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菌根可被分为内生菌根和外生菌根两大类别。内生菌根包括丛枝菌根、杜鹃花科菌根和兰科植物菌根，其中丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM） 真菌属于球囊菌门（Glomeromycota）[1]，它与超过 2/3 的陆地植物形成重要的共生关系，是最广泛和最古老的菌根共生类型[2]。在这种共生关系中，一方面，AM 真菌可以从土壤中吸收氮、磷、硫等营养元素，从而改善宿主植物的生长；另一方面，宿主植物将一部分碳水化合物分配给真菌，以促进真菌的生长[3]。小麦（Triticum aestivumL .）是世界主要的粮食作物之一，也是一种菌根作物。研究表明，接种 AM 真菌可以显著提高小麦对氮、磷及其它矿质元素的吸收和利用[4-5]。
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许多研究表明，不同品种小麦菌根侵染率有显著差异。盆栽试验发现，接种 AM 真菌混合菌剂 （R. intraradices、F. mosseae、F. geosporum）后，小麦的菌根侵染率达到 51%～70%[6]。有研究对 94 个不同基因型冬小麦的菌根侵染率进行测定，发现菌根侵染率在 24%～56% 之间[7]。另外一项研究对 108 个硬粒小麦品种进行侵染率测定，发现侵染率介于 9%～44% 之间[8]。毛琳[9]研究发现，21 个小麦品种的总侵染率介于 20%～50% 之间，其中有 16 个品种侵染率介于 25%～40% 之间，平均值为 31.8%。此外，有研究发现，5 个不同品种的小麦，有的容易被 AM 真菌侵染，有的则不易被侵染。在养分贫瘠的生长条件下，AM 真菌侵染率较高的处理中小麦对锌的吸收量要显著高于 AM 侵染率较低的处理[10]。然而，也有研究发现，接种 AM 真菌后，10 个小麦品种的菌根侵染率在 20%～25% 之间，品种间并无显著差异[11]。因此，小麦菌根侵染率的品种间差异可能受小麦品种构成以及 AM 真菌种类的显著影响。
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参与植物与 AM 真菌共生过程的基因有很多，已经被鉴定的基因属于多个基因家族，大体可以分为转录因子、转运蛋白、酶及其他基因 4 类。转录因子主要有 GRAS 转录因子家族、AP2 转录因子家族、MYB 转录因子家族等；转运蛋白主要有 ABC 转运蛋白、蔗糖转运蛋白、铵转运蛋白等；酶主要有 LysM 受体激酶家族、细胞色素 P450、ATPase、钙 / 钙调蛋白调节受体样激酶家族等，其它基因包括 F-box 蛋白、外囊复合体成分（Exocyst complex component）和膜类固醇结合蛋白（Membrane steroid-binding protein）等[12]。AM 真菌释放的分子信号很可能被植物 LysM 受体样激酶如 OsCERK1、 SlLYK10、LjNFR1、MtLYK3、SYMRK/DMI2 和 NFR5/NFP 样蛋白识别，从而触发植物细胞中 AM 共生所需要的信号通路[13-14]。SYMRK 是一种受体样激酶，它参与了微生物信号分子的识别和钙离子峰值的激活过程[15]。在信号传导阶段，钙调蛋白与 CCaMK 结合，导致其蛋白构象发生变化，从而诱导 CCaMK 底物蛋白 CYCLOPS 的磷酸化[16]。磷酸化 CYCLOPS 与 CCaMK 形成复合物，CCaMK 与 GRAS 转录因子（ 例如 DELLA 蛋白）协同作用，以启动 RAM1 等下游基因的表达[17]。作用于 SYM 通路下游的是转录因子，包括 NSP1、NSP2 和 RAM1[18]，它们都属于 GRAS 家族。目前已经发现了 60 多个菌根共生参与的基因，然而，这些基因一般是在苜蓿（Medicago truncatula L.）、百脉根 （Lotus japonicus L.）等模式中发现的，对于哪些关键基因参与小麦菌根共生过程尚不清楚。
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转录组测序技术主要是对 mRNA、sRNA 等进行高通量测序，以全面、快速地获取所研究样本的几乎所有的转录本，从而反映其表达水平[19]。目前，转录组测序技术已经成功用于水稻（Oryza sativa L .）、玉米（Zea mays L .）、小麦等主要粮食作物的大规模测序研究中[20]。转录组测序发现，AM 侵染调控了小麦根中多达 11746 个基因的表达，其中 1106 个基因仅在 AM 真菌侵染的根中表达，108 个基因仅在非菌根的根中表达，许多参与分子信号生物合成和识别、丛枝形成、AM 共生过程中碳和营养交换的关键基因都能够响应菌根的侵染[21]。然而，在众多被调控的基因中，识别菌根共生关键参与基因难度很大，而利用菌根侵染率差异明显的小麦品种，比较菌根共生参与基因对菌根侵染响应的差异状况，对于理解小麦与菌根的共生机制具有重要意义。
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本研究以 20 个不同小麦品种进行盆栽试验，首先调查了不同小麦品种的菌根侵染率差异，然后将筛选到的菌根侵染率具有明显差异的两个小麦品种进行转录组分析，比较两个品种根系菌根共生参与基因对菌根侵染的响应，旨在进一步鉴定小麦菌根共生关键参与基因，为深入理解小麦与 AM 真菌共生的分子机制提供依据。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料与设计
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将搜集到的 20 份小麦材料，于 2017 年 10 月至 2019 年 6 月，在西北农林科技大学网室（34°16′N， 108°4′E）中进行两年的盆栽试验，每个小麦品种 3 个生物学重复。盆（ 直径 20.5 cm，高 14.5 cm）中装满 2.5 kg 经过高温蒸汽灭菌（120℃，120 min） 的土壤和石英砂混合物（1∶1，v/v）。供试土壤为土，其有机质与磷含量均较低[21]。接种使用 Claroideoglomusetunicatum，Rhizophagusintraradices、Funneliformismosseae、Acaulospora delicate4 种菌剂均匀混合，每盆接种菌剂 200 g，接种剂含有 AM 真菌孢子、根外菌丝和被侵染的根段，每个盆中先填充约 1.0 kg 土壤与石英砂的混合物，然后添加 200 g AM 真菌混合菌剂。最后，用砂土混合物覆盖 AM 真菌混合菌剂至每盆的 4/5 处。在 2017～2018 年的生长季，施用尿素和硫酸钾作为播种前的肥料，养分添加量分别为 N 0.1 g/kg 和 K2O 0.05 g/kg，未施磷肥；在 2018～2019 年的生长季，播种前施用尿素、磷酸二氢钾和硫酸钾，养分添加量分别为 N 0.2 g/kg，P2O5 0.05 g/kg 和 K2O 0.05 g/kg。将肥料与土壤-石英砂混合物均匀混合，并在种植前一周用 500 mL 水浇灌盆栽。在每个盆中种植 15 粒预发芽的小麦种子，并在播种后 15 d 将盆间苗为 8 株，必要时浇水。
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1.2 菌根侵染率测定
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在小麦成熟时，将小麦根部从土壤中分出，用自来水冲洗干净并剪成约 1 cm 的根段。测定前将根系样品储存在-20℃的冰箱中。测定时，将大约 0.5 g 的小麦根系用于 AM 侵染率的测定。根段于 90℃水浴中用 10% KOH（w/v）透明 1 h，用水洗涤，然后用 2% HCl（v/v）酸化 5 min，酸化后的根用 0.05% 酸性品红溶液（v/v）在 90℃水浴染色 30 min，然后用乳酸甘油溶液（乳酸∶甘油∶水 = 1∶1∶1，v∶v∶v）脱色 8 h[22]。脱色完成后，随机挑选 30 个根段，用显微镜在 100 倍下观察菌根侵染程度，使用 Mycocalc 计算菌根侵染率（M%）[23]。
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1.3 不同侵染率小麦品种转录组分析
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从 20 个小麦品种中筛选出扬麦 14（高侵染） 和小红麦（低侵染）两个菌根侵染率差异明显的小麦品种，用于转录组分析。设置两种 AM 接种处理：（1）非菌根处理，（2）AM 接种处理。所用盆栽和 AM 接种方法同上，每个处理 3 个生物学重复。每盆播种 15 粒种子，播种后 5 d 将植株间苗至每盆 10 株。小麦植株在 23℃ /18℃（白天 / 黑夜）下培养，必要时浇水，培养 6 周后收获。从土壤中收集根系，用蒸馏水清洗，切成小段，混合均匀，分成两份，一份保存在液氮中用以后续提取 RNA，另一份保存在-20℃下，用于菌根侵染率的测定。
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1.3.1 总 RNA 提取与转录组测序
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使用植物总 RNA 提取试剂盒（Qiagen，美国） 从 100 mg 小麦根中提取总 RNA。对总 RNA 的浓度、纯度、完整性等进行检测，以保证实验样本的可用性。使用 NanoDrop 分光光度计（Thermo Scientific）评估总 RNA 样品的质量和浓度，使用琼脂糖凝胶电泳进行验证。然后，将 RNA 样本送到武汉博越致和生物科技有限公司，使用 Illumina HiSeq2000 进行 cDNA 文库和测序[24]，共构建了 12 个独立的 cDNA 文库。使用 Agilent 2100 生物分析仪和实时定量 PCR 验证 cDNA 文库的质量和片段的长度。根据 CLC Sequence Viewer，片段长度分布在预期范围内，平均读取长度为 150 bp。使用 Illumina HiSeq PE150 系统在双端系统（2×150 bp）中对所得 cDNA 文库进行测序，样品被单独标记用于文库构建。
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1.3.2 生物信息学分析
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为了保证信息分析质量，对测序获得的原始序列进行过滤，得到高质量测序序列，用于后续分析。采用 Fastp V0.20[25]进行质量过滤，数据过滤的主要步骤如下：（1）去除接头序列；（2）去除低质量（质量值低于 15）碱基数超过该条 Read 长度比例 40% 的 Reads；（3） 去除“N” 碱基数超过 5 的 Reads；（4） 从 Reads 的 5’端（ 即 Reads 的开头）开始，按照阈值（20）进行质量过滤； （5）去除过滤后 Reads 长度小于 36 的 Reads。使用 Hisat2[26] 将高质量序列与小麦参考转录组 “IWGSC_RefSeq_Assemblies/v1.1”进行比对，采用 DESeq2[27]计算基因的 reads 在不同生物学个体之间的差异。通过差异倍数[|log2（Fold change）|>1]和显著水平（P<0.05）两个参数挑选出样品间的差异表达基因。
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2 结果与分析
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2.1 不同小麦品种侵染率差异
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在菌根接种处理中，所有小麦品种的根系均能被丛枝菌根侵染，但是侵染程度不同。两年小麦平均侵染率分别为 57.1% 和 45.9%。在 2017～2018 年的生长季，菌根侵染率最低的品种为豫麦 2 号，其菌根侵染率仅为 29.4%；郑麦 379、小红麦和鲫鱼麦侵染率也较低，分别为 31.7%、33.0% 和 33.4%。侵染率最高的品种为扬麦14，其菌根侵染率为 91.7%，EARLY-BLACKHULL、宛 7107、 Carazinho 和 INDIANO MOCHO 6296 的菌根侵染率也较高，分别为 82.2%、81.2%、73.7%和75.8%。 2018～2019 年的生长季，Atri5481/82 的侵染率最低，仅为 7.6%；小红麦、RED KAMSERETI、REDSPRING 和 Trigo Klein Cometa 的菌根侵染率也较低，分别为 12.6%、9.3%、13.6% 和 12.7%。侵染率最高的品种为扬麦 14，侵染率为 90.3%。扬麦 3 号和 INDIANO MOCHO 6296 的侵染率也较高，分别为 83.0% 和 70.2%。小红麦的两年平均侵染率最低，仅为 22.8%；扬麦 14 在两个生长季均表现出较高的菌根侵染（表1）。
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2.2 转录组实验中极端小麦品种菌根侵染差异
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在转录组实验中，小红麦表现出较低的菌根侵染，根中仅观察到少量的菌丝（图1a），侵染率为 21.7%；扬麦 14 则表现出了高侵染，在根中观察到了丰富的菌丝以及大量泡囊（图1b），侵染率达到 78.7%，两品种间菌根侵染率差异显著（图1c）。
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2.3 转录组测序数据质量评估
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经过测序数据的质量控制与筛选，各样本的 Q30≥93.00%，较过滤前，Q30 提高了0.63%～0.88%；过滤后的总 reads 数和总碱基数范围分别被缩减至 32782160～57073524 和 4816741847～8268758680；对比参考基因组，reads 的整体比对率在 81.45%～96.04% 之间（ 表2）。结果表明，所有试验样本的测序质量良好，转录组数据可用于后续分析。
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注：“—”表示未知；不同小写字母表示显著性差异（LSD 检验，P<0.05）。
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图1 不同程度小麦根系菌根浸染分布
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注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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2.4 . 转录因子基因表达对菌根侵染的响应
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在小红麦和扬麦 14 中检测到 GRAS 转录因子、 AP2 转录因子和 MYB 转录因子 3 类参与菌根共生的转录因子家族。在低侵染品种小红麦中，共检测到 9 个 GRAS 基因的表达，均被菌根侵染上调；39 个有表达的 AP2 转录因子基因中，6 个被菌根侵染上调，其它基因均不响应菌根侵染；30 个 MYB 转录因子基因中，5 个被上调，1 个被下调。在高侵染品种扬麦 14 中，检测到 10 个 GRAS 基因的表达，其中 9 个被菌根侵染上调，1 个未响应菌根侵染；36 个 AP2 转录因子基因中，6 个被菌根侵染上调，其他基因均不响应菌根侵染；66 个 MYB 转录因子基因中，4 个被上调，2 个被下调（表3）。
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在小红麦中被注释为 GRAS family protein RAM1的两个基因 TraesCS2A02G096800 和 TraesCS2D02G 095300，其表达在两个小麦品种中均被菌根侵染强烈上调（Log2FC 分别高达 11.88 和 11.49）。MYB 转录因子家族基因 TraesCS7D02G470000 在小红麦中表达被上调，而在扬麦 14 中不响应菌根侵染； 另外一个 MYB 基因 TraesCS5D02G411800 在小红麦中不响应菌根侵染，而其表达在扬麦 14 中被下调 （表3）。
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注：Q30：质量值大于等于 30 的碱基数占总碱基数的百分比；reads 整体比对率：能比对到参考基因组上的读段的数量统计。
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注：NS 表示接种与对照处理基因表达差异不显著（P>0.05）。下同。
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2.5 转运蛋白基因表达对菌根侵染的响应
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在小红麦和扬麦 14 中检测到 ABC 转运蛋白家族、磷酸盐转运蛋白家族、蔗糖转运蛋白家族和铵转运蛋白家族 4 类参与菌根共生的转运蛋白家族。在低侵染品种小红麦中，共检测到 371 个 ABC 转运蛋白家族基因，其中 49 个 ABC 转运蛋白基因受菌根侵染上调，15 个被下调；在 14 个有表达的磷酸盐转运蛋白家族基因中，2 个基因被下调，其它基因未响应菌根的侵染；11 个蔗糖转运蛋白家族基因均未响应菌根侵染；在 21 个铵转运蛋白家族基因中，9 个被下调，7 个被上调。在高侵染品种扬麦 14 中，检测到 372 个 ABC 转运蛋白家族基因，其中 48 个 ABC 转运蛋白基因受菌根侵染上调，30 个被下调；15 个磷酸盐转运蛋白家族基因中，2 个被下调，其它未响应；11 个蔗糖转运蛋白家族基因中，仅有 1 个被菌根侵染下调；21 个铵转运蛋白家族基因中，6 个被下调，7 个被上调。
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表4 列出了差异倍数≥4[小红麦或扬麦 14 中 |log2（Fold change）|≥2 的基因]的转运蛋白基因，发现这些基因均为 ABC 转运蛋白家族基因。在小红麦中发现 9 个此类基因表达被上调，其中的 2 个在扬麦 14 中被下调，另外 7 个不响应菌根侵染； 在扬麦 14 中，8 个 ABC 转运蛋白家族基因被上调， 2 个被下调，而这些基因在小红麦中都未表达。基因 TraesCS4A02G384800 和 TraesCSU02G223100 在扬麦 14 中表达上调，且差异倍数都在 32 倍以上，而这两个基因在小红麦中对菌根侵染不响应或响应度较低（表4）。
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2.6 酶类基因表达对菌根侵染的响应
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在小红麦和扬麦 14 中检测到 E3 泛素连接酶基因家族、丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶基因家族和细胞色素 P450 基因家族等 12 类共 2300 个参与共生的酶类家族基因，73% 的酶类基因都属于 E3 泛素连接酶基因家族、丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶基因家族和细胞色素 P450 基因家族。在低侵染率品种小红麦中，共检测到 523 个细胞色素 P450 基因的表达，其中 89 个受菌根侵染上调，59 个被下调；在 617 个 E3 泛素连接酶中，24 个被上调，9 个被下调；在 516 个丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶基因中，52 个被上调，6 个被下调。在高侵染率品种扬麦 14 中，共检测到 520 个细胞色素 P450 的表达，其中 72 个受菌根侵染上调，60 个被下调；在 620 个 E3 泛素连接酶中，47 个被上调， 6 个被下调；在 546 个丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶基因中，36 个被上调，13 个被下调（表5）。
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表6 列出了差异倍数≥16[小红麦或扬麦 14 中 |log2（Fold change）|≥4 的基因]的酶编码基因，这些基因中包含 6个 E3 泛素连接酶基因，其中 3 个在小红麦中未响应菌根侵染，在扬麦 14 中则被上调；2 个 E3 泛素连接酶在小红麦中表达上调，而在扬麦 14 中不响应；1 个在小红麦中不表达，而在扬麦 14 中被下调；基因 TraesCS4B02G142800、TraesCS 7D02G349700 和 TraesCS7D02G350200 在扬麦14 中强烈（差异表达倍数高于 32 倍）表达上调，在小红麦中则不响应菌根侵染。4 个枯草杆菌蛋白酶基因在小红麦中均表达上调，而在扬麦 14 中，这 4 个基因均没有被上调。2 个丝氨酸羧肽酶家族的基因 （TraesCS5A02G244800 和 TraesCS5B02G242400）在小红麦中均不响应菌根侵染，而在扬麦 14 中均被强烈上调。12 个属于细胞色素 P450 家族基因中的 8 个（ 如 TraesCS4A02G412100、TraesCS4D02G276700 和 TraesCS2D02G029500、TraesCS5A02G459800 等）在小红麦中表达上调，在扬麦 14 中则不响应或被下调；另外 4 个 P450 家庭基因在小红麦中不响应，但在扬麦 14 中表达上调（ 如 TraesCS2A02G008100 和 TraesCS2D02G183000 等）（表6）。
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2.7 其他基因表达对菌根侵染的响应
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在小红麦和扬麦 14 中检测到卷曲螺旋结构域蛋白（Coiled-coil domain-containing protein，CCDC）、F-box 蛋白、外囊复合体蛋白（Exocyst complex component，ECC）、膜类固醇结合蛋白（Membrane steroid-binding protein，MSB）和复制因子蛋白（Replication factor C subunit 3，RFC3）5 类参与菌根共生的其他家族基因。CCDC 和 MSB 基因的表达在两个小麦品种中均不响应菌根侵染。在小红麦中，共检测到 606 个 F-box 蛋白家族基因，其中 19 个受菌根侵染上调，20 个被下调；15 个 ECC 基因均不响应菌根侵染；在 31 个 RFC3 基因中，仅有 5 个基因表达上调。在小红麦中，发现了 521 个 F-box 蛋白家族基因，其中 21 个被上调，20 个被下调；在 120 个 ECC 基因中，16 个被上调，其他均不响应；在 31 个 RFC3 基因中，仅有 5 个表达上调。
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表7 列出了 12 个差异倍数≥4[小红麦或扬麦 14 中 |log2（Fold change）|≥2 的基因]的其他类基因，全都属于 F-box 家族，其中 4 个基因在小红麦中受菌根侵染下调，在扬麦 14 中未响应；4 个基因在扬麦 14 中被上调，在小红麦中未响应；4 个基因在扬麦 14 中被下调，在小红麦中未响应。基因 TraesCS7D02G518400 在小红麦中受菌根侵染强烈（下调倍数高于 16）下调。在扬麦 14 中基因 TraesCS5D02G367000 和 TraesCS7A02G063600 均被上调，且差异倍数也达到了 16 以上（表7）。
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注：—表示未检测到表达。
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注：—表示未检测到表达。
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3 讨论
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3.1 不同小麦品种菌根侵染差异
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本研究发现不同小麦品种菌根侵染率在 4%～92% 之间。有研究发现，在 94 个冬小麦品种中，AM 侵染率在 24%～56% 之间[7]；在 108 种四倍体硬粒小麦中，AM 侵染率在 9%～44% 之间[8]。可见，本研究中菌根侵染率范围更大，主要原因可能为：（1）本研究设置了不同种植环境，特别是养分添加量在两个生长季明显不同；（2）使用的菌剂不同。不同 AM 真菌种类可显著影响小麦的菌根侵染率[28]。本研究中，20 个小麦品种在两年的环境中产生了明显的侵染差异，这可能是由于两年间施肥量不同。众所周知，施用磷肥一般会导致菌根侵染率的降低[29]，增加对辣椒的磷肥供应后会导致菌根侵染百分比降低[30]；长期试验也发现，磷肥的存在 / 不存在对 AM 真菌群落有重大影响[31]。相同环境下不同品种的侵染率有较大差异[7-8]，这表明菌根侵染率是受遗传因素的影响。小红麦（低侵染）和扬麦 14（高侵染）的菌根侵染率在两个生长季表型中相对稳定，尤其是扬麦 14，两年间菌根侵染差异仅为 1.33%（表1），同样表明遗传因素影响着它们的菌根侵染特性[32]。
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3.2 转录因子基因表达对菌根侵染的响应
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在本研究中检测到的 GRAS 差异基因均被注释为 GRAS family protein RAM1，且基因 TraesCS2A02 G096800 和 TraesCS2D02G095300 在小红麦和扬麦 14 中均被强烈表达上调（表3）。GRAS 家族是植物中重要的转录调节因子，百脉根和矮牵牛（Petuniahybrida L.）ram1 突变体的丛枝发育不良，这表明 RAM1 是丛枝发育所必需的基因，在促进丛枝发育中发挥了核心作用[33-35]。在菌根侵染后的百脉根中，几乎一半的 GRAS 家族成员都被诱导[36]。 RAM1 参与早期丛枝分枝并调节其他菌根侵染相关基因的表达，并且 RAM1 的转录水平受 DELLA 活性调节，促进丛枝的发育，在菌根与植物共生发育过程中发挥着重要作用[33，37]。GRAS RAM1 基因在被菌根侵染后的小红麦和扬麦 14 中均被强烈表达，表明它在小麦的菌根侵染过程中可能也是不可或缺的，但由于两品种中两个 RAM1 基因响应菌根侵染的程度类似，故推测这些基因并非造成两个品种菌根侵染率差异的关键因子。小红麦虽然表现出较低的菌根侵染，但其菌根发育的一系列过程依然受到相关基因的调控，所以导致 RAM1 在菌根侵染率低的品种中也强烈响应菌根侵染。除了 RAM1，有研究发现，GRAS 家族的 NSP1 和 NSP2 基因在苜蓿的侵染过程中也发挥了重要的作用，对 GRAS 转录因子家族 NSP1 和 NSP2 分别敲除后，菌根侵染显著减少[38-39]。但本实验并未发现 NSP 基因的响应， NSP 基因可能在特定植物中受菌根侵染表达但并不参与小麦中丛枝菌根共生的过程。与 RAM1 相同， AP2 转录因子基因 TraesCS1D02G362500 在两品种中也均被强烈表达上调。在苜蓿中沉默 AP2 家族成员 MtErf1，发现菌根侵染相关的基因表达降低，从而导致菌根侵染水平降低，基因沉默植株根中的丛枝形态严重受损，这些根中仅存在小的截断丛枝，表明 MtErf1 可能是丛枝完全成熟所必需的[40]。本实验认为 AP2 家族成员在小麦的菌根侵染过程中发挥着重要的作用。本研究发现两个 MYB 基因 （TraesCS7D02G470000 和 TraesCS5D02G411800） 在小红麦中表达上调或不响应，但在扬麦 14 中表达不响应或者被下调（表3）。有研究使用丛枝退化的突变体 pt4，将 MYB 转录因子（MYB1）进行沉默后，抑制了丛枝的退化[41]。但另一个研究发现，在百脉根中将 MYB 转录因子基因 LjMAMI 进行沉默后，RNAi 株系出现丛枝分枝减少的现象[42]，不同的 MYB 转录因子基因在不同的菌根共生过程中发挥了相反的作用，表明不同的 MYB 基因在不同的植物菌根侵染过程中可能参与或发挥不同的功能。在苜蓿中也发现有 5 个 MYB 转录因子在受到菌根侵染后强烈上调[36]，这都为 MYB 转录因子家族基因影响菌根形成过程提供了证据。在本研究中，由于扬麦 14 为高侵染品种，能够被丛枝菌根真菌强烈侵染，而两个 MYB 基因在该品种中不响应或者下调表达，由此可见，在扬麦 14 中 MYB 转录因子表达下调可能是造成其菌根侵染率较高的原因之一，但具体机制有待进一步研究。
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3.3 转运蛋白基因表达对菌根侵染的响应
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在差异倍数较大的转运蛋白基因中，89% 的基因都属于 ABC 转运蛋白家族。ABC 转运蛋白基因 TraesCS4A02G384800 和 TraesCSU02G223100 在扬麦 14 中被菌根侵染强烈表达，而它们在小红麦中对菌根侵染不响应或响应度较低（表4）。ABC 转运蛋白基因在其他植物中已经被证实与菌根共生相关，如在矮牵牛中敲除 ABC 转运蛋白基因 PDR1 后，植物的菌根侵染程度显著降低，PDR1 作为独脚金内酯的一个运输蛋白在调节丛枝菌根形成过程中发挥关键作用，pdr1 突变体根系分泌独脚金内酯能力降低，导致共生过程受阻[43]。水稻中丛枝菌根的形成也需要 ABC 转运蛋白，水稻中分别将 ABC 转运蛋白 STR1 和 STR2 进行突变后，抑制了 AM 真菌丛枝的发育[44]。本研究结果同样说明小麦中的 ABC 转运蛋白基因也可能影响了菌根的形成过程，并且是造成了不同品种小麦菌根侵染率差异的原因之一。有文献报道，将玉米和水稻中的 GLcNAC 转运蛋白 NOP1 进行沉默后，在两种作物根系中均未观察到菌根的侵染[45]，但在本实验检测到的基因中，并未发现 GLcNAC 转运蛋白，这一方面可能是由于 GLcNAC 转运蛋白并非小麦与菌根共生过程中的必要因素；另一方面也可能是因为本研究的测序深度不足，没有检测到这种转运蛋白基因的表达。本实验检测到 3 个 AMT 基因的表达均被菌根侵染上调，其他研究也发现小麦中 AMT 在受到菌根侵染后都表现为上调[21]。有研究已证明基因 AMT2；3 在苜蓿中发挥了抑制丛枝衰老的作用[46]。这都为植物中的 AMT 参与菌根共生以及丛枝的发育提供了证据。本研究发现的这 3 个 AMT 基因在扬麦 14 中对菌根侵染的响应程度较小红麦更为明显，这说明 AMT 基因也可能影响了小麦菌根侵染率的基因型差异。
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3.4 酶类及其他编码基因表达对菌根侵染的响应
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在本实验检测到的 12 类共生相关的酶类基因中，差异倍数较高的酶类基因属于 E3 泛素连接酶、枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸羧肽酶以及细胞色素 P450 家族（表6）。有研究在苜蓿中分别发现了 1 个枯草杆菌蛋白酶和 1 个丝氨酸羧肽酶基因在菌根侵染后表达强烈上调，2 个细胞色素 P450 基因在受丛枝菌根侵染根中被强烈上调[36]。在菌根侵染后的小麦中发现 33 个丝氨酸羧肽酶被上调，7 个被下调[21]。E3 泛素连接酶基因数量庞大，种类繁多且功能复杂[47]。本研究发现，3 个 E3 泛素连接酶（TraesCS7D02G350200、TraesCS4B02G142800、 TraesCS7D02G349700）基因在扬麦 14 中受菌根侵染强烈（差异表达倍数高于 32 倍）表达上调，在小红麦中则不响应菌根侵染。CERBERUS 编码 E3 泛素连接酶基因，在百脉根中将其敲除后减少了细胞间的菌丝伸长，所以它被认为在识别共生体和触发早期共生反应的信号通路中起作用[48]。PUB 属于 E3 泛素连接酶，通过对突变体 pub1-1 的研究，证明了 PUB1 的泛素化活性在控制 AM 真菌对苜蓿的早期侵染中起关键作用[49]。本实验发现在扬麦 14 中强烈表达的 E3 泛素连接酶基因可能导致了扬麦 14 的高侵染现象，而它们在小红麦中不响应菌根侵染，表明这 3 个 E3 泛素连接酶基因可能是导致两个小麦品种菌根侵染差异的原因之一。研究还发现，PUB23 基因在小红麦中被强烈表达上调或不响应，但在扬麦 14 中表现为不响应或下调，所以在小麦中 PUB23 的表达可能抑制了菌根对小麦的侵染。枯草杆菌蛋白酶基因 TraesCS7B02G015200 在小红麦中受菌根侵染强烈上调，在扬麦 14 中则被下调（表6）。在百脉根中分别将枯草杆菌蛋白酶基因 SbtM1 与 SbtM3 用 RNAi 进行沉默，发现丛枝菌根真菌侵染降低并且影响了丛枝的形成，这表明这两个基因在百脉根中在菌根侵染过程中发挥作用[50]。但本研究结果表明，枯草杆菌蛋白酶基因的表达可能抑制了菌根侵染，从而导致了小红麦侵染率较低。本研究发现，被注释为 Serine carboxypeptidase-like40 的基因 TraesCS5A02G244800 和 TraesCS5B02G242400 在扬麦 14 中均被强烈表达上调（差异倍数大于 32），在小红麦中却不响应菌根侵染（表6）。研究发现，将苜蓿中的丝氨酸羧肽酶基因 SCP1 使用 RNAi 进行沉默后，出现丛枝发育不良或者畸形的现象[51]，所以 SCP1 可能也影响了菌根的侵染。本研究中发现的两个强烈表达的丝氨酸羧肽酶基因可能导致了两极端侵染率的差异。细胞色素 P450 基因中，TraesCS2A02G008100 和 TraesCS2D02G183000 差异倍数较高，在扬麦 14 中被强烈表达上调，但在小红麦中未响应菌根侵染。通过转录组分析发现，在接种 AM 真菌的百脉根中观察到细胞色素 P450 基因表达的上调[39]。在苜蓿中对 P450 CYT733A1 基因进行敲除，发现在根系中菌根侵染程度减弱[52]。与在扬麦 14 中强烈表达上调的 E3 泛素连接酶基因一样，这两个 P450 基因在高侵染品种中也被强烈表达，它们在小麦菌根共生发育中可能都发挥了重要作用。
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本研究在两极端品种的差异基因中发现了很多 F-box 蛋白基因，其中包括 3 个被强烈表达的基因，基因 TraesCS7D02G518400 在小红麦中受菌根侵染强烈下调，在扬麦 14 中不受菌根响应，而 TraesCS5D02G367000 和 TraesCS7A02G063600 在扬麦 14 中均被强烈上调，在小红麦中不响应（表7）。F-box 蛋白 DW ARF3（D3）的水稻突变体在 AM 真菌侵染过程中表现出明显缺陷，表明其在水稻中建立 AM 共生关系的重要性[53]。本研究表明，在小麦与菌根真菌共生的过程中，F-box 蛋白基因的强烈表达上调可能增强了菌根对小麦的侵染强度，为 F-box 蛋白基因参与小麦菌根共生过程提供了证据。
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4 结论
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在 20 个小麦品种中，扬麦 14 具有较高的菌根侵染率，而小红麦具有较低的菌根侵染率。通过转录组分析，在小红麦和扬麦 14 中分别检测到 3501 和 3421 个与菌根共生参与的基因。在扬麦 14 和小红麦中检测到的差异响应基因（包括上调和下调） 主要包括 MYB 转录因子基因、ABC 转录因子基因、 E3 泛素连接酶基因、枯草杆菌蛋白酶基因、丝氨酸羧肽酶基因、细胞色素 P450 基因和 F-box 蛋白基因。这些基因中的 57 个基因，包括 2 个 MYB 转录因子基因、19 个 ABC 转运蛋白家族基因、6 个 E3 泛素连接酶基因、4 个枯草杆菌蛋白酶家族基因、2 个丝氨酸羧肽酶、12 个细胞色素 P450 家族基因和 12 个 F-box 家族基因，在两极端小麦品种中对菌根侵染的响应明显不同，因此可能是决定小麦菌根侵染基因型差异的关键候选基因。
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参考文献
-
[1] SCHÜßLER A，Schwarzott D，Walker C．A new fungal phylum，the Glomeromycota：phylogeny and evolution［J］．Mycological Research，2001，105（12）：1413-1421．
-
[2] Brundrett M C．Coevolution of roots and mycorrhizas of land plants［J］．New Phytologist，2002，154（2）：275-304．
-
[3] Smith F A，Grace E J，Smith S E．More than a carbon economy：nutrient trade and ecological sustainability in facultative arbuscular mycorrhizal symbioses［J］．New Phytologist，2009，182（2）：347-358．
-
[4] Leake J，Johnson D，Donnelly D，et al．Networks of power and influence：the role of mycorrhizal mycelium in controlling plant communities and agroecosystem functioning［J］．Canadian Journal of Botany，2004，82（8）：1016-1045．
-
[5] Smith S E，Read D J．Mycorrhizal symbiosis［J］．Quarterly Review of Biology，2008，3（3）：273-281．
-
[6] Mathur S，Tomar R S，Jajoo A．Arbuscular mycorrhizal fungi（AMF）protects photosynthetic apparatus of wheat under drought stress［J］．Photosynthesis Research，2019，139（1-3）：227-238．
-
[7] Lehnert H，Serfling A，Enders M，et al．Genetics of mycorrhizal symbiosis in winter wheat（Triticum aestivum）［J］．New Phytologist，2017，215（2）：779-791．
-
[8] De Vita P，Avio L，Sbrana C，et al．Genetic markers associated to arbuscular mycorrhizal colonization in durum wheat［J］． Scientific Reports，2018，8（1）：1-12．
-
[9] 毛琳．21 个冬小麦品种根系的丛枝菌根真菌研究［D］．兰州：兰州大学，2012．
-
[10] Aghili F，Jansa J，Khoshgoftarmanesh A H，et al．Wheat plants invest more in mycorrhizae and receive more benefits from them under adverse than favorable soil conditions［J］．Applied Soil Ecology，2014，84：93-111．
-
[11] Hildermann I，Messmer M，Dubois D，et al．Nutrient use efficiency and arbuscular mycorrhizal root colonisation of winter wheat cultivars in different farming systems of the DOK long-term trial［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，2010，90（12）：2027-2038．
-
[12] MacLean A M，Bravo A，Harrison M J．Plant signaling and metabolic pathways enabling arbuscular mycorrhizal symbiosis ［J］．Plant Cell，2017，29（10）：2319-2335．
-
[13] den Camp R O，Steng A，De Mita S，et al．LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia［J］．Science，2011，331（6019）：909-912．
-
[14] Miyata K，Kozaki T，Kouzai Y，et al．The bifunctional plant receptor，OsCERK1，regulates both chitin-triggered immunity and arbuscular mycorrhizal symbiosis in rice［J］．Plant and Cell Physiology，2014，55（11）：1864-1872．
-
[15] Capoen W，Sun J，Wysham D，et al．Nuclear membranes control symbiotic calcium signaling of legumes［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（34）：14348-14353．
-
[16] Zipfel C，Oldroyd G E．Plant signalling in symbiosis and immunity［J］．Nature，2017，543（7645）：328-336．
-
[17] Davière J M，Achard P．Gibberellin signaling in plants［J］． Development，2013，140（6）：1147-1151．
-
[18] KalóP，Gleason C，Edwards A，et al．Nodulation signaling in legumes requires NSP2，a member of the GRAS family of transcriptional regulators［J］．Science，2005，308（5729）：1786-1789．
-
[19] 贾昌路，张瑶，朱玲．等．转录组测序技术在生物测序中的应用研究进展［J］．分子植物育种，2015，13（10）：2388-2394．
-
[20] 蒋费涛，王书平，祁俊生，等．转录组学技术及其在植物系统学上的研究进展［J］．现代盐化工，2020（4）：14-17．
-
[21] Li M J，Wang R Z，Tian H，et al．Transcriptome responses in wheat roots to colonization by the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis［J］．Mycorrhiza，2018，28（8）：747-759．
-
[22] Grace C，Stribley D P．A safer procedure for routine staining of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi［J］．Mycological Research，1991，95（10）：1160-1162．
-
[23] Trouvelot A，Kough J L，Gianinazzi-Pearson V．Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire．Recherche de méthode d’estimation ayant une signification fonctionnelle ［C］//Physiological and genetical aspects of mycorrhizae：proceedings of the 1st european symposium on mycorrhizae，Dijon，1-5 July 1985．1986．217-221．
-
[24] 杨杰，王金全，丁维俊，等．基于 Illumina HiSeq 2000 测序技术对当归根的转录组特性研究［J］．中草药，2015，46（8）：1216-1222．
-
[25] Pearson W R．Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA［J］．Methods Enzymol，1990，183：63-98．
-
[26] Wen G．A simple process of RNA-Sequence analyses by Hisat2，Htseq and DESeq2［C］．Proceedings of the 2017 International Conference on Biomedical Engineering and Bioinformatics，2017． 11-15．
-
[27] Love M，Anders S，Huber W．Differential analysis of count data：the DESeq2 package［J］．Genome Biol，2014，15（550）：10-1186．
-
[28] Pellegrino E，Öpik M，Bonari E，et al．Responses of wheat toarbuscular mycorrhizal fungi：A meta-analysis of field studies from 1975 to 2013［J］．Soil Biology and Biochemistry，2015，84：210-217．
-
[29] Jiang S，Liu Y，Luo J，et al．Dynamics of arbuscular mycorrhizal fungal community structure and functioning along a nitrogen enrichment gradient in an alpine meadow ecosystem ［J］．New Phytologist，2018，220（4）：1222-1235．
-
[30] Tanwar A，Aggarwal A，Kadian N，et al．Arbuscular mycorrhizal inoculation and super phosphate application influence plant growth and yield of Capsicum annuum［J］．Journal of Soil Science and Plant Nutrition，2013，13（1）：55-66．
-
[31] Cheng Y，Ishimoto K，Kuriyama Y，et al．Ninety-year-，but not single，application of phosphorus fertilizer has a major impact on arbuscular mycorrhizal fungal communities［J］．Plant and Soil，2013，365（1）：397-407．
-
[32] Lehmann N，Finger R，Klein T，et al．Adapting towards climate change：a Bioeconomic analysis of winter wheat and grain maize［R］．2012．
-
[33] Park H J，Floss D S，Levesque-Tremblay V，et al．Hyphal branching during arbuscule development requires reduced arbuscular mycorrhiza1［J］．Plant Physiology，2015，169（4）：2774．
-
[34] Rich M K，Schorderet M，Bapaume L，et al．The petunia GRAS transcription factor ATA/RAM1 regulates symbiotic gene expression and fungal morphogenesis in arbuscular mycorrhiza ［J］．Plant Physiology，2015，168（3）：788-797．
-
[35] Xue L，Cun H，Buer B，et al．Network of GRAS transcription factors involved in the control of arbuscule development in lotus japonicus［J］．Plant Physiology，2015，167（3）：854-71．
-
[36] Yoshihiro H，Hiroyo N，Naoya T，et al．RNA-seq transcriptional profiling of an arbuscular mycorrhiza provides insights into regulated and coordinated gene expression in lotus japonicus and rhizophagus irregularis［J］．Plant & Cell Physiology，2015（8）：1490-1511．
-
[37] Gobbato E，Marsh J F，VerniéT，et al．A GRAS-type transcription factor with a specific function in mycorrhizal signaling ［J］．Current Biology，2012，22（23）：2236-2241．
-
[38] Delaux P M，Bécard G，Combier J P．NSP1 is a component of the Myc signaling pathway［J］．New Phytologist，2013，199（1）：59-65．
-
[39] Maillet F，Poinsot V，AndréO，et al．Fungal lipochitooligosaccharide symbiotic signals in arbuscular mycorrhiza［J］． Nature，2011，469（7328）：58-63．
-
[40] Devers E A，Teply J，Reinert A，et al．An endogenous artificial microRNA system for unraveling the function of root endosymbioses related genes in Medicago truncatula［J］．BMC Plant Biology，2013，13（1）：1-10．
-
[41] Floss D S，Gomez S K，Park H J，et al．A transcriptional program for arbuscule degeneration during AM symbiosis is regulated by MYB1［J］．Current Biology：CB，2017，27（8）：1206-1212．
-
[42] Volpe V，Dell’ Aglio E，Giovannetti M，et al．An AM-induced，MYB-family gene of Lotus japonicus（Lj MAMI）affects root growth in an AM-independent manner［J］．The Plant Journal，2013，73（3）：442-455．
-
[43] Kretzschmar T，Kohlen W，Sasse J，et al．A petunia ABC protein controls strigolactone-dependent symbiotic signalling and branching［J］．Nature，2012，483（7389）：341-344．
-
[44] Gutjahr C，Radovanovic D，Geoffroy J，et al．The halfsize ABC transporters STR1 and STR2 are indispensable for mycorrhizal arbuscule formation in rice［J］．Plant Journal for Cell & Molecular Biology，2012，69（5）：906-920．
-
[45] Nadal M，Sawers R，Naseem S，et al．An N-acetylglucosamine transporter required for arbuscular mycorrhizal symbioses in rice and maize［J］．Nature Plants，2017，3（6）：1-7．
-
[46] Breuillin-Sessoms F，Floss D S，Gomez S K，et al．Suppression of arbuscule degeneration in medicago truncatula phosphate transporter 4 mutants is dependent on the ammonium transporter 2 Family Protein AMT2；3［J］．Plant Cell，2015，27（4）：1352-1366．
-
[47] 田爱梅，于晖，曹家树．植物E3泛素连接酶的分类与功能 ［J］．中国细胞生物学学报，2020，42（5）：907-915．
-
[48] Naoya T，Syusaku T，Takuya S，et al．CERBERUS and NSP1 of Lotus japonicus are common symbiosis genes that modulatearbuscular mycorrhiza development［J］．Plant and Cell Physiology，2013，33（10）：1711-1723．
-
[49] VerniéT，Camut S，Camps C，et al．PUB1 interacts with the receptor kinase DMI2 and negatively regulates rhizobial and arbuscular mycorrhizal symbioses through its ubiquitination activity in Medicago truncatula［J］．Plant Physiology，2016，170（4）：2312-2324．
-
[50] Takeda N，Sato S，Asamizu E，et al．Apoplastic plant subtilases support arbuscular mycorrhiza development in Lotus japonicus［J］．The Plant Journal，2009，58（5）：766-777．
-
[51] Rech S S，Heidt S，Requena N．A tandem Kunitz protease inhibitor（KPI106）-serine carboxypeptidase（SCP1）controls mycorrhiza establishment and arbuscule development in Medicago truncatula［J］．The Plant Journal，2013，75（5）：711-725．
-
[52] Bravo A，York T，Pumplin N，et al．Genes conserved for arbuscular mycorrhizal symbiosis identified through phylogenomdedics ［J］．Nature Plants，2016，2（2）：1-6．
-
[53] Yoshida S，Kameoka H，Tempo M，et al．The D3 F-box protein is a key component in host strigolactone responses essential for arbuscular mycorrhizal symbiosis［J］．New Phytologist，2012，196（4）：1208-1216．
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摘要
为研究不同小麦品种之间丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）侵染率差异的分子机制，于 2017 ～ 2019 年进行了两个生长季的盆栽试验，使用 Claroideoglomus etunicatum、Rhizophagus intraradices、Funneliformis mosseae，Acaulospora delicate 4 种菌剂混合接种，测定菌根侵染率并筛选出极端菌根侵染差异品种小红麦（低侵染）和扬麦 14（高侵染），后通过转录组分析比较了两个品种中菌根共生参与基因（转录因子、转运蛋白、酶类和其他基因）对菌根侵染的响应，旨在探究小麦菌根侵染率基因型差异的分子机制。研究结果表明，扬麦 14 的菌根侵染率显著高于小红麦，二者差异可达 7 倍以上。共检测到 GRAS、AP2 和 MYB 共 3 类转录因子家族基因，其中的绝大多数被菌根侵染上调表达，仅有 2 个 MYB 转录因子基因在两个品种小麦中对菌根侵染的响应明显不同； 检测到编码 ABC 转运蛋白、磷酸盐转运蛋白、蔗糖转运蛋白和铵转运蛋白的基因响应菌根侵染，其中 19 个 ABC 转运蛋白基因对菌根侵染的响应最为强烈，且其中的多数基因在两个小麦品种中对菌根侵染的响应均有较大差异；检测到 12 类酶编码基因响应菌根侵染，其中 24 个基因的表达差异倍数在 16 倍以上，3 个 E3 泛素连接酶基因、1 个枯草杆菌蛋白酶家族基因、6 个细胞色素 P450 家族基因以及 2 个丝氨酸羧肽酶编码基因在两个小麦品种中对菌根侵染的响应有较大差异；此外，检测到 5 类 106 个其它菌根共生参与基因也显著响应菌根侵染，其中 3 个 F-box 家族基因在两个小麦品种中对菌根侵染的响应有较大差异。本研究共鉴定到 57 个在两个小麦品种中对菌根侵染响应明显差异的基因，这些基因可能在影响小麦菌根侵染率基因型差异的过程中发挥关键作用。
Abstract
In order to study mechanism of the differences of arbuscular mycorrhizal（AM）colonization rates among wheat genotypes，a pot experiment was conducted in two growing seasons from 2017 to 2019．Claroideoglomus etunicatum， Rhizophagus intraradices，Funneliformis mosseae，Acaulospora delicata were used for mixed inoculation，and the AM colonization was measured．Two wheat cultivars（YM14 and XHM）with contrast AM colonization were screened out and used for transcriptome analysis．The response of four types of genes（transcription factors，transporters，enzymes and other genes）that previously reported to be involved in AM symbiosis formation to AM colonization were focused．The study aimed to explore the molecular mechanisms of the genotypic differences of wheat in AM colonization．The results showed that the AM colonization rate of the cultivar YM14 was significantly higher than that of XHM，and the difference was more than 7 times．Three types of transcription factor family genes such as GRAS，AP2 and MYB were detected，most of which were upregulated by AM colonization，but only 2 MYB transcription factor genes had distinct different responses to AM colonization between the two cultivars；Four types of transporter genes，including ABC transporter gene，phosphate transporter， sucrose transporter and ammonium transporter gene，were detected to respond to AM colonization．Among them，19 ABC transporter genes responded most strongly to AM colonization，and most of them had different responses to AM colonization between the two wheat cultivars；12 types of enzyme-encoding genes were detected to respond to AM colonization，of which 24 genes had differential expression more than 16 times，3 E3 ubiquitin ligase genes，1 subtilisin-like protease genes，6 cytochrome P450 family genes，and 2 serine carboxypeptidase genes had different responses to AM colonization between the two wheat cultivars；in addition，five other gene types involved in mycorrhizal symbiosis were detected，and 106 genes significantly responded to AM colonization，of which 3 F-box family genes had different responses to AM colonization between the two wheat varieties．In this study，57 genes with significant differences in response to AM colonization in the two wheat cultivars were identified，and may play key roles in affecting the genotypic differences of wheat in AM colonization.