土壤微生物是土壤系统的一个重要组成部分，参与了大量的生物化学反应^[1-3]，在植物生产力和生态系统稳定性方面发挥着至关重要的作用^[4-6]。其多样性和群落结构的变化可作为表征土壤健康与否的重要指标^[3，7]。大量研究表明，不同的栽培模式下，土壤微生物群落结构与多样性差异显著。刘蕾等^[8]在设施蔬菜中引入豆科作物轮作，土壤中真菌 Chao1 指数显著降低，同时己科河菌门及担子菌门的相对丰度增加明显。刘子涵等^[9]研究了不同覆盖模式对旱作农田土壤微生物多样性及群落结构的影响，表明垄膜沟播覆盖种植模式下土壤中担子菌门和球囊菌形成的外生菌根和从生菌根促进了根部养分的吸收，是作物增产的原因。

贵州是我国三大夏秋蔬菜优势主产区^[10]，随着农业产业结构的调整，在“一县一品”政策的推动下，单一优势蔬菜作物的大规模发展，造成土壤板结、土传病害发生，蔬菜品质、产量受到严重威胁。轮作是缓解连作障碍的常规做法，Brown 等^[11]研究表明，连作多年的土壤加入十字花科作物可增加土壤细菌多样性，抑制有害菌的生长繁殖。芥菜与连作茄子轮作可显著控制茄子黄萎病的发病率，并提高其产量^[12]。Radicetti 等^[13]将十字花科芸苔属植物组织残渣施入小麦田，发现可减少土壤内小麦全蚀病菌数量。合理的轮作不仅可以改善土壤质量，而且可以控制土传病害。因此，明确轮作模式下土壤微生物的群体结构与多样性变化，对土壤结构维持健康状态的意义重大。

栽培食用菌后的培养料主要是有机物食用菌分解吸收后残留的粗物质、食用菌代谢产物以及部分菌丝体^[14]，是一种改良土壤功能的优质肥料^[15]。研究证明香菇和平菇菌渣能提高土壤微生物数量和酶活性^[16-18]，车健美等^[19]的研究表明菌渣施入土壤可以改变黑麦植株根际土壤微生物群落结构，但这些研究局限于菌渣的添加，对菌-菜轮作模式下土壤微生物的变化未开展系统分析，尤其对土壤起到怎样的改良作用尚未见报道。故本文设置南瓜（茄子）-大球盖菇（羊肚菌）4 种轮作模式，对其土壤理化性质及其微生物群落结构和多样性进行分析，以期为贵州蔬菜产业绿色可持续发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计及样品采集方法

1.1.1 试验设计

试验于 2018～2020 年在贵州省农业科学院园艺研究所蔬菜基地进行。基地常年用于种植南瓜、茄子，土壤出现板结现象。土壤类型为石灰岩发育的微酸性黄壤，土壤有机质含量 28.96 g/kg，全氮含量 1.24 g/kg，碱解氮含量 150.21 mg/kg，有效磷含量 23.49 mg/kg，速效钾含量 250.32 mg/kg。试验设置 4 种轮作模式（表1），随机区组排列，3 次重复，每个小区 100 m²，共 12 个小区。每季南瓜（茄子）在每小区施以 N-P₂O₅-K₂O=15-15-15 的复合肥（总养分 45%），共 18 kg，基肥∶追肥 =1∶1，基肥在开厢后，均匀撒施在厢面，追肥在后期灌水过程中以水溶的形式分 2 次进行。每季大球盖菇播种：每小区投入菌种量 7 包（每包 500 g），培养基料为当年薏仁米、秸秆和米糠，每小区 300 kg，平铺在厢面上；羊肚菌：每小区投入菌种量 7 包（每包 500 g），培养基料为小麦、麦麸和玉米芯，平铺在厢面上，每小区 230 kg。

1.1.2 样品采集方法

2020 年 6 月，采用 5 点取样法，于每个小区 0～20 cm 耕层取样，然后混合均匀作为该小区的复合样品，每个样品分成两部分：一部分装到 50 mL 离心管中，立即放入－ 80℃冰箱中保存，用于土壤微生物 DNA 的提取。一部分土样风干后参照瞿飞等^[20]的研究用于测定全氮、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质含量。

1.2 测序与数据分析

委托上海美吉生物医药科技有限公司对土壤微生物总 DNA 进行测序。PCR 扩增采用的引物为细菌 16S RNA 基因中的 V3-V4 区引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），真菌引物为 ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）-ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。PCR 反应体系为 20μL，扩增程序为 95℃预变性 3 min； 35 个循环（95℃，变性 30 s，55℃ 退火，30 s； 72℃，延伸 45 s）；72℃，延伸 10 min。PCR 产物经 2% 的琼脂糖凝胶电泳检测。

得到的数据按照 97% 相似性对非重复序列进行 OTU 聚类，群落 OUT 数目指数中，ACE、Chao1 指数用来估计样本中微生物群落的丰富度，Shannon、Simpson 用来估算微生物群落的多样性^[21]。使用 Excel2016、SPSS 19.0 进行数据整理、方差分析及图表绘制，使用 R 软件绘制韦恩图、热图。

2 结果与分析

2.1 不同轮作模式下土壤真菌和细菌的 OTU 聚类

对 4 种种植模式下的土壤样品中真菌和细菌测序得到的序列进行聚类分析，按照 97% 的相似性对非重复序列进行 OTU 聚类，得到 OTU 集（图1）。不同轮作模式下得到的土壤样品中真菌和细菌 OUT 总数分别是 2298 和 15840 条，土壤微生物细菌的数量明显高于真菌的数量。4 种轮作模式共同含有的真菌 OUT 数 241 条，占总数的 10.49%；共同含有的细菌 OUT 数 2701 条，占总数的 17.05%；其中真菌 OUT 数最多的是常规轮作模式 A，共 1143 条，与菜-菌轮作模式（B、C、D）差异显著；细菌 OUT 数各模式之间没有显著差异。

2.2 不同轮作模式下真菌和细菌群落多样性分析

由表2 看出，真菌 Coverage 指数均大于 0.99，细菌 Coverage 指数均大于 0.97，可反映样本中微生物的真实情况。从真菌 α-多样性来看，菜-菌轮作模式 B、C、D 较常规轮作模式 A 的土壤样品中真菌的 ACE 指数、Chao1 指数、Shannon 指数降低显著，而 Simpson 指数增加，表明菜-菌轮作模式下，其土壤的真菌群落丰富度和多样性明显降低； 从细菌 α-多样性来看，菜-菌轮作模式 B、C、D 与常规轮作模式 A 下的各项参数之间没有显著差异，表明菜-菌轮作模式不会改变土壤的细菌群落丰富度和多样性。

注：柱上不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异达到显著水平（P<0.05）。下同。

2.3 不同轮作模式下门水平上土壤微生物的群落组成分析

2.3.1 真菌群落组成分析

4 种轮作模式下土壤真菌群落在门水平的分布见图2。平均相对丰度大于 0.1% 的真菌门有 4 种：子囊菌门、担子菌门、被孢霉菌门及未分类菌门，各菌门的相对丰度变幅分别为 66.12%～92.33%、 32.21%～1.40%、5.10%～1.44% 及 0.20%～1.60%。不同轮作模式下土壤真菌群落相对丰度存在明显差异，子囊菌门在所有处理真菌群落结构中占主导地位，相对丰度在 66% 以上。常规轮作模式 A，菜-菌轮作模式 C、D 处理下土壤样品中子囊菌门相对丰度显著高于菜-菌轮作模式 B 处理，菜-菌轮作模式 B 处理下土壤样品中担子菌门丰富度显著高于其他处理。

2.3.2 细菌群落组成分析

4 种轮作模式下土壤细菌群落在门水平的分布见图3。样品中平均相对丰度大于 0.1% 的细菌门有 10 种，分别为变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、己科河菌门、疣微菌门。变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、酸杆菌门在所有处理的细菌群落结构中处于优势菌群，菜-菌轮作模式 B、C、D 下变形菌门、厚壁菌门的丰富度增加显著，放线菌门、绿弯菌门降低明显。

2.4 不同轮作模式土壤主要微生物群落（属）相对丰度及聚类分析

由图4 可知，菜-菌轮作模式 B、C、D 中主要优势真菌群包括 Collarina、毛囊菌属（Chaetosphaeria）、木霉属（Trichoderma），在菜-菌轮作模式 B 处理中分别占比 4.83%、18.36%、12.69%，总占比 35.88%；在菜-菌轮作模式 C 处理中分别占比 7.57%、18.72%、11.92%，总占比 38.21%； 在菜-菌轮作模式 D 处理中分别占比 20.05%、 39.27%、8.60%，总占比 67.92%，与常规轮作模式 A 差异显著；而常规轮作模式 A 中主要优势真菌群是未分类的丛赤壳科属（unclassified_ f_nectriaceae）、枝孢属（Cladosporium）、镰刀菌属（Fusarium），分别占总数的 8.77%、10.63%、 8.37%。

由图5 可知，各轮作模式中主要优势细菌群包括：norank_f_norank_o_norank_c_Subgroup6、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）。在常规轮作模式 A 处理中占比分别是 6.97%、1.92%、2.76%、 5.18%；在菜-菌轮作模式 B 处理中占比分别是 6.30%、3.07%、4.23%、4.23%；在菜-菌轮作模式 C 处理中占比分别是 6.97%、3.81%、3.41%、 1.99%；在处理菜-菌轮作模式 D 处理中占比分别是 5.03%、2.96%、2.74%、1.91%。与常规轮作模式 A 相比，新鞘氨醇菌属（Novosphingobium） 和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）在菜-菌轮作模式 B、C、D 中增加显著，幅度分别为 1.14%、0.60%、0.38% 和 2.80%、1.70%、2.80%。

图4 和 5 显示不同轮作模式下土壤真菌和细菌群落物种丰度热图，根据物种或样品之间丰富度的相似性进行聚类分析，可将菜-菌轮作模式 B、C、D 聚在一个分枝，常规轮作模式 A 单独聚在一个小分枝，说明菜-菌轮作模式可以改变土壤微生物的类群分布。

2.5 不同轮作模式土壤理化指标与菌门之间的关系

由表3 可知，不同菜-菌轮作模式下土壤全氮、碱解氮、速效钾、有机质含量显著高于常规轮作模式 A。菜-菌轮作模式 D 的全氮含量显著高于常规轮作模式 A、菜-菌轮作模式 B，速效钾及有机质含量显著高于其他轮作模式；菜-菌轮作模式 C 的有效磷含量显著高于其他轮作模式。不同轮作模式下土壤理化指标与土壤微生物（门水平）结构的相关性见表4，变形菌门与全氮和有机质含量呈显著正相关，相关系数分别为 0.9802 和 0.9851，放线菌门与全氮和有机质含量呈显著负相关，相关系数分别为-0.9855 和-0.9797，各类真菌与土壤理化指标间未见显著的相关性。

注：^* 表示显著相关，P<0.05。

3 讨论

3.1 菜-菌轮作模式下真菌群落结构与多样性变化

不同的轮作模式下土壤真菌和细菌群落多样性存在一定的差异^[8]。本研究发现土壤细菌的数量明显高于真菌的数量，菜-菌轮作模式 B、C、D 土壤样品中真菌数量显著减少，表明引入食用菌轮作体系可以降低土壤中真菌的数量，与任琳等^[22]、胡留杰等^[23]的研究一致。子囊菌属于土壤腐生真菌，主要分解木质化植被碎屑，在土壤微生物真菌中属优势菌门^[24-25]，本研究显示，各轮作模式下，子囊菌门的占比都在 66% 以上，也证明了上述观点。相较于常规轮作模式 A、菜-菌轮作模式 C 和 D，菜-菌轮作模式 B 的子囊菌门丰富度下降显著，但是担子菌门丰富度显著升高，可能与大球盖菇本就属于担子菌有关，菜-菌轮作模式 B 中两年冬季都种植大球盖菇，增加了担子菌在真菌类群中的占比。

通过对属水平上微生物丰度分析，真菌主要优势菌群有木霉属（Trichodema）、枝孢属（Cladosporium）、镰刀菌属（Fusarium）等。镰刀菌属（Fusarium）是一种常见的土传习居菌，是多种植物上的病原微生物^[26]。Snyder^[27]研究证明枝孢霉的初级感染是通过土壤或种子发展的，并且消毒种子和豆荚的表面并不能预防病害。有研究表明对蚕豆接种枝孢菌菌株后，叶片出现损伤，且具有 100% 的致病性^[28]。这 2 种有害菌群落在常规轮作模式 A 处理下丰富度较高，在菜-菌轮作模式 B、C、D 中丰富度降低明显。木霉属（Trichodema）是植物病原拮抗真菌^[29]，并且可促进植物生长^[30]，属于有益菌群，本研究显示菜-菌轮作模式 B、C、D 较常规轮作模式 A 的木霉属（Trichodema）丰富度增加显著。上述结果表明菜-菌轮作模式可提高土壤中真菌有益菌群的丰富度，降低致病真菌群的丰富度。

3.2 菜-菌轮作模式下细菌群落结构与多样性变化

本研究发现细菌群落中变形菌门、放线菌门、绿弯菌门及酸杆菌门属于各轮作模式下的优势菌门，占比在 80% 以上。Fierer 等^[31]研究认为，变形菌门能更直接地利用不稳定的碳源，如植物残渣，而菜-菌轮作后残留土壤的菌渣中含有初级分解的有机物及未分解的有机物，菜-菌轮作模式 B、C、D 模式下土壤中变形菌门占比显著升高，也印证了菜-菌轮作下，菌渣的残留利于变形菌门的繁殖（土壤有机质含量与变形菌门丰富度显著正相关）。而放线菌门在常规轮作模式 A 的土壤样品中相对丰度最高，放线菌门产生的孢子能够抵抗外界不利的环境条件^[32]，在常规轮作模式 A 下的土壤有机质含量较少，土壤有机质含量与放线菌门丰富度呈显著负相关。同时土壤疏松度、透气性较差，不良的外界环境也会诱使产生更多的放线菌。生物碳施入量高，会增强土壤碳储存量^[33]，降低绿弯菌门的相对丰度^[34]，常规轮作模式 A 中没有进行菜-菌轮作，施入土壤的有机物较少，绿弯菌门的相对含量反而最高。

鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）广泛存在于自然界中，某些菌株可通过引起根部感染的方式入侵植物体内，在维持生态氮平衡方面起着重要作用^[35]。在所进行的微生物组分析框架中，鞘氨醇单胞菌属被认为是抗病表型中最具有特征性的微生物，其在水稻的抗性表型中显著富集^[36]，还对引起黄萎病的真菌（Verticillium dahliae）有拮抗作用^[37]。伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）是一类重要的与植物相关的有益微生物，能够通过生物固氮、解磷作用，促进植物对氮、磷的吸收，还能够产生吲哚乙酸等植物激素、分泌抗菌物质抑制病原菌的生长，在促进植物生长和维持植物健康方面具有较大的应用潜力^[38]。本研究表明，菜-菌轮作模式 B、C、D 相较于常规轮作模式 A，两类菌属丰度有显著升高，说明菜-菌轮作对土壤有益细菌的增加起促进作用，但对于作物的抗病性提升有待进一步研究。

4 结论

菜-菌轮作模式降低了真菌群落丰度及多样性，真菌中 Cladosporium（枝孢属）、Fusarium（镰刀菌属）两类致病菌群的丰度降低明显；菜-菌轮作模式改变了细菌群落的结构组成，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）两类有益菌丰度得以显著提高，证明菜-菌轮作模式可以提高土壤中有益菌群的丰度，对土壤正向改良有增益作用，为蔬菜作物克服连作障碍提供了新方法、新思路。但很多微生物的功能及其与环境作物之间的相互作用还不清晰，菌门之间可能存在的相互制约和竞争关系尚不清楚，还需要开展更加深入的研究进行验证。

参考文献