间作模式是我国传统农业的精髓，由于其可以提高土地生产力^[1-2]和养分资源高效利用^[3-4]，强化农田生态系统服务功能^[5]，因此在全世界广泛应用。禾本科与豆科作物的间作模式，尤其是系统互惠被学者们广泛关注^[5-6]。花生是我国主要油料作物之一，近年来种植面积不断扩大^[7]。辽宁省作为我国花生主产区，发展更为迅猛，据统计，2014 年全省花生种植面积已经突破 40×10⁴ hm²，其中位于科尔沁沙地南缘的阜新市花生种植面积从 2006 年的 4.0×10⁴ hm² 猛增到 2014 年的 18.1×10⁴ hm²，成为了全国第三大花生种植市^[8]。但随着花生种植面积的扩大，也导致了单一花生清种引起的地表风蚀等诸多环境问题。针对这一生产中亟待解决的问题，辽宁省农业科学院从 21 世纪初就开展了农田生物多样性利用的相关研究工作，主要的间作模式有玉米-花生间作和谷子-花生间作等模式^[9-11]。前人关于禾本科-豆科间作系统的产量优势及其机理的研究主要集中在地上部光资源和地下部水分利用等方面。土壤微生物是生态系统的重要组成部分，是地上生物多样性和生产力的重要驱动力，作物根际土壤微生物全程参与了土壤养分的转化、迁移、固定和作物吸收等过程，对地上作物生长发育及土地生产力均有重要影响^[12-13]。因此，间作体系可通过作物地下根际土壤微生物群落结构与功能的改变直接影响作物地上产量。前人研究发现，间作能通过不同种类的作物根系互作改善土壤微生态环境，促进六大碳源土壤微生物代谢活动，改变土壤微生物功能多样性，合理的间作能改变土壤微生物群落结构与功能多样性，对土壤微生态环境的稳定具有一定贡献^[14-15]。地上作物-地下微生物的耦合点是根系、土壤和微生物三者间交互区域^[12]，即作物的根际，发挥根系-土壤-微生物协同增效、对地上部生产力提高至关重要。因此，探索不同间作模式对根际土壤微生物碳源利用和微生物群落特征是了解地下-地上协同调控的关键。目前研究中虽然对禾本科豆科与间作体系产量优势在机理上取得了一定程度进展，但多侧重间作体系对水分、光照和养分资源的高效利用方面^[16-17]，而针对半干旱区禾本科与豆科作物间作系统，根系互作对禾本科与豆科间作体系根际微生物碳源利用特征尚不清楚。另有研究表明，根系分隔法（水分、养分以及根系互作）可用于区分间作作物地上部分与地下部分对系统互惠以及作物生物量和产量的贡献大小，可以作为研究间作模式下作物竞争与互惠机理的有效方法^[18-20]。因此，本研究以典型的禾本科作物谷子与豆科作物花生间作体系为研究对象，采用田间试验研究不同模式配置对产量优势的贡献，并进一步通过盆栽模拟不同根系互作模式，对地下部根际微生物碳源利用特征等方面进行系统研究，探讨土壤微生物群落的变化和碳源利用对间作种植模式的响应，阐释禾本科作物与豆科作物间作优势的机理，为构建合理的禾本科和豆科根系互作生产模式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

田间试验于 2017～2018 年在农业部（2018 年 3 月农业部更名为农业农村部）阜新农业环境与耕地保育科学观测实验站（辽宁省阜新市彰武县西六乡）进行，试验区属于半干旱区，年平均降水量 504 mm。田间试验设置为 4 种种植模式，（1）谷子单作；（2）花生单作；（3）谷子-花生 4∶2 间作；（4）谷子-花生2∶2间作。小区面积为48 m² （6 m×8 m），每个处理 3 个重复。谷子和花生种植密度分别为每公顷 38 万株和 20 万株，雨养农业，施肥方式与当地常规施肥一致（N、P、K 均为 100 kg/hm² ）。2017 年谷子与花生于 5 月 26 日播种，9 月 16 日收获；2018 年谷子与花生于 6 月 5 日播种，9 月 18 日收获。本研究的谷子采用辽宁省农业科学院品种样谷 18，豆科作物花生品种为小白沙 1016。

室内模拟盆栽试验采用根系分隔的方法^[10，20]，供试土壤采自农业部（2018 年 3 月农业部更名为农业农村部）阜新农业环境与耕地保育科学观测实验站，土壤过 2 mm 筛装盆，盆栽直径 30 cm，高 32 cm，每盆土壤重量为 15 kg，为保证作物整个生育期生长所需求的养分，按照以下养分含量将养分元素营养液添加入土壤，土壤 P 含量 100 mg/kg，土壤 K 含量 100 mg/kg，其他元素含量分别为 Mg50 g/kg，Fe50 g/kg，Cu、Zn、 Mn 和 Mo 各 5 g/kg。盆栽试验设计依据根系互作研究方法，设置 3 种分隔方式：（1）谷子（SBM）-花生 （SBP）完全分隔（单作：无水分、养分和根系互作）；（2）谷子（MBM）-花生（MBP）0.037 mm 尼龙网隔 （部分间作：无根系互作，但水分和养分可通过）；（3）谷子-花生间作无隔（NBMP）（间作：水分、养分和根系互作）。谷子与花生品种与田间试验相同。

1.2 作物产量及土地当量比

作物产量测定：在成熟期，选取中间条带 2 行作物（谷子-花生）进行测产（每个小区 16 延长米）。每小区分别选取果穗均匀植株 5 株进行含水量等参数指标测定。洗净的植株各器官于烘箱 105℃杀青 1 h 后，烘干至恒重，称量植株干重，籽粒产量折算为 14% 含水量。

土地当量比（LER）=（禾本科作物间作产量 / 单作产量）+（豆科作物间作产量 / 单作产量）。若 LER 大于 1，则表明土地生产力增加^[2，5]。

1.3 根际土壤微生物群落 Biolog-ECO 分析

于植株收获期取根际土壤样品，采用灭菌后的轻薄刀片沿盆栽边缘将其与土壤分离，倒扣盆栽取出所有土壤，轻轻抖落距离根系较远的、与根系结合比较松散的土壤后，采用灭菌后的镊子刮取附着于作物根系上的薄层土壤（根际土壤），混匀按照四分法取样后用无菌采样袋封存包好，带回实验室过筛，除去杂物后，进行土壤微生物测定。

本研究参照周泉等^[20]和高文翠等^[21]的方法进行根际土壤微生物群落分析，采用 BIOLOG 微平板法研究土壤微生物功能多样性。试验步骤：（1） 称取 10 g 鲜土，加入 90 mL 生理盐水[0.85% （w/v） NaCl]，120 r/min 振荡 30 min；（2）静置 2 min，取 5 mL 上清液，加入 45 mL 生理盐水[0.85%（w/v） NaCl]；（3）依此再稀释 2 次，制得 1∶1000 的提取液；（4） 向 Biolog-ECO 微平板各孔加入 150 μL 提取液，28℃静置培养；（5）每隔 24 h 测每孔在 595 nm 处的吸光值，连续培养 216 h。

1.4 数据处理及分析

本文采用 Biolog-ECO 微平板法测定土壤微生物代谢功能多样性^[22]，每孔颜色平均变化率（AWCD） 表示土壤微生物对碳源的利用率。 AWCD=[∑（C-R）]/N，其中 C 是所测定的 31 个碳源孔的吸光值，R 为对照孔的吸光值，N 为碳源的数目。采用 Shannon 多样性指数，Simpson 优势度指数、均匀度指数和群落丰富度指数来表征土壤微生物群落多样性。

采用 Excel2007 进行相关数据整理，利用 SPSS 25.0 及 SAS（8.2）进行相关数据的统计与分析。使用 PASW STASTISTICS 18.0 对各土样的 Shannon 指数和 Simpson 指数分别进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 根系互作对谷子与花生干物质积累的影响

2 年田间试验结果（表1）显示，谷子-花生 4∶2 和 2∶2 两种间作模式下 LER 均大于 1，其中 2∶2 间作模式产量优势更加显著，LER 值在 2018 年达到 1.36。与单作模式相比，4∶2 和 2∶2 间作模式谷子产量分别增加了 29.7%～40.3% 和 63.6%～85.0%，这表明 2∶2 间作模式下谷子的产量优势更加明显。间作花生在 2017 年减产 41.0%～44.7%，但 2018 年两种间作模式的花生与单作花生均无显著差别。这表明间作模式下谷子和花生产量虽然表现出年度差异，但具有稳定的产量优势。间作对禾本科作物谷子生物量积累的影响作用高于对豆科作物花生的影响，谷子与花生体系的产量优势贡献主要来自于禾本科作物谷子。通过混合线性模型分析，其中设定种植模式为固定因子，年份为随机因子，Ⅲ类固定效应检验结果显示 P<0.05，固定效应变量种植模式对谷子和花生产量均具有统计学意义；协方差估算值结果表明，年份对作物产量无显著影响（谷子 P=0.485；花生 P=0.492）。

盆栽结果表明，间作模式下根系完全互作显著提高了谷子和花生的地上部和地下部的干物质积累以及收获指数（图1）。与完全分隔的无互作相比，根系部分互作和完全互作谷子地上部生物量分别增加了 12.3% 和 59.4%，谷子籽粒产量分别增加了 49.0% 和 92.6%；花生植株地上部生物量分别增加了 16.6% 和 40.7%，花生籽粒产量则增加了 11.1% 和 44.6%。与无根系互作的完全分隔处理相比，作物根冠比略有提高，但花生根冠比未达到显著水平，根系部分互作和完全互作处理的谷子与花生的收获指数均显著增加。

2.2 谷子与花生间作土壤微生物碳源利用分析

AWCD 值是评价土壤微生物对不同碳源底物利用能力的重要指标之一，可反映土壤微生物群落代谢特征，AWCD 值越高，则代表微生物对碳源利用能力越强^[14]。室内盆栽试验结果表明，不同根系互作模式下随培育时间的延长，土壤微生物群落利用碳源能力均呈现上升趋势，前 3 d AWCD 值变化速率即斜率最大，表明微生物代谢最为活跃，随后几天速度降低，微生物代谢逐渐趋于减缓 （图2）。间作谷子花生和网隔花生处理的土壤根际微生物对碳源利用显著高于相应单作处理，单作谷子处理的根系微生物对碳源利用显著低于其他根系互作处理以及单作花生处理。与完全分隔无根系互作相比，根系互作促进了根际微生物碳源利用效率，谷子与花生根际微生物对 31 种碳源平均利用率分别增加了 19.6% 和 72.2%（图3）。本研究结果显示，根系互作有利于提高土壤微生物代谢活性，增强了间作体系作物对微生物对碳源的利用，可能对于间作体系的作物增产起到了一定作用。

注：同列不同字母表示差异显著（小写字母表示谷子，大写字母表示花生）（P<0.05）。

注：同组不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

根据 ECO 微平板中 31 种碳源的化学性质，将其分为六大类，包括氨基酸类、胺类、多聚物类、酚酸类、羧酸类、糖类。各土壤中微生物对不同类别碳源的利用率结果（表2，图3）显示，间作土壤与单作土壤间存在显著差异，单作花生处理的土壤微生物对各类碳源的利用率显著低于其他处理土壤微生物（图3）。在六大类碳源中，除花生单作外，对氨基酸和糖类的利用率均最高，而单作花生利用率最高的为多聚物类，各处理土壤微生物对酚酸类碳源利用率均最低。部分间作处理中谷子和花生分别有 7 种和 22 种单一碳源高于相应单作（表2），而无分隔的完全间作体系中谷子和花生有 18 种和 26 种碳源高于相应的单作，这表明根系互作促进了间作体系谷子与花生对根际土壤碳源微生物的高效利用，进而可能对间作体系作物产量优势具有一定贡献。

各土壤样品中微生物对 ECO 微平板所包括的 31 种碳源主成分分析研究结果（图4）表明，大多数碳源都与主成分 1 呈正相关（图4A），其中正相关系数最高的是 1-磷酸葡萄糖和 L-精氨酸，而与主成分 1 负相关系数最高的两个碳源是α-环式糊精和丙酮酸甲酯。网隔花生和间作的土壤微生物对土壤的利用率与主成分 1 的正相关系数最高，而单作花生与主成分 1 的正相关系数最低（图4B）。间作与网隔花生的距离较近，单作谷子与网隔谷子的距离较近，而单作花生处理与其他处理距离均较远，间作土壤微生物对不同碳源的利用与网隔花生较为接近，单作谷子土壤微生物对不同碳源的利用与网隔谷子较为接近，表明无隔间作土壤与网隔花生土壤对碳源利用率较高，而单作花生土壤对碳源利用率较低。聚类分析的结果更进一步证实了这一点 （图5），间作与网隔花生归为一类，网隔谷子与单作谷子归为一类，而单作花生单独成类。

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。

注：A 图为不同碳源利用率差异的分布，B 图为不同土壤对碳源利用率差异的分布。

2.3 不同根系互作模式下谷子与花生根系土壤微生物群落功能多样性指数

土壤微生物群落的多样性指数可以通过 Shannon 指数和 Simpson 指数等指标来表征^[20，22]。与单作相比，间作模式下根系完全互作显著增加了 Shannon 指数，谷子与花生间作模式分别比其相应单作模式增加了 27.6% 和 20.7%（表3）。Simpson 指数、均匀度指数和丰富度指数间作谷子比单作谷子分别增加了 2.79%、5.19% 和 8.04%，间作花生比单作花生分别增加了 4.25%、3.21% 和 14.6%，但均未达到显著水平。

主成分分析中的载荷因子可反映碳源利用的差异，绝对值越大则表明影响越大，起主要分异作用。第一主成分 PC1 载荷绝对值 >0.5 的有 16 种碳源（表4），其中糖类 8 种，氨基酸类 3 种，胺类 1 种，酚酸类 1 种，多聚物类 1 种，羧酸类 2 种。第二主成分 PC2 载荷因子绝对值 >0.5 的有 14 种碳源，其中糖类 3 种，氨基酸类 3 种，胺类 2 种，酚酸类 1 种，多聚物类 2 种，羧酸类 3 种。分析表明，糖类和氨基酸类是区分单作与间作模式的敏感碳源。

注：同列不同字母表示差异显著（P<0.05）。

3 讨论

3.1 间作体系根系互作促进系统产量优势

在农田生态系统中，不同地区大量研究业已表明，作物多样性利用例如禾本科作物与豆科作物间作模式通过间作作物产量增加来提高体系生产力^[23-24]。本研究通过两年田间试验结果表明，禾本科谷子与花生间作体系具有稳定的产量优势，2018 年产量优势（LER 为 1.18～1.36）比 2017 年（LER 为 1.12～1.22）更加明显。这与 Feng 等^[8]研究一致，该研究表明谷子-花生间作系统 LER 达到 1.17～1.18，显著提高了土地利用效率。有研究将禾本科与豆科间作互惠体系分为 3 种类型^[5]：第 1 种是间作的两种作物产量都得到提高，例如玉米-蚕豆间作体系^[16]；第 2 种是一种作物产量提高，而另一种作物产量无显著影响，例如小麦-豌豆体系以及小麦-蚕豆体系^[5]；第 3 种是一种作物产量提高，而伴随另一种作物减产，但 LER 大于 1，例如玉米-花生体系^[11，25]和玉米-大豆体系^[26]。本研究田间试验结果表明，在常规年份谷子-花生间作体系属于第 3 种类型，与前人研究的玉米-花生和玉米-大豆间作体系相似。但 2018 年间作花生并未减产，这可能是由于 2018 年单作花生病害发生严重（数据未列出）导致单作花生严重减产，而间作有效缓解了花生病害发生率及发生的严重程度，因而 2018 年比 2017 年表现出更明显的间作体系产量优势。

3.2 间作体系根系互作促进土壤微生物群落碳源利用

Biolog-ECO 微平板中孔的 AWCD 值是反映作物根系土壤微生物群落代谢功能多样性的一个重要指标^[20，27]，可以评价不同模式下作物根系微生物群落对碳源利用能力。本研究结果表明，间作谷子花生处理土壤根际微生物对碳源利用高于相应单作处理，不同种植模式下土壤微生物对单一碳源利用存在相似性和差异性。本研究结果显示，与单作相比，间作模式改变了作物土壤微生物群落对碳源的利用顺序，间作对糖类和氨基酸类利用率最高，而单作花生则对聚合物类代谢呈现出偏好。许建晶^[14]发现小麦-苜蓿间作提高了土壤微生物对六大碳源的利用强度，增加了土壤微生物群落稳定性，糖类、羧酸类和氨基酸类是土壤微生物利用的主要碳源。与单作小麦相比，小麦与菘蓝间作种植可提高土壤微生物代谢活性，间作处理的 AWCD 值比单作小麦增加 26%～29%，土壤微生物对碳源的利用能力增强^[28]。这与其他研究者研究一致，桑树和苜蓿间作体系根系土壤 AWCD 值显著高于相应的单作^[13，29]，前人研究表明，间作体系中作物根际土壤微生物代谢活性提高了 28.6%^[30]和 32.3%^[15]，这与本研究结果一致。本研究中根系互作后谷子与花生根际微生物对 31 种碳源平均利用率增加了 19.6% 和 72.2%，间作作物土壤微生物代谢活性显著增强，土壤根际微生物群落生境得到改善^[31]，这加强了地上-地下协同作用^[12]，谷子与花生地上部干物质积累增加，因此根系互作通过促进间作作物对微生物各类碳源的高效利用进而强化了间作体系产量优势。

与单作相比，间作体系 2 种作物根系在土层中分布不同导致了土壤中不同作物根系分泌物具有差异。有研究认为间作模式增加了作物根系分泌物的种类，可为根际微生物生长繁殖提供能源，从而影响根际微生物数量和群落结果的变化^[30]。根系微生物的群落种群特征是由根系分泌物启动和调节的，因此间作改变了作物根际土壤微生物群落结构，与间作体系作物根系分泌物密切相关。另有研究者认为作物根系分泌物和根际沉积物为微生物提供了大量碳源^[32]，以确保作物与微生物交互作用，并能显著改变土壤微生物群落结构，促进特定土壤微生物功能群结构发生变化。李庆凯等^[33]报道指出玉米-花生间作体系中，玉米根系分泌物对连作花生土壤的酚酸类物质具有显著影响，一定程度上改善了间作体系土壤微生态环境。本研究表明，禾本科作物谷子与豆科作物花生间作体系土壤微生物碳源利用效率均显著提高，可能是谷子花生体系中根系分泌物对根系互作促进间作体系养分高效吸收起了关键作用^[16]，间作作物的根系互作有利于提高土壤微生物代谢活性，增强作物对微生物对碳源的利用，进而促进了地上-地下协同作用，对间作体系地上部产量优势具有一定贡献。

本研究对主成分分析和聚类分析结果表明，间作与网隔花生归为一类，网隔谷子与单作谷子归为一类，而单作花生单独成类。这表明不同种植模式下土壤微生物群落结果存在差异，从而表现出不同的碳源代谢特征。有研究者认为不同处理在主成分空间位置上的分布与微生物碳源代谢利用能力是相关联的^[34]。由此推断本研究中不同种植模式下谷子与花生利用根际微生物特征不同。主成分分析结果显示，对于花生来说，间作花生与网隔花生距离近，与单作花生距离很远，这表明间作和网隔部分互作对间作作物利用根际土壤微生物碳源无显著差别，而与单作花生却截然不同。对于谷子来说，单作谷子与网隔谷子距离较近，这表明部分间作和单作模式无显著差别，间作模式对谷子利用根际微生物显著高于根系半互作和单作模式。根系部分间作是水分养分可以通过，但是无根系接触，可定义为根际效应；无分隔的间作是兼有空间效应和根际效应^[35-36]。本研究结果表明，谷子-花生间作体系中，谷子在根际土壤微生物碳源利用方面收到的空间效应影响更大，而对于花生则是以根际效应为主。这与玉米和花生体系类似^[35]，间作的根际效应比空间效应更显著一致。

功能多样性指数是综合反映群落功能的指标，不同功能多样性指数可以反映土壤微生物群落组成的不同方面，因而群落功能多样性指数可以反映土壤微生物群落的功能多样性。间作土壤细菌群落的 Shannon 指数研究显示，间作土壤的微生物群落更趋于多样化。这与董艳等^[15]研究一致，该研究表明小麦-蚕豆间作比单作体系显著提高了 Shannon 指数和丰富度指数。间作土壤 Simpson 指数略高表明间作土壤微生物群落结构更趋于平均分布，间作种植可提高土壤微生物群落的丰富性，为作物增产提供保障。许振羽等^[29]也发现间作体系 Simpson 指数高于单作。这表明间作土壤微生物群落结构多样性增加，均匀度提高。许建晶等^[28]对小麦-菘蓝间作系统研究表明，土壤微生物群落多样性指数和丰富度指数均显著高于单作小麦。有学者认为，间作栽培模式下不同作物地下种间互作可以改变土壤微生物的组成与功能多样性^[22，30]，间作模式下微生物活性较高的原因可能是不同作物产生特异性根系分泌物^[33]，并产生与之相适应的微生物群落区系，从而提高间作体系土壤微生物功能性，促进土壤微生物群落结果与功能多样化。因此，本研究中禾本科作物谷子与豆科作物花生间作模式下根系交错互作，两种作物的根系分泌物相互影响，从而改变了间作体系的土壤微生态环境，进而影响了间作作物根际的微生物群落结构。

综上，与单作模式相比，谷子与花生间作体系通过根系互作影响了微生物活性、微生物群落分别及作物对根际土壤养分资源的利用，进而影响土壤生态系统的健康稳定功能及作物地上产量。禾本科作物与豆科作物的根际互惠作用及其机理不仅对根系相互作用提高养分利用率具有重要意义，而且生物多样性对提高生态系统生产力和稳定性具有重要的实践意义。

4 结论

谷子-花生间作体系具有稳定的产量优势，根系互作显著促进了间作体系中禾本科作物和豆科作物籽粒产量增加，对禾本科作物的促进效果高于豆科作物。间作体系作物对 6 种碳源利用显著高于相应的单作体系，间作作物土壤微生物群落多样性发生改变，Shannon 指数和 Simpson 指数研究结果显示，根系互作增加了间作土壤根系微生物群落多样性和均匀度。根系互作促进了禾本科作物谷子与豆科作物花生对土壤微生物碳源利用效率，对于间作作物产量优势具有潜在贡献。土壤微生物与植物根系之间有密切的相互作用，本研究通过深入了解间作种植对土壤微生物群落结构的影响，将有助于进一步了解间作增产的机制。

参考文献