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作者简介:

张静(1993-),博士研究生,主要从事规模养殖抗生素与抗性基因污染防治。E-mail:zj0507@issas.ac.cn。

通讯作者:

王兴祥,E-mail:xxwang@issas.ac.cn。

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目录contents

    摘要

    为了提高抗生素降解菌在堆肥中的降解效率及降低菌株可能引起的抗性基因(ARGs)传播风险,从畜禽粪便好氧堆肥条跺筛选出一株嗜温环丙沙星降解菌株 WXX-3,通过模拟堆肥试验探究菌株对环丙沙星的降解效果及 ARGs 丰度的影响。将菌株以 0.05% 的接种量加入猪粪,在 20 ~ 30 ℃下扩繁 8 d,之后加入木屑等调理剂堆肥 30 d,环丙沙星的总去除率可达 82.9%,比不加菌处理高 27.6 个百分点。堆肥高温同时抑制了菌体 WXX-3 的生长,堆肥结束后,未检测出菌体的存在。氟喹诺酮类 ARGs 及 intI1 的丰度出现不同程度的消减,其中 mexAqnrA 的消减率均达 100%, qepAacrB-01intI1 的消减率分别达 17.9%、43.8% 和 71.7%,明显高于不加菌处理。以上结果表明该菌株可以有效去除环丙沙星,配套的堆肥措施可以发挥该菌株的降解潜力及降低 ARGs 污染的风险。

    Abstract

    To enhance the efficiency of antibiotics-degrading bacteria and reduce the risk of the spread of antibiotics resistance genes(ARGs)that may be caused by strains during the composting process,a mesophilic ciprofloxacin-degrading strain WXX-3 was screened from the aerobic composting strips,and a simulated composting experiment was conducted to explore the effects of strain WXX-3 on the ciprofloxacin degradation and ARGs abundance.The strain was added to pig manure at 0.05% of the inoculum,piled up 8 days for its propagation at 20 ~ 30 ℃,and then some conditioner such as wood chips was added to compose for 30 days as conventional compost,the removal rate of ciprofloxacin reached 82.9%,which was 27.6 percentage points higher than the treatment without WXX-3.The high temperature of compost inhibited the growth of WXX3,after composting,the WXX-3 was not detected.During the composting,the abundance of fluoroquinolone resistance genes and intI1 genes were reduced to different degrees,mexA and qnrA were removed completely,and the contents of qepAacrB-0 and intI1 were removed 17.9%,43.8% and 71.7%,respectively,which significantly higher than the treatment without WXX-3.The above results indicated that the strain WXX-3 can effectively remove ciprofloxacin,and the supporting composting measures can exert the degradation potential of this strain and reduce the risk of ARGs contamination

  • 近年来,抗生素及抗性基因(ARGs)污染风险越来越受到关注。到 2030 年,全球畜禽养殖业中抗生素的消耗将达到 10 万 t[1]。然而大部分抗生素很难被动物吸收,约 30%~90% 的抗生素会随着动物粪便和尿液排出体外[2]。调查发现抗生素在动物粪便[3-4]、废水[5]、粪肥[6-7]和土壤[7-9]中均有检出,且浓度可达 mg/kg 级水平。抗生素的残留也会导致环境中抗性细菌和 ARGs 的富集及传播[10-11],加剧生态环境的压力和人体健康的风险。

  • 堆肥是实现畜禽粪便无害化和资源化处理的主要手段之一,可有效去除四环素类、磺胺类和大环内酯类抗生素[12-14],然而却较难去除环丙沙星和氧氟沙星等氟喹诺酮类抗生素[1315]。微生物降解是去除抗生素的一种环境友好且有效的方式[16-17]。研究报道白腐真菌、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)、嗜热菌株(Thermus sp.) 和Paraclostridium sp. 等微生物可降解转化环丙沙星[18-21]。例如,在以鸡粪为原料的堆肥中,外源添加耐高温的产黄纤维单胞菌可去除 66.1%~79.0% 的环丙沙星[22]。然而抗生素降解菌株一般携带 ARGs,存在一定的耐药性,应用抗生素降解菌可能带来 ARGs 扩散的风险[23-25]。而嗜常温的抗生素降解菌难以适应堆肥的高温期,可在堆肥的高温阶段灭活[25-26]。因此,本研究考虑筛选一株嗜常温的氟喹诺酮类抗生素降解菌,利用菌株生物降解效应降解抗生素,之后利用堆肥高温杀灭菌株,防止 ARGs 的扩散。

  • 本研究基于传统微生物培养技术,以环丙沙星为例,从畜禽粪便堆体中筛选嗜常温的高效降解菌株,并通过形态学观察、生理生化试验、分子生物学鉴定以及溶血性反应评价,探究菌株在堆肥过程中适宜的添加时间,以及对环丙沙星和 ARGs 在堆肥中残留的影响,为畜禽粪便堆肥安全利用提供技术支撑。

  • 1 材料与方法

  • 1.1 菌株富集、分离和纯化

  • 无机盐培养基:K2HPO4 5.8 g,KH2PO4 4.5 g,(NH42SO4 2.0 g,MgCl2 0.16 g,CaCl2 0.02 g, Na2MoO4·2H2O 0.0024 g,KNO3 0.0012 g,FeCl3 0.0018 g,MnCl2·2H2O 0.0015 g,加超纯水至 1 L。

  • 分离培养基:每升无机盐培养基添加 20 g 琼脂粉。

  • LB 液体培养基:胰蛋白胨 10.0 g,酵母提取物 5.0 g,氯化钠 10.0 g,加超纯水至 1 L。

  • LB 固体培养基:每升 LB 液体培养基添加 20 g 琼脂粉。

  • 取 5 g 左右堆肥样品(江西正合生态农业有限公司的有机肥条跺)加入含有 5 mg/L 环丙沙星的无机盐培养基中,放入恒温摇床中(30℃,180 r/min)避光培养 7 d。培养物静置后,将上清液转接至含有 10 mg/L 环丙沙星的无机盐培养基中,避光培养 7 d 后将上清液再次转接至含有 20 mg/L 环丙沙星的无机盐培养基中培养 7 d。取 0.2 mL 培养物涂布于含有 20 mg/L 环丙沙星的分离培养基上,恒温培养 48 h。挑取单个菌落接种于含有 20 mg/L 环丙沙星的无机盐培养基试管中,恒温培养 7 d 后,通过分析不同菌液中环丙沙星的降解率,从中挑选出一株降解能力强的菌株,命名为 WXX-3。

  • 1.2 菌株的温度适应性

  • 设置 6 个温度梯度,分别为 20、30、40、50、60 和 70℃,每个处理 3 次重复。将活化到对数期的菌株按 1%(v/v)接种量加入 LB 液体培养基中,培养 24 h 后取样,在波长 600 nm 下测定吸光度值(OD600)。

  • 1.3 菌株的鉴定

  • 形态学观察:菌株 WXX-3 在 LB 固体培养基上培养 24 h,观察菌株的颜色、形状、大小、透明度等。

  • 生理生化试验:利用 VITEK2 GN 革兰氏阴性细菌鉴定卡自动鉴定菌株生理生化特征。

  • 分子生物学鉴定(16S rRNA):采用基因组 DNA 提取试剂盒(北京擎科生物科技有限公司, TSP201-200)提取菌株 WXX-3 的总 DNA。之后用 16S rDNA 通用引物 27F/1492R 进行 PCR 扩增。扩增体系为上游引物 1 µL,下游引物 1 µL,DNA 模板 1 µL,金牌 mix 27 µL,共计 30 µL,反应程序为 98℃预变性 3 min,98℃变性 10 s,55℃退火 10 s,72℃延伸 10 s,35 个循环,最后将 PCR 扩增后片段进行 16S rDNA 测序。

  • 1.4 菌株的溶血反应评价

  • 将活化至对数期的菌株 WXX-3 加入血基琼脂培养皿中培养 72 h,同时设定阴性对照菌为英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua),阳性对照菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),根据是否产生溶血环判定菌株的溶血性。

  • 1.5 菌株 WXX-3 对环丙沙星的降解特征

  • 首先将菌株在 LB 液体培养基中活化 12 h,然后将活化到对数期的菌液按照 1%(v/v)接种量再次转接到新鲜的 LB 液体培养基中,扩大培养 24 h 后,菌体数量达 2×109 CFU/mL,在 6000 r/min 下离心 10 min,去除上清液,用等体积无菌水重悬 2 次后用于后续试验。

  • 在液体培养基条件下设置 2 个处理:1)CFC:含有 20 mg/L 环丙沙星的 LB 液体培养基;2)CFC+ WXX-3:菌体按 1% 接种量接种至含有 20 mg/L 环丙沙星的 LB 液体培养基。将反应瓶用锡箔纸包上以避光,置于 30℃、180 r/min 的恒温培养箱中培养,分别在 0、2、4、6、8、10 和 14 d 取样,用于测定环丙沙星的浓度。

  • 1.6 堆肥及菌株 WXX-3 计数

  • 根据菌株 WXX-3 在液体培养基中降解环丙沙星的特征,开展室内模拟堆肥试验。原料的基本理化性质(干基)见表1。试验设置 3 个处理:(1)T1:将 0.5‰(L/kg)的无菌水加入猪粪原料中,室温 (20~30℃)下放置 8 d,之后猪粪与木屑按 3∶1 的质量比混合堆肥 30 d;(2)T2:将 0.5‰(L/kg) 的 WXX-3 菌液加入猪粪原料中,室温(20~30℃) 下放置 8 d,之后按 T1 处理堆肥;(3)T3:将 0.5‰ (L/kg)的 WXX-3 菌液加入猪粪原料中,直接加入木屑后堆肥 30 d。堆肥在恒温培养箱中进行,程序设定为 0~5 d 逐步升温至 60℃,6~19 d 保持高温 60℃,20~30 d 逐步降温至 30℃。分别取 T1 和 T2 处理扩繁 0 和 8 d,加木屑后堆肥第 0 和 30 d 的样品,以及 T3 处理堆肥第 0 和 30 d 的样品,用于测定环丙沙星及相关 ARGs。

  • 表1 堆肥原料基本性质

  • 同时统计堆肥中菌落 WXX-3 的数目,利用稀释涂布平板计数法,将各处理样品依次稀释为 101、 102、103、104、105 和 106,然后分别吸取 104、105 和 106 的稀释液中 0.1 mL 悬液滴入含有 20 mg/L 环丙沙星的 LB 固体培养基中,用三角形无菌玻璃棒涂布均匀。之后将平板倒置于 30℃恒温培养箱中培养,待菌落稳定时读取菌落数目并记录结果。

  • 1.7 环丙沙星的测定

  • 液体培养基样品测定:待测菌液离心过滤掉菌体,将上清液过 0.45 µm 滤膜,然后用 HLB 固体萃取柱富集,保留的分析物用含 0.1% 甲酸的甲醇溶液洗脱,最后浓缩至 1 mL 上机测定。

  • 模拟堆肥样品测定:称取冷冻干燥后的样品 0.2500 g,然后使用萃取溶剂[乙腈-EDTA-SPB: Mg(NO32-NH3.H2O,v/v,3∶1]振荡和超声,萃取液用 HLB 固体萃取柱富集,采用上述相同方法洗脱和浓缩。利用液相色谱-质谱(AB SCIEX 5 500 TripleQuad LC-MS/MS,Singapore)定量检测分析环丙沙星的浓度[6]

  • 1.8 抗性基因的测定

  • 堆肥中 ARGs 的测定:准确称取堆肥原料和堆肥 30 d 后的样品各 0.10 g,用 FastDNA Spin Kit for faeces(MP Biomedicals)提取样品 DNA,详细操作步骤参考试剂盒说明书。提取的 DNA 采用荧光定量 PCR 方法对文献中经常报道的 22 种氟喹诺酮类ARGs 以及 intI1 进行检测[927],引物信息如表2 所示,检测仪器为 StepOnePlusTM实时荧光定量 PCR (Thermo)。qPCR 反应体系为 TB Green 嵌合荧光染料 5 µL,上游引物 0.4 µL,下游引物 0.4 µL,ROX 参比染料 0.2 µL,DNA 模板 1 µL,无菌水 3 µL,共计 10 µL。反应条件为:95℃预变性 30 s,95℃变性 10 s,60℃退火 30 s,60℃延伸 30 s,40 个循环。

  • 菌株中 ARGs 的测定:利用上述提取的菌株 WXX-3 总 DNA,测定 22 种氟喹诺酮类 ARGs 和 intI1,方法与堆肥 ARGs 测定一致。

  • 表2 ARGs 引物信息

  • 1.9 数据分析

  • 利用 SPSS 18.0 对不同处理组数据进行单因素方差分析,差异显著性采用 Duncan 法检验(α= 0.05);利用 Excel2016 对数据进行整理和作图;利用 MEGA 对菌株 WXX-3 测序结果进行 16S rDNA 序列比对和系统发育树分析。

  • 2 结果与分析

  • 2.1 菌株鉴定结果和温度适应性

  • 菌株 WXX-3 的菌落呈浅黄色,表面湿润,不透明,边缘整齐(图1A);光学显微镜下菌体呈杆状,大小为 0.4~0.6 µm×0.8~2.4 µm,单个或成对排列,革兰氏染色阴性(图1B);菌株的溶血反应阴性(图1C),未出现溶血环。如图1D 所示,菌株不耐高温,适宜生长温度为 20~40℃,温度超过 50℃可使菌株灭活。菌株 WXX-3 生理生化鉴定如表3 所示,结果显示菌株与古老糖、蔗糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-塔格糖、D-海藻糖、甘氨酸芳胺酶、ELLMAN 试剂、L-吡咯烷基芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、侧金盏花醇和 D-山梨醇反应呈阳性。经 16S rRNA 基因测序及 Genbank 中公布序列比对,菌株 WXX-3 与模式菌株 Brucella pseudintermedium ADV31(T)DQ365921 相似性为 99.85%,分子系统发育分类学上属于布鲁氏菌,生物危害程度为四类。菌株 WXX-3 现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为 CGMCC No.22259。

  • 图1 菌株 WXX-3 鉴定结果和温度适应性 A 菌株宏观形态特征;B 菌株微观形态特征;C 溶血性检验;D 菌株在不同温度下的 OD600

  • 注:图1C 中 1 为阴性对照菌:英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua);2 为阳性对照菌:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);3 为样品:菌株 WXX-3。图1D 中柱上不同小写字母表示不同处理下的显著性差异(P<0. 05)。

  • 表3 菌株 WXX-3 生理生化特征

  • 注:“+”表示阳性;“-”表示阴性。

  • 2.2 菌株 WXX-3 对环丙沙星的降解特征

  • 在液体 LB 培养基中,菌株 WXX-3 对环丙沙星的降解如图2 所示。与不加菌处理(CFC)相比,添加菌株处理(CFC+WXX-3)可以明显降低液体中的环丙沙星;菌株 WXX-3 对环丙沙星的降解主要发生在前 8 d,之后环丙沙星的浓度基本不变;第 8 d 时,环丙沙星的浓度降低至 11.3 mg/L,降解率达 43.2%;不加菌处理的环丙沙星的浓度基本维持在 19.5 mg/L。

  • 图2 菌株 WXX-3 对环丙沙星的降解

  • 注:图柱上字母不同表示差异显著(P<0.05)。

  • 2.3 堆体中环丙沙星的降解特征

  • 根据菌株在液体培养基中对环丙沙星的降解主要发生在前 8 d,确定菌株可在堆肥前 8 d 加入进行扩繁。在模拟堆肥试验中,环丙沙星的浓度及去除率如表4 所示。菌株扩繁阶段(0~8 d),T2 处理中环丙沙星的浓度从 19.2 mg/kg 降低至 14.6 mg/kg,去除率为 23.7%。堆肥结束时,T2 处理环丙沙星的浓度降至 2.7 mg/kg,环丙沙星的总去除率达 82.9%,比 T1 处理高 27.6 个百分点,比 T3 处理高 11.9 个百分点。T3 处理环丙沙星的浓度降至 5.2 mg/kg,环丙沙星的去除率比 T1 处理高 15.7 个百分点。同时监测堆肥过程中菌株的存活数量, T2 处理中,菌株在猪粪中扩繁 8 d 后有效活菌浓度达 5.0×108 CFU/g,菌体数量显著提高;堆肥 5 d 后,菌体数量达 3.5×109 CFU/g;堆肥结束后,平板涂布未出现菌落,菌株消亡。T3 处理中,将菌株直接加入堆体,5 d 后平板涂布显示菌体数量仅为 3.3×107 CFU/g,菌体数量明显低于 T2 处理。

  • 表4 不同堆肥处理组中环丙沙星的浓度及去除率

  • 注:同列中标有不同字母表示差异显著(P<0.05);环丙沙星的总去除率(%)=(猪粪初始浓度 × 猪粪重量-堆肥后浓度 × 猪粪及木屑总重量)/(猪粪初始浓度 × 猪粪重量)×100。

  • 2.4 堆体中抗性基因的去除效果

  • 如表5 所示,堆体及菌株 WXX-3 同时存在的 ARGs 主要包含 qepAacrB-01mexAqnrAintI1。在堆肥中 qepAintI1 的丰度较高,其绝对丰度分别达 1.5×1010~2.2×1010 和 1.2×109~5.1×109 copies/g,另外 3 种 ARGs 的绝对丰度较低。堆肥结束后,各处理消除了mexAqnrA的污染,qepAacrB-01intI1 的消减率在 T2 处理中最高,分别为 17.9%、 43.8% 和 71.7%;在 T3 处理中消减率次之,分别为 27.5%、37.8% 和 52.0%;在 T1 处理中消减率最低,分别为 2.6%、19.6% 和 58.7%。堆肥结束后,T2 和 T3 处理中 ARGs 的总丰度显著低于 T1 处理,说明菌株 WXX-3 应用于堆肥降低了 ARGs 的污染风险。

  • 表5 堆体中不同抗性基因的绝对丰度

  • 注:“#”表示未检出。

  • 3 讨论

  • 筛选得到的菌株 WXX-3 可以有效降低液体培养基中的环丙沙星,这可能与菌株分泌的酶或所携带的酶生物降解有关[17]。有报道 Thermus sp. C419 可以合成粉酶、漆酶和锰过氧化氢酶等,进而通过 N-乙酰化降解和修饰氟喹诺酮类抗生素基团[2028];白腐真菌产生的锰过氧化氢酶也可参与氟喹诺酮类抗生素的降解[29]。菌株 WXX-3 对于环丙沙星的降解主要发生在前 8 d,与潘兰佳等[30]报道的恩诺沙星的降解主要发生在菌株生长的前 7 d 结果类似。抗生素在液体培养基中的降解停滞,一方面可能由于基质中碳、氮等养分物质被消耗,菌株的生长受阻;另一方面可能由于抗生素浓度降低,菌株对抗生素产生一定的耐受性[1031]。菌株 WXX-3 对环丙沙星的降解在第 8 d 时达 43.2%,高于苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)JOB 在无机盐液体培养基对环丙沙星的降解(30%)[19],这可能是因为使用的培养基不同,研究也表明存在葡萄糖和乙酸钠等菌株较容易利用的物质时,抗生素的降解更快[20]。然而菌株 WXX-3 对于环丙沙星的降解途径及降解产物的安全性需要进一步研究。

  • 堆肥处理中环丙沙星在菌株 WXX-3 扩繁阶段的去除率低于液体培养条件下的去除率,这可能是因为菌株在堆肥条件下适应较慢[25],也可能因为存在其他易降解的生物质与抗生素的降解发生竞争作用[17]。将菌株 WXX-3 直接在堆肥初始阶段加入,T3 处理比不加菌处理高 15.7 个百分点,菌株 WXX-3 可能在堆肥升温期(0~5 d)发挥一定作用。但是由于堆肥温度一般在 5 d 左右会达到 55℃[32],高温将限制嗜温菌株 WXX-3 的生长,因此将菌株 WXX-3 提前加入猪粪中扩繁 8 d 有利于功能菌群在其扩繁阶段发挥生物降解作用[33],同时利用堆肥高温杀灭菌株,防止 ARGs 的扩散。

  • 进一步分析堆肥处理中 ARGs 丰度的变化,本试验发现堆肥中 qepAintI1 的丰度较高。Cheng 等[34]也发现 qepA基因在猪粪堆肥中的丰度较高,且由于 qepA 基因位于质粒内部的 intI1[35]intI1 的存在会导致其水平基因转移的风险增加。堆肥结束后,ARGs 的绝对丰度降低,一方面由于堆肥中添加 WXX-3 生物菌剂,环丙沙星的浓度降低,则抗生素的选择性压力降低,进而 ARGs 的丰度降低[634];另一方面,堆肥高温可以杀死如 Clostridium_sensu_stricto_1 等氟喹诺酮类 ARGs 潜在的宿主微生物[36],削减了堆体中 ARGs 的总丰度。因此,通过筛选嗜常温抗生素降解菌,配合相应的堆肥技术在降低抗生素和 ARGs 的风险方面具有一定的应用前景。

  • 4 结论

  • 从畜禽粪便堆体中筛选得到一株嗜温的环丙沙星降解菌 WXX-3,菌株适宜的生长温度为 20~40℃,菌株经鉴定确定为布鲁氏菌,属于革兰氏阴性细菌。

  • 菌株 WXX-3 加入液体培养基中,在室温下加速了环丙沙星的去除,8 d 时去除率达 43.2%。

  • 菌株 WXX-3 加入猪粪中常温下扩繁 8 d,之后加入木屑等堆肥 30 d。堆肥显著提高了环丙沙星的去除率,同时消除了 mexAqnrA 的污染,且提高了 qepAacrB-01intI1 的消减率。菌株应用到堆肥中可以降低抗生素和 ARGs 的风险,具有一定应用前景。

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