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磷是影响作物生产力的第二大植物养分限制因子。它在植物代谢中具有明确的作用，如细胞分裂、发育和光合作用、营养物质运输、遗传信息的传递以及代谢途径的调节[1]。与其他大量营养元素相比，磷是植物和土壤中流动性最小的元素[2]，因此常常是植物生长的限制因素[3]。磷在土壤中主要以不溶性、无机或有机化合物的形式存在。在大多数土壤中，磷酸盐与 Ca2+、Al3+、Fe2+ 或 Mn2+ 结合，具体取决于土壤 pH 值、有机质和微生物类型[4]。可溶性形式（H2PO4- 和 HPO4 2-）仅在低浓度下可用，因此限制了植物生长[5]。
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根际溶磷细菌（PSB）通过间接向植物提供磷促进植物生长。不溶性有机磷通过微生物产生的磷酸酶的作用矿化，而无机磷在 PSB 分泌的低分子量有机酸作用后被利用[6]。
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PSB 在释放有机磷酸盐或溶解不溶性无机磷酸盐方面发挥着极其重要的作用[7]。这些微生物通过产生的铁载体、多种有机酸、羟基和羧基，并将它们螯合到结合磷酸盐和有效钙中，从而溶解钙、铁和铝的无机土壤磷酸盐[8]。PSB 不仅能改善植物磷素营养，还能促进土壤中有益微生物的代谢活动，显著改善植物根部营养，提高作物的增产效果。
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以巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）YRP31 为研究对象，通过菌株的生理生化实验、固体培养基解磷实验、液体培养基中难溶性无机磷的解磷能力的测定等，为深入研究其解磷机理以及溶磷生物肥料的研制与应用提供了科学依据。
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1 材料与方法
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1.1 土样采集
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分别从上海市闵行区马桥农业又冉基地试验田水稻、番茄、上海青等作物根际采集土样，放入塑料袋中，置于 4℃的冰箱保存。
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1.2 培养基
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用于溶磷菌筛选的培养基为无机磷培养基：葡萄糖 10 g、（NH4）2SO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、 NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.36 g、 MnSO4·H2O 0.03 g、Ca3（PO4）2 5.0 g 溶于 1000 mL 蒸馏水中。用于菌株纯培养的培养基为 LB 培养基：牛肉膏蛋白胨 10.0 g，酵母浸膏 5.0 g，NaCl 2.0 g 溶于 1000 mL 蒸馏水中，固体培养基加 2% 琼脂。
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1.3 菌株分离及生理生化鉴定实验
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称取风干土样 1 g 于 100 mL 无菌水中，充分振荡混匀，静置 20 min，取上清液作 10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5、10-6 稀释度，各吸取 0.2 mL 均匀涂布于固体无机磷培养基上，每个浓度重复 3 皿， 30℃条件下培养 48 h，将周围出现透明圈的单菌落转接至另一新鲜固体培养基内继续培养，经反复分离筛选，最终根据产生透明圈的大小及稳定性确定具解磷能力的菌株供后续研究使用。
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生理生化实验根据《常见细菌系统鉴定手册》[9] 中有关属、种鉴定的内容和方法，进行了菌株的革兰氏染色、需氧性测定、V-P 实验、酪素水解实验、硝酸盐还原实验、吲哚实验、柠檬酸盐利用实验、M-R 实验、苯丙氨酸脱氨酶实验、淀粉水解实验、过氧化氢酶实验、葡萄糖发酵实验、明胶液化实验等。
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1.4 最适生长条件及生长曲线的测定
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1.4.1 温度对菌株 YR-P31 生长的影响实验
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在 250 mL 锥形瓶中装入 100 mL 无机磷液体培养基，经灭菌后各接种 2 mL（108 cfu/mL），分别于 30.0、32.5、35.0、37.5、40.0℃的振荡培养箱中培养，转速为 180 r/min，培养 24 h，测定细菌生长的 OD600 值。
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1.4.2 pH 值对菌株 YR-P31 生长的影响实验
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利用 HCl、NaOH 调节无机磷液体培养基的 pH 值至 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，灭菌后各接种 2 mL（108 cfu/mL）菌液，于 30℃振荡培养箱中培养，转速为 180 r/min；培养 24 h 测细胞生长量，确定细菌最适生长的 pH 值范围。
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1.4.3 溶氧量对菌株 YR-P31 生长的影响实验
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在 250 mL 锥形瓶中分别装 30、60、80、100、 120 mL 的无机磷液体培养基，灭菌后按 2% 的接种量接种，于 30℃振荡培养箱中培养，转速为 180 r/min，培养 24 h，测定细菌的细胞生长量。
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1.4.4 生长曲线的测定
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按上述实验中确定的最适生长条件，按 2% 接种量接种于 250 mL 锥形瓶（含 100 mL 无机磷液体培养基）中培养，定时取样测定 OD600 值的经时变化。
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上述实验均以不接菌的同体积无机磷液体培养基为对照，每个处理均设 3 个重复。
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1.5 解磷能力的测定
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1.5.1 菌株 YR-P31 在固体培养基上解磷能力的测定
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将菌株 YR-P31 接种于无机磷固体培养基中，倒置于 35℃恒温箱中培养 72 h，观察透明圈，测量、计算溶磷圈直径（D）和菌落生长直径（d）的比值（D/d），对解磷能力进行表征。
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1.5.2 菌株 YR-P31 在液体培养基中解磷能力的测定
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将 100 mL 无机磷液体培养基分装于 250 mL 锥形瓶中，加入 2 mL 已培养 24 h 的菌液（108 cfu/ mL），35℃、180 r/min 摇床培养，分别在 24、48、72 h 测定菌株溶解无机磷的能力，同时测定培养液的 pH 值。对照接等量的灭活菌液，所有处理均设 3 个重复。
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培养液中有效磷按钼蓝比色法[10]绘制磷含量的标准曲线（Y=0.0061X，R2 =0.9999）。定时取 5 mL 菌液于 4000 r/min 下离心 20 min，取上清液 1 mL 稀释至 20 mL，从中取 2 mL，用钼蓝比色法测定吸光度值，根据标准曲线计算上清液中磷的含量。培养液中的总磷按无机磷培养基中总磷以加入 Ca3（PO4）2 的量计算。
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1.5.3 菌株 YR-P31 在固体培养基上解磷及促生作用
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将 0.5 mL（约 103 cfu/mL）大肠杆菌菌悬液涂布接种于含有无机磷固体培养基表面并风干。用 Φ10 mm 的无菌滤纸片蘸取解磷菌 YR-P31 菌液后，置于无机磷固体培养基中央，35℃条件下倒置培养 48 h，观察滤纸片周围是否有大肠杆菌生长。对照 1 接等量的灭活菌液，对照 2 接无菌水。所有处理均设 3 个重复。
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1.6 仪器及设备
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QHZ-98A 全温度振荡培养箱（江苏太仓华美生化仪器厂），LRH 生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），XSP-8CA 光学显微镜（上海光学仪器厂），752N 紫外可见分光光度计（上海仪电科学仪器股份有限公司），PHS-2F 数字酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。
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2 结果与分析
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2.1 菌株 YR-P31 的分离筛选
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以 Ca3（PO4）2 为唯一磷源，从约 100 个可在无机磷固体培养基上生长的菌落中，筛选分离出 1 株在无机磷固体培养基上产生明显透明圈的解磷细菌（图1），编号为 YR-P31。菌株 YR-P31 经多次分离纯化后，于 LB 培养基培养 24 h 后，-80℃保存备用。
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图1 分离出的解磷菌株 YR-P31
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2.2 菌株 YR-P31 的形态及生理生化鉴定
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菌株 YR-P31 在 LB 培养基上菌落为圆形，表面略有光滑、半透明、淡黄色，菌落边缘不整齐、中心隆起。细胞呈杆状，末端圆，直径 1.2~1.5μm、长度 2.0~4.0μm，周生鞭毛，芽孢直径 1.0~1.2μm、长度 1.5~1.8μm，椭圆形，中生或次端生。
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生理生化反应结果如表1 所示。由表1 可得，菌株 YR-P31 革兰氏染色为阳性，严格好氧，V-P 反应为阴性，水解淀粉和酪素，不还原硝酸盐，吲哚实验为阴性，柠檬酸盐利用实验为阳性，M-R 实验为阳性，过氧化氢酶实验为阳性，苯丙氨酸脱氨酶实验为阳性，液化明胶，能利用多种糖类，发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。
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结合形态观察和生理生化实验结果，检索《伯杰氏鉴定手册》可确定菌株 YR-P31 属于巨大芽孢杆菌属（Bacillus megaterium sp.）。
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巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）是一种好氧产孢、革兰氏阳性细菌，至今已有一百多年的研究历史，是我国用于解磷细菌肥料生产中最早的菌种之一。随着研究的不断深入，巨大芽孢杆菌在水质净化、农药降解、微生物菌肥制作、抗生素合成、酶工业化生产等方面也被广泛地应用[11]。1971 年， Paul 等[12]测定从豆科植物根际分离出来的几株芽孢杆菌溶解磷酸三钙的效率高达 18%，其中解磷能力最强的是巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；2016 年，刘露等[13] 从黄岛区盐碱地分离和筛选到 6 株解磷菌，其中巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）PC02 解磷能力最高，有效磷含量为 80.3 mg/L。随着巨大芽孢杆菌解磷家族的不断扩大[14-18]，研究者们对其解磷机制的关注热度也逐步增加。
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2.3 巨大芽孢杆菌 YR-P31 的最适生长条件及生长曲线
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2.3.1 温度对巨大芽孢杆菌 YR-P31 生长的影响
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温度是影响微生物生长和代谢的重要因素。温度每提高 10℃，酶促反应速度就会增加一倍。在 250 mL 锥形瓶中装入 100 mL 无机磷液体培养基，分别于 30.0、32.5、35.0、37.5、40.0℃的振荡培养箱中培养，不同温度下 OD600 值变化如图2 所示。
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图2 温度对巨大芽孢杆菌 YR-P31 生长的影响
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由图2 可知，在最初 4 h 时，菌株 YR-P31 在 30℃条件下的增长速度最慢，在 40℃条件下生长速度最快，生长速度与温度呈正相关关系。随着培养时间的延长，菌株 YR-P31 在各温度条件下的生长速度趋于一致，OD600 值几乎相同。为了缩短延迟期、节约能耗，本研究选择 35℃为最适培养温度。
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2.3.2 pH 值对巨大芽孢杆菌 YR-P31 生长的影响
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pH 值是影响微生物生长和代谢的另一重要因素。解磷菌的解磷过程非常复杂，其解磷机制也因环境、微生物菌种不同而有所不同。目前认为主要有有机酸酸解作用、酶解作用和释放 H+ 等[19-20]，而这些过程都可能会引起介质 pH 值发生变化。利用 HCl、NaOH 调节无机磷液体培养基的 pH 值至 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，于 30℃振荡培养箱中培养 24 h 后测细胞生长量，菌株 YR-P31 在各 pH 值条件下的生长情况如图3 所示。
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图3 pH 值对巨大芽孢杆菌 YR-P31 生长的影响
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从图3 可以看出，当初始 pH 值为 5 时，菌株 YR-P31 在 4、8、12 和 16 h 的生长速率变化不大； 当初始 pH 值为 6.0 和 7.0 时，菌株 YR-P31 在最初 4 h 生长最好；当初始 pH 值为 9.0 时，菌株 YRP31 在最初 4 h 生长非常缓慢，在后面的数小时内生长情况虽有好转，但总体不如初始 pH 值为 6.0 和 7.0 时的生长速率。由此可见，菌株 YR-P31 对于环境的酸碱度具有一定的适应能力，但最适的 pH 值范围为 6.0～7.0。
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在 250 mL 锥形瓶中分别装 30、60、80、100、 120 mL 无机磷液体培养基，于 30.0℃振荡培养箱中培养，测定细菌的细胞生长量，考查溶氧量对菌株 YR-P31 生长的影响。结果发现不同装液量对菌株 YR-P31 的生长无显著影响（数据未显示）。
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2.3.3 巨大芽孢杆菌 YR-P31 的生长曲线
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按上述实验中确定的最适生长条件，在含 100 mL 无机磷液体培养基的 250 mL 锥形瓶中，接种菌液 2 mL，每隔 2 h 取样一次，测定 OD600 值的经时变化。结果如图4 所示，随着培养时间的延长， OD600 值逐渐增加，迟缓期、对数期与稳定期分别在0～2、2～6、6～12 h，6 h 后 OD600 值达到 2.5。说明在这个实验条件下，菌株 YR-P31 解磷能力强，生长速度快，细胞数量大。
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2.4 巨大芽孢杆菌 YR-P31 的解磷作用
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2.4.1 巨大芽孢杆菌 YR-P31 在固体培养基中分解 Ca3（PO4）2 的能力
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解磷菌在固体培养基中的解磷能力可以通过透明圈法进行定性判断。将菌株 YR-P31 接种于以 Ca3（PO4）2 为唯一磷源的无机磷固体培养基静置培养 72 h，其菌落生长直径（d）、溶磷圈平均直径 （D）及 D/d 变化如表2 所示。
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图4 巨大芽孢杆菌 YR-P31 的生长曲线
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由表2 可见，在培养最初 48 h，菌落直径及溶磷圈直径变化不大，但在后 12 h 里，菌落直径及溶磷圈直径均有明显增加，72 h 后菌落直径为 7.0，溶磷圈直径为 12.5，D/d 为 1.86。万水霞等[21]从玉米根际土壤筛选出的芽孢杆菌属（Bacillus aryabhattai） CH07 和链霉菌属（Streptomyces maritimus）FD11，其 D/d 分别为 1.86 和 2.05；史发超等[22] 从土壤样品中筛选到溶磷菌斜卧青霉菌（Penicillium decumbens） P83，其 D/d 最大为 1.91。这些实验数据与本研究的实验结果近似。但史国英等[23]从甘蔗根际土壤分离得到一株高效解无机磷细菌 BS06，其 D/d 却高达 2.8。
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因为不同菌株在不同培养条件下对磷酸钙的溶解能力存在较大差异，因此仅从磷菌圈的大小还不能准确断定该菌株溶磷能力的强弱，还需要通过液体摇床培养等方法对其溶磷能力进行定量测定[24]。
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2.4.2 巨大芽孢杆菌 YR-P31 在液体培养基中分解 Ca3（PO4）2 的能力
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以 Ca3（PO4）2 为唯一磷源接种菌株 YR-P31， 35℃、180 r/min 摇床培养，分别在 24、48、72 h 测定菌株溶解无机磷能力，同时测定培养液的 pH 值。其测定结果见图5 和 6。
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图5 巨大芽孢杆菌 YR-P31 在无机磷液体培养基的溶磷效果
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图6 巨大芽孢杆菌 YR-P31 在无机磷液体培养基的 pH 值变化
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由图5 可见，在液体培养基中，巨大芽孢杆菌 YR-P31 对 Ca3（PO4）2 同样有较高的分解能力，培养 24 h 后，培养液中的有效磷浓度为 451 mg/L，得率为 9.02%；48 h 后，培养液中的有效磷浓度为 675 mg/L，得率为 13.5%；72 h 后，培养液中的有效磷浓度为 840 mg/L，得率为 16.8%，分别比对照增加了 15、21 和 26 倍。由图6 可见，在最初 24 h 培养液的 pH 值由 7 下降至 5.3，48 h 后下降至 4.7，随后开始呈上升趋势，72 h 后达 5.1。
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据报道，芽孢杆菌属（Bacillus aryabhattai） CH07 和链霉菌属（Streptomyces maritimus）FD11 在无机磷液体培养基中的溶磷量分别为 368.5 和 321.5 mg/L[21]；斜卧青霉菌（Penicillium decumbens）P83 对 Ca3（PO4）2（5 g/L）的溶磷量达 956 mg/L，溶解率为 42.68%[22]；Liu 等从石灰性根际土壤中分离到 20 株溶磷细菌，其中 4 株 PSB 菌株在培养 3 d 后释放可溶性磷达 523.69 mg/L[25]；韩蕾等[26]从新疆盐碱土中分离纯化得到一株高效解磷菌 PS-3，其对磷酸三钙的溶解量甚至达到 1002.95 mg/L。
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关于解磷菌对难溶无机磷酸盐的解磷机理，有研究认为培养介质 pH 值与解磷作用存在显著的相关性[12]，也有研究认为 pH 值与微生物溶磷量之间缺乏相关性[27-28]。在本试验条件下，培养初期随着培养液 pH 值的逐渐降低，培养液中的有效磷浓度逐渐升高；随着培养时间的延长，培养液 pH 值约为开始回升，培养液中有效磷浓度还在继续上升。说明菌株 YR-P31 的解磷量与 pH 值在一定培养时间内具有一定的相关性。同时说明菌株 YR-P31 除了通过产酸解磷外，可能通过酶促反应进行解磷。
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2.4.3 巨大芽孢杆菌 YR-P31 在固体培养基上的解磷及促生作用
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在涂有大肠杆菌菌悬液的无机磷固体培养基表面，放置含解磷菌 YR-P31 菌液滤纸片，培养 48 h 后的结果如图7 所示。
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由图7 可见，在含有实验菌菌液的滤纸片周围有明显的解磷圈。在解磷圈的外侧明显可见有大肠杆菌菌落生长且越靠近边缘菌落越小。而对照组却没有菌落形成。这一结果说明菌株 YR-P31 不但具有解磷能力，而且这些可溶性磷还可为其他不能利用 Ca3（PO4）2 的微生物提供磷源。同时，这一结果也为本研究的深入进行提供了有力的数据支持。
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图7 巨大芽孢杆菌 YR-P31 在固体培养基上的解磷及促生作用
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注：A. 菌株 YR-P31；B. 灭活 YR-P31；C. 无菌水滤纸片。
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3 结论
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利用微生物分离技术，从农作物根际土壤中分离到具有解磷能力的菌株 YR-P31，经生理生化实验初步鉴定为巨大芽孢杆菌。
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菌株 YR-P31 能利用 Ca3（PO4）2 为唯一磷源生长。其在无机磷液体培养基生长的最适温度和 pH 值分别为 35℃和 7.0。在此条件该菌株 72 h 的解磷率为 16.8%。
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菌株 YR-P31 在无机磷固体培养基培养 72 h 后，菌落直径为 7.0，溶磷圈直径为 12.5，D/d 为 1.86。此外该菌株对无解磷能力的大肠杆菌具有促生作用。
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摘要
从水稻等作物根际土壤中分离到 1 株解磷菌。该菌株能够以 Ca3（PO4）2 为唯一的磷源良好地生长。经过对其形态特征、生理生化分析，初步鉴定为巨大芽孢杆菌属细菌。该菌株利用无机磷培养基生长的最适温度和 pH 值分别为 35℃和 7.0，其解磷作用是通过溶磷圈及在液体培养基内可溶性磷的增加来证实的。此外该菌株在固体培养基上还能促进大肠杆菌的生长。该菌株具有解磷能力和促生作用，在微生物肥料的进一步开发中具有很大的潜力。
Abstract
A phosphate-solubilizing bacterial strain was isolated from the rhizosphere soil of rice and other crops using the traditional method．This isolated strain were able to use Ca3（PO4）2 as sole source of phosphorus．It was identified as Bacillus megaterium sp．according to its morphology and biochemical properties analysis．The optimal pH value and temperature for its growth in inorganic phosphorus medium were 7 and 35 ℃，respectively．The phosphate-solubilizing capacity of the isolated strain was confirmed by the phosphate-solubilizing zone and the increase in soluble phosphorus in liquid cultures．In addition，the isolates also promoted the growth of Escherichia coli on solid medium．The isolated phosphate-solubilizing bacterial strain has great potential in further development of microbiological fertilizer because of its phosphorus dissolving ability and growth promoting effect.