有机肥料是一种绿色、环保、高效的新型肥料，已经成为我国化肥行业的重要发展方向，也是改善土壤环境、防患环境污染、实现减肥增效的强力措施。以畜禽粪便为主要原料的有机肥料成为农田抗生素污染的重要来源。在养殖过程中，有 60%～90% 的抗生素以原药和代谢产物的形式随着禽畜粪便排出。这些抗生素在自然环境中一部分可能被植物吸收，最终又被人体吸收，而另外一部分则富集在土壤中，给地下水等造成威胁。有机肥料生产过程中，部分不法生产商将农药、激素、除草剂、保水剂等化学药物添加其中，短期内起到了减肥增效的作用，但长期使用势必造成环境的污染和人体的伤害^[1-3]。

国家标准《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》（GB 31650-2019）中已明确规定氯丙嗪等镇静剂和β- 受体激素类药物只允许治疗使用，不得在动物源食品中检出，国际食品法典委员会 （CAC）、欧盟、澳大利亚等国家和地区均对畜肉中镇静剂和β-受体激素的检出和限量值做出了相关规定。但由于镇静剂和β-受体激素类药物品种众多，且我国有机肥料生产企业较多，很难掌握在有机肥料生产时药物残留的情况，因此开发筛查有机肥料中镇静剂和β-受体激素类药物的方法尤为重要^[4-6]。磁性石墨烯是由石墨烯化学制备而成，基于磁性石墨烯纳米粒子具有的多种磁性质，通过分析物与柱填料之间的亲和力实现固相萃取^[7-10]。

随着液相色谱和质谱技术的发展，液相色谱串联质谱法正越来越广泛地应用于违禁药物的分析中，其分析范围广，背景干扰少，灵敏度高，选择性强，结果精确可靠，既可定性又可定量，是对复杂样本中药物残留快速检测的首选方法^[11-13]。本研究利用磁性石墨烯固相萃取结合高效液相色谱串联质谱技术，建立了有机肥料中 8 种具有代表性的镇静剂类药物和 15 种β- 受体激素类药物的筛查检测方法，该分析方法较上述报道在样品处理上操作简单，分析时间更短，为同时监控有机肥料中镇静剂类和β- 受体激素类药物提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：液相色谱串联质谱仪：Agilent 1290-6460，分析天平（XS303S，METTLER TOLEDO），离心机（5810 型、Eppendorf 公司），均质器（T25 型，IKA 公司），氮吹仪（N-EVAP），涡流混匀器（IKA MS3 basic），磁性石墨烯（G-Fe₃O₄）。

试剂：乙腈、甲醇均为色谱纯（美国 Fisher 公司），甲酸、氨水为色谱纯（美国 TEDIA 公司），水采用 GB/T6682 规定的一级水。

标准物质：乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安、莱克多巴胺、苯乙醇胺 A、齐帕特罗、喷布特罗、班布特罗、妥罗特罗、克伦特罗、沙丁胺醇、马喷特罗、塞布特罗、特布他林、马布特罗、溴布特罗、氯丙那林、盐酸溴代克伦特罗、氯丙嗪 -d₆、莱克多巴胺 -d₃、克伦特罗 -d₉、沙丁胺醇-d₃，均购自 DR. 公司，纯度均大于 95%。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安、莱克多巴胺、苯乙醇胺 A、齐帕特罗、喷布特罗、班布特罗、妥罗特罗、克伦特罗、沙丁胺醇、马喷特罗、塞布特罗、特布他林、马布特罗、溴布特罗、氯丙那林、盐酸溴代克伦特罗、氯丙嗪 -d₆、莱克多巴胺 -d₃、克伦特罗 -d₉、沙丁胺醇 -d₃：用甲醇配制，按纯度标示折算分别配制成浓度为 100μg/mL 的标准储备液，避光于 4℃下保存。

将 23 种外标储备液用甲醇稀释，混合配制成浓度为 1.0μg/mL 的标准外标工作液，4 种内标储备液用甲醇稀释，混合配制成浓度为 1.0μg/mL 的标准内标工作液。标准工作曲线用初始流动相配制，配制外标浓度分别为 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、 8.0、10.0μg/L，内标浓度为 5.0μg/L，现用现配。

1.2.2 样品前处理

样品提取：称取试样 2.00 g，置于 100 mL 聚丙烯离心管中，加入 3 mL 水和 2.0 g 氯化钠，加入 20 mL 0.1% 的甲酸乙腈，均质提取 2.0 min，然后于 10000 r/min 离心 10 min，并将 5 mL 上清液全部转移置 50 mL 离心管中，加入 5 mL 正己烷，涡混后静置，去掉上层正己烷，待净化。

样品净化：分别用 3 mL 丙酮、甲醇和去离子水清洗 15.0 mg 磁性石墨烯（G-Fe₃O₄），然后将其加入装有 5 mL 样品溶液的离心管中，涡旋 10 min，静止萃取 15 min。萃取结束后，在试管外放磁铁吸附磁性石墨烯，弃去上层清液，将磁性石墨烯转移至另一个干净的离心试管中，加入 1 mL 乙腈 / 氨水（v∶v=95∶5）溶液，涡旋 3 min 洗脱，洗脱 4 次，合并洗脱液，氮气吹干，流动相定容至 1 mL，过 0.22μm 滤膜，进行 HPLC-MS/MS 测定分析。

1.2.3 检测条件

1.2.3.1 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C₁₈（3.0 mm×100 mm，1.8μm）；流动相：0.1% 甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脱程序：0 → 3.0 min，由 10% B → 30% B；3.0 → 5 min，30% B → 70% B；5.0 → 7.0 min，70% B → 90% B；7.01 min， 10% B，平衡 3 min；柱温：40℃；流速：0.3 mL/ min；进样量：20μL。

1.2.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离 ESI（+）； 扫描方式：多反应监测（MRM）扫描；干燥气温度：350℃；干燥气流速：10 L/min；喷雾针压力： 275.8 kPa；电子倍增器电压：4000 V；碰撞气：氮气，纯度 99.999%。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

对于串联质谱，1 个母离子和 2 个特征子离子即可满足质谱确证的需要。在本实验中，分别将 8 种镇静剂类、15 种β- 受体激素类药物及 4 种内标的标准溶液配成一定浓度的标准溶液，不接色谱柱，直接进行质谱分析。首先在正离子模式下进行全扫描，确定化合物的分子离子，即为母离子。然后给予一定的碰撞能量和碰撞气体，全扫描二级离子，选取干扰较小、丰度较强的子离子作为定性和定量离子，即特征子离子。同时优化碎裂电压和碰撞能量，8 种镇静剂类和 15 种β-受体激素类药物及 4 种内标的质谱参数优化结果见表1。

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取液的选择

提取试剂的选择在样品前处理过程当中至关重要，不仅要考虑萃取效率，还要尽可能使其他基质或杂质干扰物不溶解或少溶解，本实验选取了兽药残留常用的有机溶剂作为提取试剂，主要包括乙酸乙酯、乙腈、甲醇。有机肥料的样品基质较为复杂，考虑到有机肥料样品中蛋白含量较高，在提取试剂当中加入 0.1% 甲酸乙腈能够更好地起到沉淀蛋白的作用，通过实验比较，0.1% 甲酸乙腈较其他两种试剂药物提取效率更高，因此对比优化后用 0.1% 甲酸乙腈溶液作为提取液。

注：* 表示定量离子。

2.2.2 磁性固相萃取条件的选择与优化

2.2.2.1 磁性石墨烯用量的选择

磁性石墨烯用量在固相萃取中对目标物净化和吸附结果的影响较大，本实验分别选取了 5、10、15、20、25、30 mg6 个用量，考察和比较了磁性石墨烯对目标物的最佳萃取使用量，结果如图1 所示，用量在 10 mg 以下时，回收率较低，用量在 15 mg 时回收率达到 97%，用量在 30 mg 时回收率甚至有所下降，考虑与用量大致使解吸不完全有关，本实验选取 15 mg 磁性石墨烯作为净化。

2.2.2.2 萃取时间的优化

为考察磁性石墨烯的萃取时间对 8 种镇静剂类和 15 种β- 受体激素类药物的影响，分别比较了在 5、10、15、20、25、30min 6 个时间水平下 23 种药物回收率的情况。结果如图2 所示，萃取时间从 5 min 增加至 15 min 时，回收率急剧增大到 90% 左右；其后随着萃取时间的增加，回收率又呈现缓慢下降的趋势，甚至最后萃取时间为 30 min 时，目标化合物的回收率要低于 15 min 萃取时间目标化合物的回收率，最终本实验最佳的萃取时间确定为 15 min。

2.2.3 解吸液选择

化合物的洗脱与其自身的酸碱性、极性等化学性质相关，本实验通过比较常用的解吸液乙腈和甲醇，发现乙腈的解吸率较高。然后分别比较了不同浓度酸碱条件：乙腈甲酸（v∶v=98∶2）、乙腈甲酸（v∶v=95∶5）、乙腈甲酸（v∶v=92∶8）、乙腈甲酸（v∶v=90∶10），乙腈氨水（v∶v=98∶2）、乙腈氨水（v∶v=95∶5）、乙腈氨水（v∶v=92∶8）、乙腈氨水（v∶v=90∶10）。通过比较，在乙腈氨水 （v∶v=95∶5）的条件下目标物解吸率最高，所以本实验选择乙腈氨水（v∶v=95∶5）作为解吸试剂。

分别选取 1、2、3、4、5 mL 进行解吸，结果表明，随解吸液体积增大，回收率逐渐增大，3 mL 时增加到最大，再增大用量，回收率基本不变，因此，本实验选取 4 mL 作为最终解吸体积。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 色谱柱的选择

通过文献整理和比较，镇静剂类和β- 受体激素类部分药物在极性方面相近，因此在色谱分离方面要尽可能选择高效的液相色谱柱，以提高色谱柱分离速度和灵敏度，在色谱柱的选择性方面，选用粒径 1.8μm 填料的色谱柱，分别比较 Agilent ZORBAXEclipse Plus C₁₈ 系列 1.8μm 填料，柱长分别为 2.1 mm×50 mm、2.1 mm×100 mm、3.0 mm×100 mm，以及 C₁₈ 与 C₈ （3.0 mm×100 mm，1.8μm）两种相同规格、不同性质的色谱柱，综合比较了分离效率、灵敏度和耐用性，柱长为 3.0 mm×100 mm C₁₈ 更好。

2.3.2 流动相的选择

本实验分别选用甲醇 / 水、乙腈 / 水、甲醇 / 0.1% 甲酸水、乙腈 /0.1% 甲酸水、乙腈 /10 mmol/L 乙酸铵、甲醇 /10 mmol/L 乙酸铵溶液作为流动相，在电喷雾源 ESI（+）方式下，同时在甲醇 /0.1% 甲酸水溶液组成的流动相中，质谱的离子化效率优于其它试剂，因此本文选择甲醇 /0.1% 甲酸水作为流动相。并调整合适的流动相比例，进行梯度洗脱，在本文的液相条件下，23 种化合物的总离子流色谱图（TIC）和代表性化合物的多反应监测色谱图 （MRM），见图3。

2.4 方法的线性范围和检出限

按上述离子扫描方法进样测定，以浓度为横坐标，定量离子的色谱峰面积为纵坐标分别绘制各镇静剂类和β-受体激素类药物的标准曲线，得到镇静剂类和β- 受体激素类药物的线性方程、决定系数和检出限，结果见表2。表2 表明，23 种目标物在 0.5～10.0μg/L 范围内线性关系良好，决定系数均大于 0.999。

2.5 准确度和精密度实验

以空白有机肥料为样品，分别在 2、5、10 μg/kg3 个水平下进行加标回收实验，每个样品重复测定 6 次，考察本方法的准确度和精密度，结果见表2。有机肥料中镇静剂类和β- 受体激素类药物的平均回收率在 75.1%～102.4% 之间，相对标准偏差为 4.3%～14.3%（n=6），回收率和精密度等均满足分析要求。

3 结论

本文采用高效液相色谱-串联质谱、磁性石墨烯净化技术，建立了有机肥料中多种镇静剂类和 β-受体激素类药物残留的液相色谱-串联质谱分析检测方法。创新性的采用磁性石墨烯固相萃取作为净化材料，提高了样品前处理效率，降低了环境污染，为监控有机肥料中镇静剂类和β- 受体激素类药物残留提供了有力的技术支持。

参考文献