大蒜（Allium sativum L.）为百合科葱属多年生草本植物，原产于西亚和中亚，张骞出使西域将其带回中国^[1]，成为人们餐桌上必不可少的调味品，富含多种矿物质和维生素，以鳞茎入药，具有止痢、止咳、健胃、驱虫之功效^[2]，同时具有抗肿瘤、抑菌等特性，是世界公认的药食两用植物，具有促进百姓健康、农民增收的双重作用。据中国出口月度统计报告显示，2020 年 1～7 月，中国出口大蒜数量 1404923.0 t，同比增长 39.2%，金额 148232.7 万美元，同比增长 25.1%，平均单价 1055.1 美元 /t。大蒜在我国南方和北方各省均有栽植，其中山东省金乡县及其周边地区为我国出口大蒜的主产区。随着大蒜连续多年种植，常发生严重的连作障碍，又称作土壤衰颓（Soil sickness），表现为土壤病害的暴发性，主要为土传真菌病害，马龙传等^[3]对金乡大蒜的病害进行调查，发现大蒜根腐病是当地发生面积最大、危害最重的主要病害之一，严重时可导致减产 30% 以上。

目前，已经探明大蒜根腐病的发生、加剧与病原真菌侵染、土壤微生态失衡有密切的关系^[4]。根腐型病害是由多种微生物侵染大蒜根部，继而引起虫蛆等次生病害的一种土传病害，以大蒜根部的腐烂为主要特征，逐步发展为蒜叶、蒜茎、蒜头的腐烂，该病影响大蒜的品质和产量，严重时甚至会造成大蒜绝收^[5]。可见，大蒜根腐病已成为大蒜可持续发展中亟待解决的瓶颈，根腐病病原菌的发现是防控大蒜根腐病的基础。本文采集我国出口大蒜主产区山东省济宁市金乡县连作田块大蒜腐烂根样品，开展病原菌的分离、鉴定和感病能力研究；再通过对病原菌生长条件特性的研究，找到抑制大蒜根腐病病原菌的氮源、碳源等条件，为科学防治病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

2018 年3～4月，在山东省济宁市金乡县（35.19°N， 116.38°E）连作大蒜田，采集大蒜根腐病严重的根部腐烂样品。

1.1.2 培养基

马铃薯琼脂培养基（PDA）：200 g 马铃薯、 20 g 葡萄糖、20 g 琼脂，使用蒸馏水定容至 1 L。

基础培养基：蛋白胨 4 g、葡萄糖 20 g、 Mg SO₄·7H₂O 0.5 g、K₂HPO₄ 0.5 g、KH₂PO₄ 1 g、维生素 B₁ 5×10^-5 g、蒸馏水 1000mL、琼脂20 g，pH值 7.0。

1.2 研究方法

1.2.1 潜在病原菌的分离

取腐烂大蒜根样品，经无菌水清洗，依次用 75% 酒精（2 min）、2% 次氯酸钠（3 min）进行表面消毒，再经无菌水清洗两遍，用无菌滤纸吸干植物根样品表面水分。使用无菌剪刀去掉两端，露出病变部位，用镊子平铺在 PDA 培养基上，每个板最多 3 个样品，28℃恒温培养 3～5 d，分离纯化不同颜色形态的菌株。

1.2.2 潜在病原菌的纯化

采用菌丝末端逐级移植法进行纯化^[6]。菌落在平板上形成后，使用竹签尖端部位或接种环在酒精灯火焰外焰烧灼消毒后，挑取真菌单菌落菌丝接入干净的培养基中，并在平板上编辑标记接菌日期及菌株编号。恒温培养箱中 28℃培养，待平板快长满时拍照，以此方法直至获得纯菌落，4℃保存以备鉴定。

1.2.3 潜在病原菌的形态鉴定

在已经纯化的菌板菌落边缘处取直径大小相同的菌饼，置于培养基中心，观察菌株的生长速率及在培养过程中的生长状况、菌落颜色、菌丝形态特征等性状。通过光学显微数码成像系统观察菌丝形态、分隔状态，孢子情况等。综合上述形态特征，依据《真菌鉴定手册》等文献资料，对菌株进行形态学分类，并结合培养性状进行鉴定^[7]。

1.2.4 潜在病原菌的分子生物学鉴定

DNA 提取：刮取适量菌丝放入无菌离心管中，在-80℃下冻置 30 min，在每管离心管中放入钢珠 1 颗，通过冻融细胞破碎仪以 26 f/s 的频率振荡 3 min。取出后按照真菌基因组提取试剂盒（北京擎科生物科技有限公司）操作步骤依次进行，DNA 收集在新的离心管并利用超微量分光光度计测定浓度，达到合格的 DNA 可进行 PCR 扩增。

PCR 扩增：ITS-rDNA 区段对于一部分真菌相对保守，不足以支持一些菌株的鉴定结果确定到种，因此一些种属需要多基因综合鉴定。在本文中除了对 ITS 进行鉴定外，还对 EF-1 及 gpd 两种持家基因进行鉴定。

基因通用引物：ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3）、ITS4（5’-TCC TCCGC T TA T TGATATGC-3’）、EF-1F（5-CATCGAGAAGTTC GAGAAGG-3’）、EF-1R（5’-TACTTGAAGGAACC CTTACC-3）和 gpd1（CAACGGCTTCGGTCGCATTG）、 gpd2（GCCAAGCAGTTGGTTGTGC）^[8]均由上海生工生物有限公司合成。采用 25μL PCR 反应体系进行 PCR 扩增：2x Es Taq MasterMix 12.5μL，菌株总 DNA 模板 1μL，正反向引物各 1μL（10 pmol·L^-1）， ddH₂O 9.5μL。ITS1/ITS4 反应条件为：94℃预变性 4 min，94℃变性 45 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，30 个循环，最后 72℃延伸 10 min；EF1F/EF-1R 反应条件为：94℃预变性 5 min，94℃变性 45 s，58℃退火 55 s，72℃延伸 40 s，31 个循环，最后 72℃延伸 10 min；gpd1/ gpd2 反应条件为： 94℃预变性 5 min，94℃变性 40 s，55℃退火 40 s， 72℃延伸 1 min，35 个循环，最后 72℃延伸 5 min。

PCR 产物检测与序列分析：PCR 扩增产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，测序结果与 GenBank 登录的链格孢属种及相近属的序列进行同源性比对分析，利用 Mega7.0 中邻接法（neighbor-joining methods， NJ）NJ 构建聚类分析树状图，分析链格孢菌 DS55-6F 与其他菌株的亲缘关系，以确定其分类地位。

1.2.5 潜在病原菌对大蒜幼苗的致病性研究

采用温室水培实验对大蒜潜在病原真菌进行致病性研究^[9]。将待测病原真菌孢子悬浮液浓度调制 1×10⁷ cfu/mL，在温室水培大蒜苗期植株高约 10 cm 时进行实验处理，采用伤根法接入待测病原真菌孢子悬浮液。以清水作为对照，实验处理分别加入 5、10、20、50、100、150 mL 孢子悬浮液。每隔一周观察实验现象并记录，直至发病。

1.2.6 柯赫氏法则验证

根据柯赫氏法则，对发病植株进行病原菌的再次分离。采根部发病部位 1～2 cm，经超声表面处理后，磨样进行稀释涂布，并在 28℃下培养 48 h 后，挑取优势菌株分离纯化。获得菌株进行 ITS、 EF1 和 gpd 基因序列扩增及测序，将测序获得的菌株序列在 NCBI 基因数据库对比，再与大蒜根腐病潜在病原菌的 ITS 序列比对^[9]。

1.2.7 大蒜根腐病病原菌 Alternaria embellisia DS55-6F 的生长条件评价^[10]

不同温度对病原真菌 DS55-6F 菌落直径生长的影响：在 PDA 培养基中心接入病原真菌链格孢菌 DS55-6F5 mm 菌饼，分别置于 4、20、28 和 37℃条件下培养 7 d，测量菌落直径。

不同 pH 对病原真菌 DS55-6F 菌落直径生长的影响：分别用 50 mmol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和 20 mmol/L NaOH 调节 PDA 培养基的 pH 值至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，共 7 个梯度。接菌方法和培养天数同上。

不同碳源对病原真菌 DS55-6F 菌落直径生长的影响：在基础培养基中分别加入 20 g 葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、蔗糖、甘露醇作为待测碳源培养基，以无碳源培养基为对照。接种方法及培养天数同上。

不同碳源对病原真菌 DS55-6F 菌落直径生长的影响：在基础培养基中分别加入 5 g 硝酸钾、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、牛肉浸粉、酵母浸粉、尿素作为待测氮源培养基，以无氮源培养基为对照。接种方法及培养天数同上。

2 结果与分析

2.1 大蒜田间根腐病调查和潜在病原菌的分离

2018 年 3～4 月，在山东省济宁市金乡县多个大蒜种连作田块发现根部高发病害表现为根腐病，大蒜在不同的生长期会出现不同程度的根腐病病症，其中在苗期和分化期发病最为严重，在山东省济宁市金乡县及周边地区由于大蒜连作障碍的根腐病表现导致大蒜发病率最高可达 80%。

通过对感病大蒜根样品进行潜在病原菌的分离，共分离纯化出优势潜在病原真菌 15 株。对上述菌株进行显微镜检测，通过观察其产孢结构和菌丝形态进行初步归类，获得三大类潜在病原菌，代表菌株分别为 H5、H9 和 DS55-6F。其中，菌株 H5 属于土栖棘壳孢菌（Setophoma），是首次在我国发现可以引起大蒜红根腐的病原菌，相关研究结果已在 Plant Disease 上发表^[11]；菌株 H9 属于腐皮镰刀菌 Fusarium solani，相关研究见参考文献^[9]； 本文重点研究 DS55-6F 这一类群。

2.2 大蒜根腐病潜在病原菌 DS55-6F 形态学鉴定

将潜在病原菌 DS55-6F 在 28℃培养 6 d 后，菌株 DS55-6F 菌落呈丛霉状，光滑至粗糙，菌丝褐绿色，平板背面黑绿色。镜检发现，菌株厚垣孢子无分枝，有隔膜，分生孢子粗且短，孢子梗粗短，长椭圆形或圆柱形，孢痕明显（图1）。

注：a 为菌株 DS55-6F 的菌落平板照片，b 为菌株 DS55-6F 的光学显微镜照片。

2.3 大蒜根腐病潜在病原菌 DS55-6F 分子生物学鉴定

以潜在病原菌 DS55-6F DNA 为模板，以 ITS1 和 ITS4、EF-1F 和 EF-1R 为引物进行 PCR 扩增测序。将 PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得 DS55-6F 的 ITS 和 EF-1 基因序列，在 NCBI 网站上进行比对，利用 MEGA7.0 采用 NJ（neighbor-joining methods，NJ）法构建系统发育树（图2），潜在病原菌 DS55-6F 的 ITS 基因序列在 NCBI 的序列号为 MT754654.1，EF1 基因序列在 NCBI 的序列号为 MW315933。结果显示：潜在病原菌 DS55-6F 属于链格孢属（Alternaria），与其 ITS 和 EF-1 基因相似性最高的菌种有 3 株，分别是 Alternaria telluster、Alternaria embellisia和 Alternaria chlamydosporigena，最高同源性达到 100%。

因为 ITS 和 EF-1 基因在链格孢属的鉴定中具有局限性，因此，对 DS55-6F 菌株进行 gpd 基因鉴定^[11]。基于持家基因 gpd 进行 PCR 扩增测序，利用 MEGA7.0 采用 NJ 法构建系统发育树（图3）， gpd 基因序列在 NCBI 的序列号为 KC584155。结果显示：潜在病原菌 DS55-6F 与 Alternaria embellisia 聚在一起，与 Alternaria chlamydosporigena 和 Alternaria telluster 分开。综上，潜在病原菌 DS55-6F 为艾氏链格孢菌 Alternaria embellisia。

2.4 大蒜根腐病潜在病原菌 Alternaria embellisia DS55-6F 的致病性研究

致病性实验进行两周后均开始发病，表现为根部腐烂。Alternaria embellisia DS55-6F 在接种大蒜感病初期根尖部表现为黑色后变无色腐烂状态，该现象在根尖部向根基部推移，地上部表现出生长缓慢，植株矮化且轻度枯黄病症，明显致病浓度均在 100 mL（1×10⁷ cfu/mL）开始，且最佳致病浓度为 150 mL（1×10⁷ cfu/mL）（图4）。对产生大蒜根腐病症状的大蒜根样品进行分离纯化以及 ITS、 EF1 和 gpd 基因序列扩增及测序，结果显示：新分离的优势菌株与接种菌株 DS55-6F 序列一致，该结果表明，接种的菌株 DS55-6F 为大蒜根腐病病原菌。

2.5 大蒜根腐病病原菌 Alternaria embellisia DS55-6F 的生长特性研究

通过研究不同温度、不同 pH、不同碳源、不同氮源对真菌 Alternaria embellisia DS55-6F 菌落直径的影响，初步了解大蒜病原真菌 Alternaria embellisia DS55-6F 的生长特性。菌株 DS55-6F 在 4 和 37℃条件下培养 7 d 不生长，28℃条件下菌落生长最适宜；pH 6.0 时生长最好，在 pH 4.0～10.0 区间内没有显著性差异。与不加碳源对照相比，大蒜病原菌 Alternaria embellisia DS55-6F 在以葡萄糖、麦芽糖、淀粉为唯一碳源的培养基上生长较好，在以乳糖为唯一碳源的培养基上生长较差。与不加氮源的对照相比，大蒜病原菌 Alternaria embellisiaDS55-6F 在以硝酸钾或牛肉浸粉为唯一氮源的培养基上生长较好，在以硫酸铵或氯化铵为唯一氮源的培养基上生长较差（图5）。

注：不同小写字母表示各处理间差异显著（P<0.05）。

3 结果与讨论

根腐病是严重的土传真菌病害，常表现为多种病原菌复合侵染。余金阳等^[12]对四川彭州大蒜根腐病发病土壤细菌与真菌群落结构进行分析发现，与正常土壤相比，发病土壤匐柄霉属和镰刀菌属等病原真菌丰度增加；张博等^[13]对山东省大蒜腐霉根腐病研究发现，腐霉（Pythium）是山东省大蒜根腐病的病原；而张丽娟等^[14]研究表明，新疆吉木萨尔地区大蒜根腐病是由镰刀菌属的真菌引起的，其中尖孢镰刀菌是致病的优势种，其次为层生镰刀菌；高园园等^[6]对山东省济宁市任城区、金乡县，菏泽市巨野县，临沂市兰陵县等多地采集发病大蒜植株进行病原菌分离鉴定研究，发现尖孢镰孢菌（F．oxysporum）、腐皮镰孢菌（F． solani）、芳香镰孢菌（F．redolens）、木贼镰孢菌 （F．equiseti）是山东省大蒜主产区根腐病的致病菌，并且同样提出尖孢镰孢菌是大蒜根腐病病害的主要致病菌；汪甜等^[9]发现镰刀菌属为山东金乡连作大蒜根腐病优势菌，同时在我国首次发现土栖棘壳孢菌（Setophomaterrestris）引起大蒜红根腐^[11]，角担胞菌（Ceratobasidium sp.）可引起大蒜根腐病^[15]。本研究分离并获得了除镰刀菌以外可引起大蒜根腐病的链格孢菌，并利用柯赫氏法则回接进行验证，发现艾氏链格孢菌也可以引起大蒜根腐病。链格孢菌引起根腐病在甜瓜^[16]、紫花苜蓿^[17]、西番莲^[18]以及黄瓜^[19]上均有报道，这是国内首次详细报道艾氏链格孢菌引起大蒜根腐病。

链格孢菌寄主广泛，可引起树莓茎溃疡病、木薯白点病、柑橘黑腐病和褐斑病、二月兰叶斑病等病害，对其进行生长特性的研究，发现在不同作物上的研究结果并不一致。温度对真菌的繁殖及产毒均有重要的影响，本研究中链格孢菌 DS55-6F 在 28℃条件下菌落生长最适宜，与马连杰等^[20] 对重庆地区蚕豆叶部链格孢菌 2 株病原菌研究结果一致，而树莓茎溃疡病原菌细极链格孢（A．tenuissima）^[7]、芹菜叶斑病病原菌细极链格孢 Q1（A. tenuissima）^[21]、云南省荞麦叶枯病病原菌链格孢 （A. alternata）^[22]的最适温度同为 25℃，说明链格孢菌属菌株间最适温度相似（25～30℃），这与田间植株暴发病害时期的温度条件较为一致。

土壤酸碱度对病原菌繁殖具有重要作用。张贺等^[23]研究杧果专化型链格孢叶斑病菌结果表明，杧果专化型链格孢生长的 pH 为 7，同样蚕豆专化型链格孢菌、荞麦专化型链格孢（A．alternata）最适 pH 均为 7，芹菜专化型细极链格孢 Q1（A．tenuissima）最适 pH 为 7.5，而本研究中大蒜专化型根腐病病原菌链格孢菌 DS55-6F 最适 pH 为 6。

碳源为病原真菌提供了其生长繁殖所必需的碳素以及通过氧化过程为病原真菌提供了能源^[24]。本文研究结果表明，葡萄糖、麦芽糖、淀粉可以显著促进大蒜根腐病病原菌链格孢菌 DS55-6F 菌丝生长，乳糖不能促进其菌丝生长。梁林波等^[25]报道杯鞘石斛专化型链格孢病菌能较好地利用蔗糖、葡萄糖、乳糖和淀粉碳源；刘行风等^[19]报道黑龙江省黄瓜专化型链格孢（A．alternata）最适碳源为葡萄糖和蔗糖；黎妍妍等^[10]报道湖北省烟草赤星病细极链格孢（Alternaria tenuissima）、链格孢 （Alternaria alternata）、长柄链格孢（Alternaria longipes）和鸭梨链格孢（Alternaria yaliinficiens）4 种链格孢最适宜碳源为乳糖等。以上树莓专化型细极链格孢（A．tenuissima）、黑龙江省黄瓜专化型链格孢（A．alternata）、云南省荞麦专化型链格孢（A． alternata）的菌落生长最适碳源为麦芽糖等与本研究结果略有差异。

植物对氮素需求量大，土壤供应量相对较小，供求间存在着尖锐矛盾，其原因主要是土壤中氮素，尤其是硝态氮的移动性强（如铵态氮硝化）^[26]。张建强等^[21]研究表明，芹菜专化型细极链格孢 Q1（A. tenuissima）最适氮源为硝酸钾，这一结果与本研究结果一致，而对于烟草赤星病细极链格孢（Alternaria tenuissima）最适氮源则是蛋白胨^[10]。而对链格孢的其他种，如长柄链格孢（Alternaria longipes）的最适氮源为氯化铵，链格孢（Alternaria alternata）、黄瓜专化型链格孢（A．alternata）、甘蓝专化型链格孢（Alternaria sp.）和鸭梨链格孢（Alternaria yaliinficiens）最适氮源是蛋白胨^[27]。本研究中发现大蒜病原菌 Alternaria embellisiaDS55-6F 在以硝酸钾或牛肉浸粉为唯一氮源的培养基上生长较好，在以硫酸铵或氯化铵为唯一氮源的培养基上生长较差，与同属其他菌株略有不同。

目前在大蒜上分离的根腐病病原菌以镰刀菌属居多，研究大蒜专化型链格孢的报道较少。

本研究通过对大蒜感病样品分离培养、病原菌回接验证等实验获得可引起大蒜根腐病的病原菌艾氏链格孢菌 Alternaria embellisia DS55-6F，通过形态学特征、分子生物学等方法较为系统地对病原菌进行了鉴定，并研究了它的生长特性，为今后开展该病害的防控技术研究提供参考。

参考文献