畜禽养殖业在为人类提供肉蛋奶的同时，也产生大量的畜禽粪污。据统计，中国养殖业每年约产生 38 亿 t 粪污。一方面，畜禽粪污含有大量的营养物质，还田后能提高土壤养分含量，改善土壤的理化性状，提高作物产量和改善作物品质^[1]；另一方面，畜禽粪污含有大量的病原微生物，若不经处理直接还田将会造成土壤环境污染，可能引发人畜共患疾病^[2]。在畜禽粪污处理利用过程中，最难处理的则为畜禽污水或沼液。因此，不同国家和组织对还田前的畜禽污水或沼液中病原微生物的种类和数量提出了不同的限量要求。目前，针对畜禽污水或沼液中的病原微生物关注较多的是粪大肠杆菌 （Escherichia coli）的数量。其中，意大利对畜禽污水中粪大肠杆菌数量的限制最严格（10³ cfu/L），其次为韩国（2000 cfu/L），法国最为宽松（10⁵ cfu/L），而中国、WHO、葡萄牙和西班牙对粪大肠杆菌数量的限定值均为 10⁴ cfu/L^[3-4]。即使畜禽污水还田前经过无害化处理，但处理后的污水或沼液中仍含有一定量的病原微生物。这些畜禽污水或沼液还田后，粪大肠杆菌在不同土壤环境中仍发生数量上的增减变化，可能导致农田生产系统发生生态风险。因此，研究粪大肠杆菌与土壤环境因素的动态变化规律对畜禽粪污“零污染”还田具有重要的现实意义。

酸碱度是影响土壤粪大肠杆菌生存的一个重要土壤因素，关于土壤酸碱度对粪大肠杆菌存活的影响存在不同的观点。Xing 等^[5]认为粪大肠杆菌的存活时间随 pH 值的升高而显著延长，杨天杰等^[6] 则发现在 pH 值为 4 与 6 的环境中粪大肠杆菌生物量无显著差异而 pH 为 9 处理下粪大肠杆菌的灭活效果最好，李慧儒^[7]则认为粪大肠杆菌在弱酸性、中性、弱碱性中的存活时间相差不大。诸多研究表明，土壤酸碱度是通过影响土壤碳、氮水平等土壤理化性质对粪大肠杆菌存活产生间接影响，但相似的研究同样存在不同的研究结果^[8-13]。目前，有关酸碱度对土壤粪大肠杆菌存活的直接影响和通过酸碱度变化导致土壤理化性质改变所产生的间接影响机理的研究鲜有报道。为此，本研究基于酸碱度变化条件下的土壤理化性质与粪大肠杆菌数量消长的协同变化机理探究，以期为畜禽污水或沼液还田利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验起始于 2020 年 11 月 5 号，于 2021 年 1 月 30 号结束，试验地点为中国农业大学烟台研究院生物质能科学与技术研究中心。试验所用沼液为山东省烟台市牟平区某沼气工程的猪粪沼液，试验所用土壤为棕壤。供试沼液和土壤的主要化学性质如表1 所示。

1.2 试验设计

试验采用土柱培养法，所用培养容器为 PVC 管，高度为 25 cm、内径为 7.5 cm。试验共设 3 个处理，分别为 pH 5、pH 7、pH 9，每个处理重复 3 次。土壤 pH 的调节采用 0.1 mol/L H₂SO₄ 溶液和 NaOH 溶液。调试后的土壤经风干、研磨、过 2 mm 筛后装入柱子，每柱装土 1000 g，随后每柱加入沼液 140 g，用无菌水调节含水量至田间持水量的 60%，柱子上下端用耐高温封口膜封闭，置于 37℃恒温培养箱进行培养。

1.3 样品采集与检测

土壤采集采用内径为 2 cm、高度为 25 cm 的圆柱形取样器，分别于土壤培养后的第 1、2、4、8、 15、30、45、60 d，从土柱表面中心位置垂直插入土柱 20 cm，采集土壤并混合均匀；于培养后第 60 d，分别采集土壤深度为 0～1、4～5、9～10、 14～15 和 19～20 cm 的土壤并混合均匀，所采土壤样品经风干后、贮存于棕色瓶，用于样品分析。土壤中粪大肠杆菌的测定采用平板计数法，将土壤与带玻璃珠的无菌水按照质量比 1∶10 混合并充分振荡制成 10 倍稀释液，然后再将 10 倍稀释液梯度稀释并接种于伊红美蓝培养基，置于 37℃无菌培养箱中培养，24 h 后取出并选择阳性菌落计算数量^[14]；土壤铵态氮和硝态氮含量的测定分别采用蒸馏后直接滴定法和紫外分光光度法^[15]；土壤有机质含量的测定采用重铬酸钾外加热法^[16]。

1.4 数据分析

采用 Excel 2016 和 SPSS 26 进行数据的整理和分析，采用最小显著差异法（LSD）分析差异显著性，采用基于径向基函数（RBF）的神经网络模型分析土壤理化性质指标对粪大肠杆菌存活的重要性。

2 结果与分析

2.1 土壤酸碱度对粪大肠杆菌的影响

如图1a 所示，沼液施用后土壤中粪大肠杆菌数量为 3.20×10⁵ cfu/kg，随培养时间的延长所有处理粪大肠杆菌数量均呈现先升后降的趋势，并在培养后的第 8 d 达到峰值。其中，土壤 pH 7 处理的粪大肠杆菌数量显著高于 pH 5 和 pH 9 处理 （P<0.05），分别是其 1.38 和 1.83 倍。在培养 60 d 后所有处理的粪大肠杆菌数量均降至 10⁵ 数量级以下，以 pH 7 处理数量最高，分别比 pH 5 和 pH 9 处理增加了 10.06% 和 48.85%。

从土壤深度看，培养 60 d 后 pH 7 和 pH 9 处理粪大肠杆菌数量随土壤深度的增加呈先减后增的趋势，均于 15 cm 处出现最小值，其粪大肠杆菌数量分别是 0 cm 处的 85.15% 和 63.89%。与 pH 7 和 pH 9 处理不同，培养 60 d 后 pH 5 处理粪大肠杆菌数量随土壤深度的增加呈先增后减的趋势并在 15 cm 处达到峰值，其粪大肠杆菌数量是 0 cm 处的 1.22 倍 （图1 b）。

2.2 土壤酸碱度对土壤硝态氮的影响

图2a 表明，随培养时间延长不同处理土壤硝态氮含量均呈上升趋势，当培养至第 60 d 时不同处理之间硝态氮含量具有显著性差异（P<0.05），其中土壤 pH 值为 9 的土壤硝态氮含量最高，分别比 pH 5 和 pH 7 处理升高了 32.12% 和 16.71%。如图2b 所示，从土壤深度看，土壤 pH 分别为 5、7、 9 处理的土壤硝态氮含量均随深度增加呈先增后减的趋势，并在 15 cm 处达到最大值，其含量分别是 0 cm 处的 1.30、1.37 和 1.42 倍。

注：不同字母表示处理之间具有显著性差异（P<0.05），下同。

2.3 土壤酸碱度对土壤铵态氮的影响

如图3a 所示，不同处理土壤铵态氮含量均呈现下降趋势，培养 60 d 后不同处理之间铵态氮含量具有显著性差异（P<0.05），其中以 pH 5 处理铵态氮含量最高，分别是 pH 为 7 和 pH 为 9 处理的 1.22 和 1.68 倍。从土壤深度看，培养 60 d 后土壤 pH 值分别为 5、7、9 处理的土壤铵态氮随土壤深度的增加均呈增加趋势，并在 20 cm 处达到最大值，其含量分别比 0 cm 处增加了 17.23%、11.98% 和 26.29%（图3b）。

2.4 土壤酸碱度对土壤有机质的影响

如图4a 所示，随培养时间的延长不同处理土壤有机质含量均呈下降趋势，当培养 60 d 后不同处理之间差异显著（P<0.05），其中以当土壤 pH 7 处理时有机质含量最低，分别比 pH 5 处理和 pH 9 处理降低了 6.44% 和 10.46%。从土壤深度看（图4b），培养 60 d 后土壤 pH 分别为 5、7、9 处理土壤有机质含量随深度增加均呈下降趋势，其含量在 20 cm 处分别是 0 cm 处的 88.94%、96.73% 和 89.73%。

2.5 土壤理化性质对粪大肠杆菌数量的重要性

图5 和表2 分别比较分析了当培养至第 60 d 时，土壤理化性质对土壤中粪大肠杆菌的重要性以及与粪大肠杆菌数量的皮尔逊相关性。结果表明，土壤硝态氮对土壤中粪大肠杆菌数量的重要性最高（100.00%），且与粪大肠杆菌数量成极显著负相关 （P<0.01）；其次为土壤有机质（95.10%），与粪大肠杆菌数量成极显著负相关（P<0.01）；土壤铵态氮对粪大肠杆菌的重要性最低（75.96%），对粪大肠杆菌数量无显著影响（P>0.05）。

注：** 表示土壤理化性质指标与粪大肠杆菌数量成极显著相关 （P<0.01）。

3 讨论

从培养时间看，pH 7（中性土壤）处理最有利于粪大肠杆菌的生存，在 pH 5（酸性土壤）和 pH 9 （碱性土壤）处理中粪大肠杆菌存活均受到抑制，且当 pH 9 时抑制作用更强。这可能是由于在酸性条件下矿物表面的正电荷增加，增强了对细菌的吸附作用导致粪大肠杆菌的失活，碱性土壤的高负电荷则破坏了粪大肠杆菌的细胞壁^[17-18]。相较碱性土壤，粪大肠杆菌具备了在酸胁迫下一定程度的保护和修复机制，这是在土壤 pH 5处理中粪大肠杆菌数量显著高于土壤 pH 9 处理的主要原因^[19]。

土壤酸碱度的变化影响土壤氮素的转化过程。酸性条件抑制了土壤氨氧化作用，而碱性条件提高了土壤净硝化速率，因此在土壤培养过程中随 pH 的升高铵态氮含量逐渐降低而硝态氮含量逐渐升高^[20-21]。同时，土壤中氨氮挥发、硝化作用和矿化作用也是导致培养过程中土壤铵态氮含量逐渐降低而硝态氮含量逐渐升高的另一原因^[22-23]。由于粪大肠杆菌能够利用铵态氮作为营养物质，过量的硝态氮则对粪大肠杆菌产生毒害作用，导致 pH 9 处理中粪大肠杆菌数量最低，而过低的硝态氮又影响粪大肠杆菌的呼吸作用，同样抑制了粪大肠杆菌的存活，使 pH 5 处理中粪大肠杆菌数量低于 pH 7 处理^[7，24-25]。

微生物的代谢作用可导致土壤有机质含量不同程度的降低^[26]。由于 pH 5 和 pH 9 处理中细菌的代谢作用受到抑制，土壤有机质降解速率降低，导致其土壤有机质含量高于 pH 7 处理土壤^[27-28]。与 pH 5 处理相比，pH 9 处理土壤有机质含量更高，这可能是因为在 pH 9 处理土壤中沼液的施入导致土壤微生物的分泌系统以及糖酵解等代谢途径因生物炭的吸附作用而减弱，降低了有机质的消耗^[29]。前人研究认为，土壤有机质对粪大肠杆菌生长具有积极的促进作用^[17]，这与本文研究结果不同。本研究表明，pH 9 处理土壤有机质含量更高，但粪大肠杆菌数量最低，这可能是由于在碱性条件下土壤有机质中活性成分含量较低，从而抑制了粪大肠杆菌的存活。

研究结果表明，培养 60 d 后，土壤硝态氮对粪大肠杆菌存活的重要性最高，其次为有机质，铵态氮重要性最低，且分别与粪大肠杆菌数量呈极显著负相关（P<0.01）、极显著负相关（P<0.01）和正相关（P>0.05）（图5 和表2）。这主要是因为硝态氮对碱性、中性以及酸性土壤中粪大肠杆菌的生长分别产生直接的抑制和促进作用，土壤有机质由于促进了其他微生物的生长，导致与粪大肠杆菌对其他营养物质的竞争加剧，减缓了粪大肠杆菌数量的增加，而铵态氮作为粪大肠杆菌的营养物质由于挥发作用导致影响作用不显著^[30]。

从土壤深度看，当培养至第 60 d 时 pH 为 5、 7、9 处理土壤中粪大肠杆菌随深度增加分别呈现先增后减、先减后增和先减后增的趋势，均在 15 cm 处出现拐点。这符合土壤中硝态氮变化趋势，表明了硝态氮对粪大肠杆菌生长的抑制和促进作用。

4 结论

沼液施入土壤后，所有处理土壤中粪大肠杆菌数量随培养时间的延长均呈先增后减的趋势，且在培养第 8 d 达到峰值，并于培养 60 d 后降至 105 数量级；随土壤深度增加 pH 为 5、7、9 处理粪大肠杆菌数量分别呈现先增后减、先减后增和先减后增的趋势，均在 15 cm 处出现拐点。中性土壤最有利于粪大肠杆菌生存，碱性土壤的抑制作用则最强，土壤硝态氮对粪大肠杆菌的重要性最高，其次为土壤有机质，土壤铵态氮的重要性最低。

参考文献