}（p{）}^2+u_{rel}{\left(m_{\text{标}}\right)}^2+u_{rel}{\left(V_{\text{标}}\right)}^2+u_{rel}（c{）}^2}\\ =\sqrt{{0.00254}^2+{0.00735}^2+{0.0127}^2+{0.0191}^2}\\ =0.0242\end{array}$

2.2 样品前处理引入的不确定度评定

2.2.1 样品称量引入的不确定度

查校准证书，样品称量使用天平的扩展不确定度为 0.3 mg（k =2），实际称量样品的平均值为 0.4992 g，则：

$u_{rel}\left(m\right)=\frac{0.3}{2\times 0.4992\times 1000}=0.0003$

2.2.2 样品定容引入的不确定度

待测样品用移液器吸取 10 mL 甲醇提取。根据JJG 646—2006《移液器检定规程》，移取 10 mL 溶液，按 B 类评定，移液器容量允差为 0.0125 mL，甲醇的体膨胀系数为（K，20℃）0.00119，取矩形分布，样品定容引入的相对不确定度为：

2.3 测量重复性引入的不确定度

对 6 份平行加标样品溶液进行测定，测量数据如表4 所示。按 A 类评定，样品重复测量引入的不确定度为：

$u_{rel}\left(rep\right)=\frac{S\left(X\right)}{\sqrt{6}\stackrel{-}{X}}=\frac{23.069}{\sqrt{6}\times 391.0}=0.0241$

2.4 回收率引入的不确定度

对 6 份平行加标样品溶液进行测定，测量回收率列于表4，按 A 类评定，回收率引入的不确定度为：

$u_{rel}\left(R\right)=\frac{S\left(R\right)}{\sqrt{6}\stackrel{-}{R}}=\frac{0.79}{\sqrt{6}\times 96.61}=0.00334$

2.5 高效液相色谱仪引入的不确定度

查校准证书，所使用的高效液相色谱仪的定量测量重复性为 0.4%，按均匀分布估算，则该仪器引入的不确定度为：

$u_{rel}\left(I\right)=\frac{0.4\mathrm{\%}}{\sqrt{3}}=0.00231$

2.6 合成标准不确定度

综合以上结果，测量不确定度分量如表5 所示：

合成相对不确定度为：

$\begin{array}{c}{u}_{\text{crel}}\left(X\right)=\sqrt{\begin{array}{c}{u}_{rel}^2\left(m\right)+u_{rel}^2\left(V\right)+u_{rel}^2\left(C\right)+\\ u_{rel}^2\left(rep\right)+u_{rel}^2\left(R\right)+u_{rel}^2\left(I\right)\end{array}}\\ =\sqrt{\begin{array}{c}{0.0003}^2+{0.0155}^2+{0.0242}^2+\\ {0.0241}^2+{0.00334}^2+{0.00231}^2\end{array}}\\ =0.0377\end{array}$

实验测定 2，4-D 的含量为 391.0 μg/g，则合成标准不确定度为：

$u_c\left(X\right)=u_{\text{crel}}\left(X\right)\cdot \stackrel{-}{X}=0.0377\times 391.0\mu \mathrm{g}/\mathrm{g}=14.7\mu \mathrm{g}/\mathrm{g}$

2.7 扩展不确定度

假设测量肥料样品中 2-4 D 含量的值分布为正态分布，95% 置信水平区水平下，包含因子 k 取值 2，扩展不确定度：$U=2u_c（X）=2\times 14.7\mu \mathrm{g}/\mathrm{g}=29.4\mu \mathrm{g}/\mathrm{g}$，

2.8 测量不确定度报告

肥料样品中 2-4 D 含量报告形式，即测定结果表述为：X（2，4-D）=（391.0±29.4）μg/g，k =2。

3 结论

本研究采用高效液相色谱法对肥料样品中 2-4 D 含量的不确定度进行测定和分析，结果表明，样品中 2-4 D 含量以其扩展不确定度的形式表示为 （391.0±29.4）μg/g，（k =2）。根据测量不确定度的主要来源进行了分析和对各个分量不确定度的计算，由图2 可以看出，标准溶液和重复性实验引入的相对标准不确定度最高，其次是样品前处理定容引入的相对标准不确定度。因此，利用高效液相色谱法测定水溶肥料中 2，4-D 含量的过程中，实验人员应熟练掌握操作步骤，增加平行测定次数，降低样品测定过程中引入的随机效应，应重视标准溶液制备与标准曲线拟合，提高标准工作曲线的准确性和可靠性，从而保证实验结果的可靠性和准确性。

参考文献