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地球人口的膨胀导致了土地和水资源的过度使用，最终将导致土地和水资源的稀缺。多年来不断变化的气候条件和不稳定的天气行为加剧了土地和水资源短缺的现有问题，并继续对农业造成损害[1-4]。无土栽培或液体栽培作为传统土壤栽培方式的替代品，一方面可以提高人们应对资源短缺问题的能力，另一方面也可使农业生产从自然生态束缚中脱离出来，通过高精度的环境及营养液控制实现农作物周年连续生产的高效高品质农业系统。水培蔬菜技术目前已比较成熟，植物根系浸泡在营养液中，由营养液提供水分及植物生长所需的各种元素，实际监测结果表明，水培蔬菜从农药、重金属、营养等方面都表现出一定优势，同时水培技术较传统土壤栽培方式也节约资源[5-6]。研究表明，无论在传统土壤栽培方式还是无土栽培方式下，氮肥对蔬菜产量、品质和安全的影响非常明显，其影响程度与氮肥用量、种类、形态及配比相关[7-8]。
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植物生长所需营养来自植物根系，根系微生物与植物之间发生着物质和能量的交换以及信息传递。对于水培生菜而言，营养液中有机氮无机氮组成必定会对根际微生物带来影响，并最终影响生菜产量及品质。以往有一些针对不同施肥方式对土培植物根际微生物的影响研究，对水培生菜的研究主要集中在营养液配方、设施环境对生菜产量及品质的研究[9-10]，缺少水培条件下不同氮源对植物根系微生物影响的研究。本次研究通过比较营养液中 3 种不同有机氮无机氮配施比例对生菜根系微生物多样性及功能的影响，为提升水培生菜品质，进一步深入开展生菜品质的形成与根系微生物之间的机理研究，挖掘水培模式下根系重要微生物，促进现代农业的发展提供科学依据。
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1 材料与方法
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1.1 样品采集
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在成都温江水培蔬菜生产基地取成熟期罗马散叶生菜根系样品，放置于无菌袋中，3 种不同氮源及配施比例营养液灌溉的生菜样品各取 3 份保存在-80℃超低温冰箱中。其中 100% 无机氮源配施生菜编号为 T1，组内 3 个重复样品编号 T1-1、 T1-2、T1-3；100% 有机氮源配施生菜编号 T2，组内 3 个重复样品编号 T2-1、T2-2、T2-3；无机氮源和有机氮源 1∶1 比例配施生菜编号 T3，组内 3 个重复样品编号 T3-1、T3-2、T3-3。3 组生菜生长过程控制完全相同，水培营养液成分除氮来源有差异外，其他成分均相同。
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1.2 根际 DNA 提取、PCR 扩增及 Illumina Novaseq 6000 测序
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使用 HiPure 土壤 DNA 试剂盒（ 中国广州玛根）提取生菜根系 DNA（按照生产厂家规定的方法提取微生物 DNA）。引物序列为：799 F （AACMGGATTAGATACCCKG）和 1193R（ACGT CATCCCCACCTTCC）。从根际 DNA 样本中扩增细菌 16S rRNA 基因，在 V5～V7 区域进行高通量测序。使用引物通过 PCR 扩增核糖体 RNA 基因的 16S rDNA 靶区（94℃ 预变性 2 min，然后 98℃下变性 10 s，62℃ 退火 30 s，68℃退火 30 s，共 30 个循环，最后在 68℃下延伸 5 min）。PCR 反应在一式 3 份的 50μL 混合物中进行，其中包括 5μL 10×Buffer KOD 缓冲液，5μL 2 mmol/L dNTPs，3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5μL F 和 R 引物（10μm）， 1μL KOD 聚合酶，100 ng 模板 DNA。从 2% 琼脂糖凝胶中提取扩增产物，并使用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（axygen biosciences，union city，ca，u.s.） 进行纯化，使用 ABI StepOnePlus Real-Time PCR 系统进行定量分析。纯化的扩增产物在 Novaseq 6000 的 PE250 模式 pooling 上机测序[11]。
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1.3 数据处理
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使用 FASTP 0.18.0、FLSAH 1.2.11、QIIME（version 1.9.1）对原始数据进行去除、过滤和拼接。去除含有 10% 以上未知核苷酸（N）的序列；去除含有少于 50% 碱基且质量（Q 值）高于 20 的序列。将成对的 reads 拼接成一条序列，结束清除读取合并的最小重叠长度为 10 bp，允许错配率最大为 2%。参照 QIIME（version 1.9.1） 的 tag 质量控制流程对原始序列进行过滤，得到高质量的数据。过滤条件如下：从连续低质量值（默认质量阈值≤3）中的碱基数达到设定长度（默认长度为 3）的第 1 个低质量碱基位点切割，然后过滤从连续高质量碱基长度小于 75% 的 Tags。根据参考数据库（r20110519 版本，http：//drive5.com/uchime/ uchime\u 下载 .html）执行基于参考的嵌合体检查，使用 UCHIME 算法，去除所有嵌合体，得到最终有效数据。
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1.4 数据分析
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用 Uparse 对所有样品的全部有效 Tags 序列聚类，默认提供以 97% 的一致性（Identity）序列聚类成为 OTUs（Operational Taxonomic Units）结果，并计算出每个 OTU 在各个样品中的 Tags 绝对丰度和相对信息。采用 Chao1 指数、ACE 指数、Shannon 指数、 Simpson 指数和覆盖度（Good’s Coverage）6 大类常用的 α 多样性指数以及它们的相关分析结果，反映样本的物种丰富度、均匀度和低丰度 OTU 覆盖情况，并使用 Tukey HSD 进行组间差异性分析。使用 Muscle3.8.31 进行序列比对，fasttree2.1 构建系统发生树，然后使用 gunifrac 包 1.0 生成加权和未加权的单帧距离矩阵。采用主坐标分析对数值关系进行图形展示。用 RDP Classifier 的 Naïve Bayesian assignment 算法，与 greengene 数据库进行物种注释（设定置信度的阈值为 0.8～1），得到每个 OTU 的物种注释信息后，根据 OTU 的物种注释信息，统计每个样品在各个分类水平（界门纲目科属种）上的 Tags 序列数目，并绘制柱状图； 使用 R 语言 labdsv 包计算比较组中各物种在每个分组的 indicator value。并使用 cross-validation 进行统计检验，获得 P 值，以气泡图展示。根据 OTU 的物种注释和丰度信息，使用的 PICRUSt2 物种注释进行功能预测，并使用 Tukey HSD 进行组间功能差异性分析。
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2 结果与分析
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2.1 不同处理下根系细菌多样性和丰富度
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利用高通量测序平台对细菌16S rRNA 基因 V5～V7 区测序，不同处理下得到 355～606 个操作分类单元（OTU），各样品测序覆盖度均达到 0.997 以上，表明测序深度已经包含样品中绝大部分细菌，测序数据可靠。不同处理下的 ACE 指示分布在509～707 之间，Chao1 指数在504～710 之间。Simpson 指数在 0.551～0.963 之间，Shannon 指数在1.99～5.94 之间（ 表1），T2 处理下的 Simpson 和 Shannon 指数最高，且与 T3 处理差异显著（P<0.05），因此，100% 有机氮来源的营养液处理条件下生菜根系细菌丰富度和均匀度最高。
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注：Chao1 和 ACE 指数主要关心样本的物种丰富度信息；Good’s Coverage 反映样本的低丰度 OTU 覆盖情况；Simpson 和 Shannon 主要综合体现物种的丰富度和均匀度。不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）。
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2.2 不同处理下根系细菌群落组成
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基于 OTU 列表的物种丰度信息，采用主坐标分析（principal co-ordinate analysis，PCoA）3 种处理条件下细菌群落的相互关系。细菌群落分布（图1）表明，x 和 y 坐标轴共解释了 84.34% 的总体差异，PCoA1 和 PCoA2 是造成不同氮源营养液配方下生菜根系细菌群落结构差异的最主要因素，贡献率分别是 69.24% 和 15.10%。其中，100% 有机氮来源的营养液处理条件下（T2）点主要沿 PCoA1 右侧，PCoA2 上部分布，与无机氮源有机氮源 1∶1 营养液处理条件下（T3）和 100% 无机氮来源的营养液处理条件下（T1）点距离均较远，表明它们之间细菌群落变化较大。T1 与 T3 主要延 PCoA1 左侧分布，距离相对较近，表示这两种处理条件下细菌群落结构相对相似。
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图1 不同氮源配方下生菜根系细菌β多样性主成分分析
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图2显示了所有样本细菌在目水平上的分类，样本中丰度均值排名前 10 的类群分别为假单胞菌目 Pseudomonadales、鞘氨醇单胞菌目 Sphingomonadales、黄色单胞菌目 Xanthomonadales、β-变形菌目 Betaproteobacteriales、柄杆菌目 Caulobacterales、根瘤菌目 Rhizobiales、黄杆菌目 Flavobacteriales、类固醇杆菌目 Steroidobacterales、 Salinisphaerales 和立克次氏体目 Rickettsiales。其中 Pseudomonadales 为 TI 和 T3 样品中主要优势群类，在 T1 样品中相对丰度为 33%～76%，在 T3 样品中相对丰度为 70%～88%，但在 T2 样品中相对丰度明显降低，仅有 4% 左右。Xanthomonadales 为 TI 样品中的第二优势群类，相对丰度为 10%～49%，而该菌在另外两种配方条件下的多数处理中相对丰度不超过10%。Sphingomonadales 为 T2 样品中的主要优势群类，相对丰度为 20%～66%，但在 TI 和 T3 样品中，该菌目相对丰度仅少量（1%～3%） 存在。Betaproteobacteriales 在 3 个样品中的相对丰度分别为 10%、20% 和 5%，变化相对较小。Caulobacterales 在 T2 样品中的相对丰度在 9% 左右，但在 T1 和 T3 样品中仅少量（小于 1%）存在。
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Indicator 分析是基于物种在样本中的丰度和出现频率，计算各物种在每个分组的 indicator value （Indval），数值越大表示物种作为该分组指示物种的可能性越大，即越有可能是该分组的指示物种。使用 R 语言 labdsv 包计算比较组各样本中丰度值>0 且总占比 >0.1% 的物种在每个分组的 indicator value。并使用 cross-validation 进行统计检验，获得 P 值，以气泡图展示（图3），可直观通过气泡大小寻找各分组的 biomarker。使用 Indicator 分析，在属水平发现 10 种差异显著的细菌，其中 T2 处理下生菜根系细菌中鞘脂菌属 Sphingobium、Asticcacaulis、Pelomonas、Phenylobacterium、Uliginosibacterium、IS-44、Methylopila、Pseudolabrys 气泡最大，说明其在样品中 Indval 值最高，为该处理中属水平的指示物种，T1 处理中 Stenotrophomonas 和 Aeromonas 的 Indval 值最高，为该处理下属水平的指示物种，T3 处理中Chryseobacterium的 Indval 值最高，为该处理下属水平的指示物种。
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图2 不同处理下生菜根际细菌群落在目水平的组成
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图3 属水平的指示物种分析
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2.3 不同处理下根系细菌功能预测
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利用 PICRUSt2 预测了 3 种不同氮源营养液处理下生菜根系细菌群落功能及差异（图3 和图4）。比较表现最强的前 27 个功能，T1 和 T3 处理下生菜根系细菌群落功能无显著差异，但 T2 与 T1 处理，T2 与 T3 处理下存在较大差异。其中，T2 与 T1 处理比较，氨基酸代谢、信号转导、辅助因子和维生素的代谢、传染病活动、细胞运动、细胞生长和死亡、癌症这几项活动差异极显著（P<0.001），膜运输、核苷酸代谢、翻译、异生化物的生物降解与代谢、聚糖的生物合成和代谢、其他次生代谢物的生物合成、内分泌系统、环境适应性、神经变性疾病、转录功能均差异显著（P<0.01 或 P<0.05）。T2 与 T3 处理相比，差异显著的功能与 T1 比较少了 3 项，分别是核苷酸代谢、翻译和转录功能，其他差异功能与 T1 处理相同。碳水化合物代谢、能量代谢、复制和修复、脂质代谢、萜类和多酮类化合物的代谢、折叠、分类和降解、运输和分解代谢功能在 3 个处理中均无显著差异。值得注意的是，3 个处理中碳水化合物代谢和氨基酸代谢是最丰富的代谢途径，氨基酸代谢活动在 T2 处理下显著增加，且与 T1 和 T3 处理差异极显著（P<0.001）。由图5 可以发现，在 T2 处理下的前 20 个代谢途径中，脂质代谢、萜类和多酮类化合物的代谢、信号转导、细胞运动、内分泌系统、聚糖的生物合成和代谢及传染病活动显著低于其他两个处理，而其他功能活动均有较高的表现。
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图4 3 种不同处理下生菜根系细菌功能差异
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注：* 表示不同处理中的相对丰度差异显著，* 表示 P<0.05，** 表示 P<0.01，*** 表示 P<0.001，ns 表示差异不显著。
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图5 3 种不同处理下生菜根系细菌功能预测
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3 讨论
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3.1 不同氮源添加营养液处理下生菜根系细菌群落结构分析
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在过去的大量报道中，人们针对传统土壤栽培模式下植物根际微生物与植物之间的相互关系进行了深入研究，Stassen 等[12]最新的研究表明在植物微生物群-根-茎轴中，有益根际细菌的根定植可以促进植物生长提高免疫，同时叶的代谢物与激素产生会传播改变根结构的系统信号，并通过根系分泌物的变化引起根际环境的变化，从而增强营养吸收和根相关微生物群的形成。多篇研究揭示了根际微生物与植物病原菌的关系，研究表明，随着植物的生长或不断成熟，根际群落组合转变为更多的生态位驱动的群落组合，这些变化可能与微生物组的功能有关，多样性通常与群落功能呈正相关[13-14]。研究结果表明，从根系细菌群落分布来看，水培生菜根际微生物区系中细菌类群与传统土壤栽培模式下叶类蔬菜根际微生物差异比较大[15]。说明虽然水培营养液能像土壤一样为植物生长提供必需的化学物质，但营养液和土壤在与生菜根系分泌物之间的能量和物质交换过程中可能存在一定的差异。3 种氮源营养液配施的生菜根系细菌群落物种组成上并没有体现出显著差异，尤其是在无机氮源营养液中加入 50% 有机氮源对生菜根系细菌群落的组成非常接近，但在 T2 处理下生菜根系细菌丰富度最高，这可能预示更多的功能特征或是更强表达。其中，鞘氨醇单胞菌目仅在使用完全有机氮来源的营养液配方栽培的生菜根系细菌中表现为最主要的优势菌目，进一步指示物种分析则表明，鞘脂菌属丰度极高。鞘脂菌属是植物根际常见的细菌，可对植物病害，如软腐病的控制及促进生长方面起到更积极的作用[16-17]，有研究表明，它能够产生铁载体和吲哚-3-乙酸来诱导根系生长。另外，一些定植在植物根系的鞘脂菌属能够通过减少根中过氧化物 （H2O2）和超氧阴离子浓度，减少植物被有害重金属的污染，提高植物对有害重金属的耐受能力，对蔬菜质量安全起到积极作用。
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与 T2 处理不同的是，TI 和 T3 处理下，假单胞菌目代替鞘氨醇单胞菌目成为了第一优势菌目，其中寡养单胞菌属为 T1 处理下丰度最高的指示物种，该属细菌在植物系统发育中广泛分布于根系和内部，是植物系统发育中的活跃参与者，在该菌属目前 16 个种的成员中，既有从临床病人体内分离得到的条件致病菌，也有从植物根际、污水污泥等环境中分离得到的环境有益菌。部分菌株在调节植物生长、辅助生物修复、抵抗植物病原体、降解农药等方面，表现出良好的应用研发前景[18-19]。同样属于 T1 处理下的指示菌，气单胞菌属的一些细菌被认为是一种能感染人类和动物包括各种水生生物的病原体，其对植物的影响还不十分明确[20]。 T3 处理下的优势菌黄杆菌中的一些菌种被证明是有效的生物防治剂，可以减少病害的发生，从而减少农药的使用，提升农产品的质量安全。另外，该菌属同样可以通过合成吲哚-3-乙酸等途径促进植物的生长。
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3.2 细菌群落功能预测分析
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通过 PICRUSt2 功能预测发现，不同处理组中生菜根系细菌共涉及代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞分裂、器官系统和人类疾病 6 类代谢通路。其中，3 种处理下代谢均为主要功能，说明水培模式下，根系代谢仍然对植物生长起着重要作用。研究表明，碳水化合物代谢与植物生长和发育密切相关，尤其是氮磷间的循环和平衡[21]。氨基酸代谢则与植株氮素的循环相关性非常大[22]。本次研究中 3 种处理下对根系细菌碳水化合物代谢功能没有显著差异，但在 100% 有机氮源处理下的根系细菌群落氨基酸代谢功能显著增加。预示完全有机氮配方的营养液较其他 2 种处理可能更有利于水培生菜生长过程中的氮素循环。另外，膜输送也是本次试验中发现的主要功能，且在 100% 有机氮源处理下显著增强。膜输送过程在植物生理的许多方面都是必不可少的，包括矿物质营养、溶质贮存、细胞代谢、细胞信号转导、渗透调节、细胞生长和逆境反应[23]。
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4 结论
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综上所述，3 种氮源组合营养液对生菜根系细菌群落组成影响较小，但各自的优势菌属有所不同，这些菌属均可对生菜的生长起到促进作用，但从蔬菜质量安全角度来看，完全有机氮源营养液可能更有利于减少生菜中重金属的累积，更强的氨基酸代谢和膜输送功能则可能对蔬菜营养品质带来正面的影响。无机氮源及加入 50% 有机氮源营养液则可能在农药降解和生物修复方面表现更好。但是，在传统土壤栽培模式下有机无机氮对作物生长及土壤的影响中发现，有机氮的加入会促进作物的生长并对土壤的改良具有推进作用，但不同作物的最佳配施比例不尽相同[24-25]。本次试验针对 3 种配方比例无机有机氮源营养液对水培生菜根系微生物影响及功能预测，可为水培模式下营养液中有机无机氮最佳配施方式的选择提供一定的科学依据和参考，从而提升水培模式下的蔬菜质量。
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摘要
水培技术用于蔬菜生产是对传统土壤栽培模式的重要补充，也是现代农业的重要手段，研究不同氮源配比营养液对水培生菜根系微生物群落组成及功能预测对水培生菜质量安全具有重要意义。水培试验地位于四川省成都市温江区，营养液处理包括：100% 无机氮源（T1），100% 有机氮源（T2），50% 无机氮源和 50% 有机氮源（T3）。不同处理生菜生长过程控制完全相同，水培营养液成分除氮添加有差异外，其他成分均相同。采用高通量测序方法测定生菜根系微生物群落结构并进行功能预测。α 多样性分析表明，3 个处理细菌种类无显著性差异，T2 处理生菜根系细菌丰富度和均匀度最高。主坐标分析表明，T2 处理根系细菌群落结构与 T1、T3 之间差异较大，T1 与 T3 处理细菌群落结构相对相似。物种组成分析表明，在目水平上，3 个处理下分离到丰度排名前 10 的类群分别为假单胞菌目、鞘氨醇单胞菌目、黄色单胞菌目、β- 变形菌目、柄杆菌目、根瘤菌目、黄杆菌目、类固醇杆菌目、Salinisphaerales 和立克次氏体目。其中 Pseudomonadales 为 TI 和 T3 样品中的主要优势群类，Xanthomonadales 为 TI 样品中的第二优势群类。Sphingomonadales 为 T2 样品中的主要优势群类。在属水平发现 10 种差异显著的细菌，其中 T2 处理下生菜根系细菌中鞘脂菌属、Asticcacaulis、Pelomonas、 Phenylobacterium、Uliginosibacterium、IS-44、Methylopila 和 Pseudolabrys 的 Indval 值最高，为该处理中属水平的指示物种，T1 处理下 Stenotrophomonas 和 Aeromonas 的 Indval 值最高，为该处理中属水平的指示物种，T3 处理中 Chryseobacterium 的 Indval 值最高，为该处理中属水平的指示物种。PICRUSt2 功能预测分析发现，碳水化合物代谢和氨基酸代谢是 3 个处理下根系细菌最丰富的代谢途径，区别在于氨基酸代谢、辅助因子和维生素的代谢活动在 T2 处理下显著增加，且与 T1 和 T3 差异显著或极显著，但脂质代谢、萜类和多酮类化合物的代谢、信号转导、细胞运动、内分泌系统、聚糖的生物合成与代谢及传染病活动显著低于 T1 和 T3 处理。因此加入有机氮的营养液生菜根系细菌丰富度更高，同时表现出更强的功能特征。但如果仅加入 50% 有机氮营养液对细菌群落和功能的影响不十分明显。100% 有机氮来源营养液配方可能对生菜生长及品质带来更多正向的影响。
Abstract
The application of hydroponic technology in vegetable production is an important supplement to the traditional soil cultivation mode and an important means of modern agriculture，so it is important to study the composition and function of microbial community in the root of hydroponic lettuce by using different proportion of nitrogen sources．The hydroponic test site was located in Wenjiang district，Chengdu city，Sichuan province．The nutrient solution treatment included：100% inorganic nitrogen（T1），100% organic nitrogen（T2），50% inorganic nitrogen and 50% organic nitrogen（T3），with all treatments set up with replications．The control of the growth process of lettuce in three treatments was the same，except the nitrogen addition was different in the nutrient solution of hydroponics．A high throughput sequencing method was used to determine the microbial community structure in the root of lettuce and to predict its function．Diversity analysis showed that there was no significant difference in bacterial species among the three treatments，but the highest bacterial richness and evenness was observed in the root of lettuce treated with 100% organic nitrogen．The results of principal coordinate analysis showed that the community structure of root bacteria under T2 treatment was quite different from that of T1 and T3 treatment， and that of T1 and T3 treatments was relatively similar．Species composition analysis showed that，at the order level，the 10 most abundant taxa were pseudomonadales，sphingomonas，xanthomonas，Betaproteobacteria，stipe，rhizobium， flavobacterium，steroid baciliales，Salinisphaerales and Rickettsiales．Pseudomonadales was the dominant group in TI and T3 treatments，Xanthomonadales was the second dominant group in T1 treatment．Sphingomonadales was the dominant group in the T2 treatment．Ten distinct species were found at genus level，among which Sphingobium，Asticcacaulis，Pelomonas， Phenylobacterium，uliginosibaterium，IS-44，Methylopila and Pseudolabrys had the highest Indval values among the root bacteria of lettuce under T2 treatment，the Indval values of Stenotrophomonas and Aeromonas were the highest in the T1 treatment and the Indval value of Chryseobacterium was the highest in the T3 treatment．Functional prediction analysis of PICRUSt2 showed that carbohydrate metabolism and amino acid metabolism were the most abundant metabolic pathways in the three treatments，and the metabolic activities of amino acid metabolism，cofactors and vitamins were significantly increased under T2 treatment，and the difference with T1 and T3 treaments was significant or extremely significant，however，lipid metabolism，terpenoids and polyketones metabolism，signal transduction，cell movement，endocrine system biosynthesis， glycan metabolism and infectious disease activity were significantly lower than those of T1 and T3 treatments．Adding organic nitrogen nutrient solution to lettuce root had higher bacterial abundance and stronger functional characteristics．However，if only 50% organic nitrogen nutrient solution was added，the effect on bacterial community and function was not obvious．The formula of 100% organic nitrogen source nutrient solution may bring more positive effects on the growth and quality of lettuce.