丛枝菌根（AM）真菌是一类古老的专性寄生真菌，广泛分布在陆地生态系统中，能够侵染 80% 以上的陆生高等植物（例如玉米、水稻等作物）的根系，并与寄主植株形成互利互惠的共生体^[1]。AM 真菌与宿主植物形成共生体后，利用其高度分枝的根外菌丝（ERM）深入土壤中，吸收寄主植物根系无法吸收区域的氮、磷、钾等矿物营养和水分，然后经菌根输送给寄主，以促进寄主吸收营养元素^[2]。而寄主植物将光合产物输送到根部，再由根内菌丝（IRM）将其合成脂类后转运给 ERM，以供 AM 真菌生长繁殖^[2]。此外，AM 真菌除能促进寄主植物生物量累积及矿质元素吸收外，还能产生土壤相关蛋白以改善土壤稳定性，提高土壤肥力^[3]。

近年来，作物和 AM 真菌的共生关系引起了广泛关注^[4]。该共生关系借助 AM 真菌 ERM 协助寄主根系吸收更多的矿质元素，以此降低化肥施用量，减少环境污染^[5]。马嘉琦^[6]研究发现，接种 AM 真菌可以有效提高玉米的株高及生物量，改善根际土壤理化性质，并通过调节作物气孔开度、水势来增强作物的生长发育。外国研究者发现菌根化甜玉米显示出更高的养分浓度及生长情况得到改善，产量有所提高^[7-10]。此外，AM 真菌对生存环境极为敏感，生存环境养分较高时，抑制孢子萌发和菌丝生长，从而降低对宿主植物根系的侵染能力^[11]。但是不同氮素对菌根化玉米的侵染率影响还缺少研究。

氮素是植物生长所必需的一种矿质元素，也是限制植物生长的因子之一，是体内核酸、磷酸、蛋白质和某些激素的重要组成组分，参与植物一系列生命活动（如细胞代谢、光合作用、能量代谢等）^[12]。在土壤中，氮素主要以无机氮和有机氮形式存在，无机氮主要以硝态氮（NO₃^--N）和铵态氮（NH₄ ⁺-N）存在，有机氮主要以氨基酸和多肽等形态存在。AM 真菌吸收土壤中的 NH₄ ⁺ 主要是通过根外菌丝细胞膜上的 NH₄ ⁺ 转运蛋白（GintAMT）完成^[13]，NO₃^- 的吸收则主要依靠菌丝细胞膜上的 NO₃^- 转运蛋白（NRT）完成。金海如等^[14]通过同位素标记法标记无机氮（硝酸钾、氯化铵）和有机氮（谷氨酸、精氨酸、尿素），发现 AM 真菌的根外菌丝可以吸收同化这些氮源，并整合入氨基酸中，无机氮源（NH₄ ⁺，NO₃^-）及尿素相较于氨基酸同化效率高。在 NH₄ ⁺ 和 NO₃^-共存体系中，相较于 NH₄ ⁺，NO₃^- 的吸收转化效率较低，因为 NO₃^- 被主动吸收进 ERM 内后，需经硝酸盐还原酶转化为 NH₄ ⁺ 才能被同化利用，消耗更多能量，推测出 NH₄ ⁺ 是 AM 真菌氮源同化的主要形式^[14]。为探究 NH₄ ⁺ 的同化转运机制，本研究组利用同位素标记根内球囊霉（Glomus intraradices） 与毛根农杆菌质粒 DNA 转化的胡萝卜根的双重培养体系，发现 NH₄ ⁺ 被 ERM 吸收后，通过 NADP 依赖的谷氨酸脱氢酶途径或谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合酶途径整合入精氨酸，然后转运至 IRM 中；精氨酸在 IRM 中通过尿素循环及鸟氨酸循环进行分解代谢，释放出 NH₄ ⁺ 和鸟氨酸，NH₄ ⁺ 再通过铵转运蛋白转移给寄主植物根细胞，以供植物生长所需^[15]。

本研究组曾研究发现在农田用复合肥会降低菌根化甜玉米的生长（数据未发表），而且在我国南方土壤条件下缺少 AM 真菌菌根化甜玉米成功试验的数据和结果以及在不同氮素浓度及其他营养因子作用下对 AM 真菌菌根化甜玉米生长及品质的影响，于是希望通过分析 AM 真菌在不同氮磷肥条件下对甜玉米生物量、叶绿素含量、总氮磷含量、糖类、蛋白质及氨基酸等指标的影响，探究促进甜玉米高产高质的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物：甜玉米（Zea Mays L.），由广东省引种服务公司提供。供试菌种：根内球囊霉（Glomus intraradices），由浙江师范大学微生物实验室提供。培养介质：砂∶泥灰为 19∶1 的混合培养基，砂需用自来水反复冲洗干净，后于 1×10⁵ Pa、121℃ 高压灭菌 2 h。培养容器：于 0.01% 高锰酸钾溶液中浸泡 1 h 消毒并予洗净的育苗盆（育苗）和锥形杯（培养）。

1.2 育苗与培养

甜玉米种子预处理：挑选 100 粒甜玉米种子 （颗粒饱满、表皮无破损和虫蛀），用 0.5% H₂O₂ 溶液浸泡 12 h 后，用自来水漂洗干净。育苗盘培养：将甜玉米种子播种在育苗盆中，50 颗种子接种 1 mL AM 真菌（AM 组），另一半则不接种 AM 真菌 （CK 组）。置于光照智能培养箱内培养 7 d，隔天同时间浇定量水。

锥形杯培养：选取育苗盆中长势一致的 AM 组与 CK 组甜玉米幼苗各 30 株，分别以土、砂为培养介质，移栽到锥形杯中。将 2 种介质中的甜玉米苗各分成 5 组，每组 3 株。各组每周分别加 10 mL 不同氮源（浓度为 4 mmol/L）及 10 mL 限氮限磷 Hoagland 营养液，恒温光照培养 4 周后，测定菌根侵染率、生物量及叶绿素含量。

大田培养：甜玉米种子在育苗田里播种育苗 7 d，然后将长势一致的甜玉米苗移入试验田，分成 10 组，每组 12 株，每周加一次 150 mL 限氮限磷 Hoagland 营养液，2 周之后进行 2.1、7.0、14.0 g 硝酸铵钙和 0.5、1.0、2.0 g 磷酸二氢钾及 50、100、 150 g 有机肥的三因素三水平正交试验，对照组施加中水平肥料，待甜玉米穗成熟后收获。收获后测定植株生物量、籽粒氮磷含量、籽粒糖含量、籽粒蛋白质含量及籽粒氨基酸含量等指标。大田正交各组硝酸铵钙、磷酸二氢钾、有机肥施用量分别为： 2.1、0.5、50 g（组别 1），2.1、1、100 g（组别 2）， 2.1、2、150 g（组别 3），7、0.5、100 g（组别 4）， 7、1、150 g（组别 5），7、2、50 g（组别 6），14、 0.5、150 g（组别 7），14、1、50 g（组别 8），14、 2、100 g（组别 9）以及 7、1、100 g（对照无菌， CK 组）。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 菌根侵染率测定

采用曲利苯蓝染色-方格交叉法^[16]，将挑选的甜玉米须根进行透明、软化、酸化、染色、脱色，最后进行镜检，计算出 AM 菌根侵染率。

1.3.2 总氮、总磷、叶绿素、可溶性糖、淀粉含量测定

收获甜玉米后，将甜玉米进行脱粒、真空冷冻干燥、磨粉处理。采用凯氏定氮法测定甜玉米粉的含氮量^[17]；采用钼锑抗比色法测定甜玉米粉的含磷量^[18]；采用叶绿素提取法测定甜玉米苗叶片的叶绿素含量^[19]；采用蒽酮比色法测定甜玉米粉的可溶性糖含量^[20]；采用逐步提取法分步提取出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白^[21]，再采用考马斯亮蓝法测出各蛋白质组分^[17]。

1.3.3 氨基酸含量测定

采用氨基酸自动分析仪测定，由科标技术研发中心（青岛）有限公司完成。

1.4 数据及分析

利用 Excel2010、SPSS 21.0 及 Origin 2017 进行数据分析和作图。部分图表采用 Duncan 多重检验进行均值比较，图表中数值以均值 ± 标准误差体现，统计显著性水平设为 P<0.05，无相同字母表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同氮源及介质对甜玉米的影响

2.1.1 对苗期甜玉米侵染率的影响

在不同氮源及培养介质条件下，AM 真菌均可侵染甜玉米根部形成菌根共生体。试验结果如图1 所示，在相同氮素、不同培养介质培养条件下，砂培组株高均高于土培组，提高了 5.46%～31.14%，说明砂介质对 AM 真菌侵染甜玉米根系的促进效果总体好于土介质。在砂培条件下，硝酸铵钙组菌根侵染率（62.86%）最高，显著高于硝酸钾 （40.22%），与尿素（55.31%）、硫酸铵（60.22%） 及有机肥（56.92%）无显著性差异。相比其他氮源，硝酸铵钙组菌根侵染率提高了 4.39%～56.3%。土培条件下，尿素组菌根侵染率最高（49.95%），与硝酸钾（38.13%）、硫酸铵（42.85%）、硝酸铵钙 （47.93%）和有机肥（48.78%）无显著差异。相比其他氮源，尿素组菌根侵染率提高了 2.41%～30.99%。

注：小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。下同。

2.1.2 对苗期甜玉米株高和生物量的影响

由图2 可知，AM 组株高均高于 CK 组，说明接种 AM 真菌能够提高甜玉米株高。在相同氮素、不同培养介质处理下，砂培苗平均株高比土培苗高 1.46%～10.87%，说明砂培可以促进玉米苗对氮源的吸收利用。砂培条件下，硝酸铵钙组株高显著高于其他氮源，AM 和 CK 组平均株高分别达到 53.6和 51.17 cm。如图3 所示，硝酸铵钙组甜玉米地上部、地下部鲜、干重均高于其他氮源组。但在施加其余 4 种氮源、不同介质的培养条件下，接种 AM 真菌对于甜玉米植株重无明显促进作用，说明硝酸铵钙相比于其他氮源，对甜玉米生物量累积更有利。

2.1.3 对苗期甜玉米叶绿素含量的影响

从表1 可以看出，AM 组总叶绿素含量高于 CK 组，且叶绿素 a 与叶绿素 b 呈相同的增长趋势。在相同氮源、不同介质培养条件下，接种 AM 真菌甜玉米总叶绿素含量较 CK 组能分别提高 2.08%～42.11%（土培）、3.8%～89.74%（砂培），说明接种 AM 真菌能促进甜玉米苗总叶绿素含量累积。在接种 AM 真菌甜玉米中施加不同氮源发现，硝酸铵钙组总叶绿素含量最高，在土、砂培养下分别为 0.93、1.45 mg/g，较其他氮源分别提高 8.14%～89.8%（土培）和 76.83%～163.64%（砂培）。

2.2 不同氮磷肥配比对田间甜玉米的影响

2.2.1 对甜玉米生物量的影响

由图4 可知，相较于 CK 组甜玉米，不同氮磷肥施加量对菌根化甜玉米生物量作用不同，可能促进，也可能抑制。CK 组甜玉米的平均穗重和平均茎叶重分别为 141 和 208.4 g，组别 1、4、9 甜玉米穗重分别为 187.3、167.8、159.9 g，较 CK 组分别提高了 32.84%、19.01%、13.40%，组别 5、7、9 甜玉米茎叶重分别为 241.5.3、249.8、258.1 g，较 CK 组分别提高了 15.88%、19.87% 和 23.85%。而穗重、茎叶重组别 3（110、121.66 g）和 6（123.2、 116.9 g）均低于 CK 组。由极差分析可知，14 g 硝酸铵钙、0.5 g 磷酸二氢钾、100 g 有机肥为提高穗重的最优配比，14 g 硝酸铵钙、1 g 磷酸二氢钾、 50 g 有机肥为提高茎叶重的最优配比。

2.2.2 对甜玉米籽粒总氮、总磷的影响

分析甜玉米籽粒氮、磷含量（表2）发现，组别 6 甜玉米总氮、总磷含量最高，分别为 29.26、 4.76 g/kg，较 CK 组（26.07、4.56 g/kg）分别提高了 12.24%、4.39%。组别 2、4、8 的氮、磷含量均低于 CK 组，说明 AM 真菌对菌根化甜玉米氮、磷含量的促进与施加的氮磷肥用量相关，不同配比肥料用量都会影响 AM 真菌对甜玉米的作用。分析发现 7、14 g 硝酸铵钙分别促进氮、磷含量的吸收；2.1、 14 g 磷酸二氢钾及 50、150 g 有机肥对氮磷含量提升效果差别较小。

2.2.3 对甜玉米籽粒可溶性糖的影响

如图5 所示，施加不同配比氮磷肥，对菌根化甜玉米可溶性糖含量累积的促进作用不同。除组别 3（44.99 mg/g）和 6（32.81 mg/g）外，其余各接菌组的可溶性糖含量均高于 CK 组（46.19 mg/g），尤其是组别 1（67.69 mg/g）、4（138.90 mg/g）、8 （264.83 mg/g）、9（254.55 mg/g），显著高于 CK 组。总体而言，接种 AM 真菌能够促进甜玉米的可溶性糖含量累积。对可溶性糖含量进行极差分析，施用 14 g 硝酸铵钙、1 g 磷酸二氢钾、100 g 有机肥对甜玉米籽粒可溶性糖含量的促进作用最强。

2.2.4 对甜玉米籽粒蛋白质含量的影响

由表3 可知，接种 AM 真菌的甜玉米总蛋白质含量均高于 CK 组（3582.3μg/g），说明接种 AM 真菌对甜玉米蛋白质累积具有促进作用。组别 5 和 9 的总蛋白质含量最高，分别为 8543.8、8190μg/g，较 CK 组分别提高了 138.5%、128.6%。在各蛋白组分中，谷蛋白、醇溶蛋白含量较清蛋白及球蛋白含量高。且醇溶蛋白含量的增加趋势与总蛋白的增加趋势一致。硝酸铵钙施加量对总蛋白含量影响不大，但 14 g 硝酸铵钙能提高球蛋白和谷蛋白含量。总蛋白含量随磷酸二氢钾施加量的增加而增加。施加 2 g 磷酸二氢钾能提升谷蛋白、醇溶蛋白及清蛋白的含量。施加 150 g 有机肥能提升总蛋白、醇蛋白、球蛋白的含量，100 g 有机肥能有效提高谷蛋白与清蛋白的含量。

2.2.5 对甜玉米籽粒氨基酸含量的影响

利用氨基酸自动分析仪法分析 3 组 AM 组甜玉米和 CK 组甜玉米籽粒中 17 种水解氨基酸含量（表4）。组别 6 总氨基酸含量最高（11.55%），包括 7 种必需氨基酸总量（3.50%），均高于 CK 组（10.71%、3.26%）、组 4（8.14%、2.42%） 和 8（9.92%、3.15%）。组 4 和 8 的氨基酸含量均低于 CK 组，可能是施用的氮磷肥用量不利于菌根化甜玉米的氨基酸累积。甜玉米各氨基酸组分中，谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸含量较高，蛋氨酸、异亮氨酸、组氨酸含量较低。通过对氨基酸含量进行分析，发现 7 g 硝酸铵钙、2 g 磷酸二氢钾和 100 g 有机肥有利于氨基酸含量的累积。

3 讨论

3.1 不同氮源及培养介质对甜玉米苗的影响

AM 真菌侵染植物根系形成菌根，通过观测菌根侵染情况可以大致了解 AM 真菌在植物根内的生长状况。通过甜玉米根系侵染率测定发现，砂培比土培更有利于 AM 真菌侵染寄主，可能是因为低营养环境有利于 AM 真菌侵染寄主植物，此推论与 Pan 等^[11]的结论相符。外加氮源促进 AM 真菌侵染寄主植株，可能是因为 AM 真菌孢子发芽吸收氮源，用于氨基酸的从头生物合成，以促进 AM 真菌的共生生长^[22]。不同氮源对 AM 真菌侵染的促进效果也大为不同，硝酸铵钙、硫酸铵及尿素的促进作用均高于硝酸钾，可能是 NH₄ ⁺、尿素的吸收利用效率高于 NO₃^-。

通过分析甜玉米植株的生物量和叶绿素含量，可以大致了解植株生长状况。不同介质、相同氮源条件下，砂培苗株高及叶绿素含量均高于土培条件，分别提高 1.46%～10.87%、11.50%～56.03% （除硫酸铵），说明砂培条件下有利于菌根化甜玉米对氮素的吸收利用，这可能是在低磷（甚至无磷）环境下，可以促进 AM 真菌菌根效应，从而增强菌根化植株氮吸收^[23]。根据砂培能够促进 AM 真菌侵染寄主以及叶绿素含量提高，可以初步建立一种菌根化甜玉米育苗体系：将甜玉米种子于砂中进行育种并与 AM 真菌建立共生体系，待生长 2 周后，连同培养基质一同移植到生长田中生长。

比较各甜玉米组的指标可知，对硝酸铵钙和硫酸铵等无机氮肥的吸收效果较有机肥和尿素等有机氮肥要好，与金海如等^[14]的研究结果一致。当硝酸铵钙作为氮源时，甜玉米菌根侵染率提高了 4.39%～56.30%，地上部和地下部鲜重均最高，总叶绿素含量分别提高了 8.14%～89.80%（土培）和 76.83%～163.64%（砂培），说明相较于单一无机氮源和有机氮源，硝酸铵盐更有利于甜玉米生长，可能是相比于单一的 NO₃^-或 NH₄ ⁺，NO₃^-和 NH₄ ⁺ 耦合更能有效促进菌根化甜玉米对氮的吸收利用，该推测还需进一步探究。

3.2 不同氮磷肥配比对大田甜玉米的影响

通过苗期试验发现，硝酸铵钙作为外加氮源能够促进 AM 真菌侵染甜玉米根系，并提高甜玉米生物量和叶绿素含量，故将其运用于大田试验中。大田试验旨在寻求一种合适的氮磷肥配比，在减少肥料用量的同时，以最大效果的协同 AM 真菌促进寄主甜玉米的产量以及营养价值的提升。

本试验发现，在菌根化甜玉米上施加不同比例氮磷肥，对菌根化甜玉米生物量及总氮、总磷量的影响也各不相同。组别 1 是低氮低磷施加组，该组的生物量及氮磷含量却高于 CK 组和部分中高水平氮磷肥试验组，推测是在氮、磷等矿质元素含量较低的情况下，AM 真菌更能发挥其菌根作用，利用高度分支的根外菌丝网络，协助甜玉米吸收其根系无法到达区域土壤中的养分和水分，以促进甜玉米的生长发育^[24-25]。此外，已有试验验证了在高磷条件下，AM 真菌生长和代谢活性受到抑制，可能降低菌根效应，从而减少对氮的吸收^[26]。

甜玉米乳熟期籽粒中富含果糖、蔗糖等可溶性糖，而可溶性糖含量是衡量甜玉米甜度的重要指标，直接影响其口感。菌根化甜玉米可溶性糖含量总体上较正常甜玉米有促进作用。对甜玉米籽粒中可溶性糖含量进行分析发现，施加 14 g 硝酸铵钙更有利于甜玉米的可溶性糖的累积，2.1、 14 g 则差别不大，推测本试验硝酸铵钙的 3 水平分布还是太小，未到达拐点，该推测还需进一步试验探究。

对各试验组甜玉米籽粒中蛋白质组分进行检测，发现谷蛋白和醇溶蛋白含量在总蛋白含量中占比较大，这与张海艳等^[27]的结论一致。清蛋白和球蛋白等结构蛋白在籽粒生长过程中，先大量累积，然后减少，主要用于籽粒生长膨大；而谷蛋白和醇溶蛋白等贮藏蛋白正好相反，在籽粒生长后期迅速累积存储^[28]。此外，菌根化甜玉米中蛋白质含量均高于正常甜玉米，说明接种 AM 真菌能够更好地吸收外源氮源，进而促进甜玉米籽粒蛋白质的累积。氨基酸是蛋白质合成的基本单位，本文选取 3 组菌根化甜玉米和正常甜玉米籽粒进行氨基酸含量的测定分析，发现干籽粒中的谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量较高，异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸含量较低，与林红^[29]的研究结果基本一致。与未接种 AM 真菌的甜玉米相比较，菌根化甜玉米籽粒中异亮氨酸、亮氨酸的比值增加，提高了 5.29%～7.09%，有利于缓解异亮氨酸、亮氨酸及缬氨酸的拮抗作用，增强氨基酸的平衡性^[30]。甜玉米籽粒中组别 6 的总氨基酸含量和必需氨基酸含量均高于 CK 组，而组别 4 和 8 则低于 CK 组，说明 AM 真菌需要协同合适比例的氮磷肥才能促进甜玉米氨基酸的贮存。

4 结论

本试验通过在不同培养介质种植甜玉米，并外在施加不同氮源，以探究能促进甜玉米生长的最佳培养介质和氮源。结果发现砂比土更有利于 AM 真菌侵染甜玉米根系，硝酸铵钙能够促进 AM 真菌侵染甜玉米根系，并提高甜玉米植株的生物量和叶绿素含量。通过大田正交试验，测量甜玉米的生物量、可溶性糖含量、蛋白质含量以及氨基酸含量来探究促进大田甜玉米高产高质的最佳氮磷肥配比。14 g 硝酸铵钙能够促进甜玉米生物量、总氮含量、总磷含量、可溶性糖含量以及球蛋白和清蛋白含量的累积；施加 1 g 磷酸二氢钾有利于甜玉米植株茎叶重、总氮磷含量以及可溶性糖含量的增加；施加 100 g 有机肥有利于甜玉米植株穗重、总氮磷含量、可溶性糖含量、谷蛋白含量、清蛋白含量以及氨基酸含量的增加。故确定 14 g 硝酸铵钙、1 g 磷酸二氢钾、100 g 有机肥有助于甜玉米生物量、可溶性糖含量、蛋白质含量以及氨基酸含量的增加。本试验通过调控土壤中氮素、磷素含量，推测 AM 真菌协同的最佳氮磷肥配比，为初步探究促进菌根化甜玉米高产高质的实际应用做了基础工作。

参考文献