中国是世界上最大的食用菌生产国，自 2013 年起产量已超 3000 万 t，占世界总产量的 70% 以上^[1-4]。黑龙江省食用菌生产规模占全国的 2/3， 2019 年牡丹江市黑木耳栽培规模 21.6 亿袋（2021 年 23 亿袋），黑木耳菌渣产量达 86.4 万 t，其中还未包括历年内未消化菌渣。2021 年黑龙江省食用菌栽培规模达到 63 亿袋，黑木耳产量居全国之首，年产废弃菌渣量达到 200 多万 t，到 2025 年将达到 75 亿袋，总产量（鲜品）400 万 t^[5-7]，废弃菌渣产量会更高。随着生产规模的不断扩大，大量菌渣的随意抛弃严重污染着农业生态环境，因此，寻找高效、科学、合理的菌渣处理方式变得尤为迫切。食用菌菌渣又称菌糠、菇渣、下脚料等，是食用菌栽培过程中收获产品后剩下的培养基废料，含有丰富的菌体蛋白、有机质、多种酶等活性物质，是一种优质的有机肥源^[8]，菌渣作为肥料或基质使用是最简单、最有效的方法，不仅可以解决其造成的面源污染，而且可以促进区域耕地土壤质量有效提升和实现土壤资源可持续利用^[1-2]。国内外关于废弃菌渣成肥的研究很多，主要是采用传统堆肥或沤肥的方式进行有机废弃物的腐熟再还田使用^[9-12]，大部分研究仍集中于传统堆肥工艺的研究范畴，而针对食用菌菌渣特性及轻简化成肥的研究较少，对废弃菌渣中有益微生物群体的定向利用更少，严重限制了菌渣资源的高效化利用。

针对黑龙江省食用菌产区废弃菌渣产量大、难以高效利用、污染环境等问题，通过理化性质分析探究不同处理方式对菌渣养分特性的影响；采用高通量测序的方法^[13-16]，明确不同处理方式对菌渣中微生物多样性的改变；通过生物信息学分析手段进行环境因子与群落数据的关联分析，阐明利用轻简式无害化技术处理菌渣的可行性，为尽早实现菌渣高效无害化处理与轻简化还田奠定基础，有效促进黑龙江省黑土耕地地力保护政策更好实施。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

试验于 2020—2021 年在黑龙江省农业科学院牡丹江分院土肥试验园区（129°28′E，44°20′N）进行，土壤类型为暗棕壤。该地区属中纬度温带大陆性季风气候区，海拔高度 267.9 m，年均气温 5.9℃左右，无霜期 130 d 左右，年均降水量 500～600 mm^[17]。

供试食用菌（黑木耳）菌渣来自于牡丹江市爱民区丰收屯黑木耳菌栽培基地，基本理化性质：含水量 60%，有机质 58.35%、pH 7.46、全氮 1.835%、全磷 0.438%、全钾 0.406%、有机碳 33.84%、C/N 18.44；牛粪取自牡丹江市西安区楼房村养牛场，有机质 34.55%、pH 8.54、全氮 1.049%、全磷 0.225%、全钾 1.041%、有机碳 20.04%、C/N 19.10，传统堆肥物料中菌渣和牛粪比例为 8∶2。

1.2 试验设计

试验设置 3 种准备状态菌渣为 3 个处理，即自然状态下的废弃菌渣（M1）、经传统堆肥的菌渣 （M2）、轻简化处理的菌渣（M3）。具体制备方法如下：M1 是黑木耳菌袋（主要组分是木屑 86.5%，麸皮 10%，豆粉或玉米粉 1.5%，石灰 1%，石膏 1% 等。）子实体采摘后的废弃菌袋经去皮后自然堆放，无任何人为翻堆等干扰；M2 是将 80%M1 原料、 20% 牛粪与发酵剂 1 kg/t 均匀搅拌，经传统堆肥发酵 60 d 制取，期间高温阶段翻堆 5 次，水分补给 4 次；M3 是 M1 经轻简化处理工艺处理后制取，具体操作方法是将 M1 经机械粉碎丝化后添加增效处理剂（营养）搅拌均匀，经机械挤压颗粒化（挤压强度 15～20 MPa 及温度 70～80℃），再经过复合益生菌菌化后，焖至 15 d 制取。对 3 种状态菌渣的微生物多样性进行分析，同时比较 3 种状态菌渣的种子发芽指数（GI）及 pH、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质等化学指标。

1.3 测定分析

1.3.1 微生物多样性分析

1.3.1.1 样本收集

在食用菌菌渣试验基地采集废弃自然状态菌渣、已堆肥后的菌渣及轻简化处理菌渣，每种状态菌渣均采用 5 点取样法，采集堆体深度 5.0～15.0 cm 层次菌渣，将同一状态 5 点取样的菌渣样本等量混匀作为 1 个样品；将采集好的菌渣样品置于冰上运输至实验室，经液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存或采用干冰寄送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.3.1.2 高通量微生物测定微生物多样性

PCR 扩增按指定测序区域，合成带有 barcode 的特异引物。细菌 16S 测序端引物序列：ACTCCTACGGGAGGACGCAG，细菌 16S 非测序端引物序列： GGACTACHVGGGTWTCTAAT。真菌 ITS 测序端序列：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，真菌 ITS 非测序端序列：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。扩增与测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.3.2 物料化学指标分析

主要测定样品的碱解氮、有效磷、速效钾、有机质、pH。有机质采用重铬酸钾容量法-外加热法测定；pH 采用电位法测定；有效磷采用钼锑抗比色法测定^[18]；速效钾采用醋酸铵浸提，火焰光度法测定；碱解氮采用碱解扩散法测定。

1.3.3 种子发芽指数的测定

准确称取新鲜样品 5 g，按物料、水的比值为 1∶10 进行混匀，用玻璃棒搅拌 10 min，静置 1 h 后过滤。在干净无菌的培养皿中铺 2 层滤纸，用吸管吸取 5 mL 滤液加入培养皿中，将 20 粒小油菜种子均匀放置在滤纸上，黑暗条件下 25℃培养 48 h 后，重复 3 次，测定种子发芽率和根长（用游标卡尺测定种子根长），以蒸馏水或去离子水作对照^[19-20]。

GI=（处理平均发芽率 × 处理平均根长）／（对照平均发芽率 × 对照平均根长）×100%

1.4 数据处理与统计分析

采用 Excel 2007 进行数据处理^[21]，SPSS 19.0 进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理菌渣种子发芽指数及化学指标比较

对不同状态的菌渣样品 M1、M2 及 M3 样品进行 GI 及化学指标分析。由表1 可以看出，M2 总养分含量及速效养分含量相对最高，总氮、总磷、总钾、碱解氮、有效磷含量分别为1.79%、0.49%、0.67%、1.82 g/kg 和 0.34 g/kg，是 M1 的 1.30、3.77、9.57、2.12、1.03 倍，但有机质、速效钾分别降低了 18.52%、12.5%。 M3 总氮、总磷、总钾、碱解氮、有效磷、速效钾分别为 2.10%、0.11%、0.15%、0.85 g/kg、0.29 g/kg、0.72 g/kg，其中总氮、总钾分别是 M1 的 1.52、2.14 倍，总磷、速效养分及有机质略低。有机质及总有机碳含量呈现 M1>M3>M2（P<0.05），C/N 以 M1 最大，M2 pH 较 M1 增加了 5.26%。GI 呈现 M2>M3>M1，M2、M3 物料的 GI 分别经堆肥和轻简化处理后显著增高，达到 98.66%、95.54%，较堆肥前分别增加了 50.97%、 46.19%（P<0.05，表1），完全达到无害化效果。

注：同列数据字母不同表示各处理间差异显著（P<0.05）。

2.2 基因测序深度

采用对测序序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表 OTU 的数目构建曲线，即稀释性曲线。当曲线趋于平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量对发现新 OTU 的边际贡献很小；反之则表明继续测序还可能产生较多新的 OTU。由图1 可看出，各处理细菌、真菌的稀释曲线末端趋于平缓，表明测序基本饱和，取样合理，能够较为真实地体现样品的微生物群落结构组成。

2.3 不同处理方式菌渣样品微生物多样性分析

2.3.1 不同处理方式菌渣细菌属水平主要物种丰度比较

根据所有样本 16S rRNA 在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前 30 位的属进行比较 （图2）。由图2 可以看出，M1 中的细菌主要有沙雷菌属 Serratia（46.96%）、类芽孢杆菌属 Paenibacillus （29.8%）、假单孢菌属 Pseudomonas（13.1%）、芽孢杆菌属 Bacillus（8.0%）4 种菌属相对丰度较高，占 M1 细菌种类的 98.17% 以上。M2 在属水平上有 17 种类组分占 0.82%～5.60%，主要有类芽孢杆菌属 Paenibacillus、假单孢菌属 Pseudomonas、芽孢杆菌属 Bacillus 3 个菌属。还含有节细菌属 Arthrobacter、黄杆菌属 Flavobacterium、Galbitalea、Paenisporosarcina、地杆菌属 Pedobacter、戴沃斯菌属 Devosia、假黄色单孢菌属 Pseudoxanthomonas、Filomicrobium、链霉菌属 Streptomyces、细杆菌属 Microbacterium、Luteitalea、热多孢菌属 Thermopolyspora、球孢囊菌属 Sphaerisporangium、短波单孢菌属 Brevundimonas、Thermostaphylospora 等菌属。M3 菌属主要有类芽孢杆菌属Paenibacillus、假单孢菌属 Pseudomonas、芽孢杆菌属 Bacillus、节细菌属 Arthrobacter norank_ f_Vicinamibacteraceae、norank_ f_norank_o_Vicinamibacterales、Galbitalea、鞘氨醇单孢菌属 Sphingomonas、RB41、戴沃斯菌属 Devosia、Rubrobacter、链霉菌属 Streptomyces、微小杆菌属 Microvirga、芽球菌属 Blastococcus、Gaiella、红色杆属菌属 Rubrobacter、小月菌属 Microlunatus、细杆菌属 Microbacterium 等。

2.3.2 不同处理方式菌渣真菌属水平主要物种丰度比较

在属分类学水平上统计各样本的物种丰度，由图3 结果可以看出，M1 样品在属水平上前 5 位含量从高到低依次是木霉属 Trichoderma（99.51%）、未分类（0.32%）、抗农业致病真菌活性的真菌 Tausonia（0.05%）、unclassified-o-Helotiales（0.03%）、Mortierella（0.02%）。M2 样品在属水平上前 5位含量从高到低依次是沃德霉属 Wardomyces（58.62%）、木霉属 Trichoderma（23%）、踝节菌属 Talaromyces （6.59%）、青霉菌属 Penicillium（2.67%）和曲霉属真菌 Aspergillus（2.16%）等为主。M3 样品在属水平上真菌含量从高到低依次是 Tausonia（29.67%）、抗农业致病真菌活性的真菌 Pleosporales（9.57%）、假单孢菌属 Pseudomonas（9.10%）、真菌属 Fungus （7.25%）、被孢霉属 Mortierella（6.85%）、镰刀菌属 Fusarium（4.26%）、柄孢壳属另分出 1 个裂壳属 Plenodomus 3.87%（防治香蕉枯萎病的内生真菌 L-14）、含亚洲、欧洲、北美洲山毛榉病害病原菌的 Neonectria2.98%、印度 Fusicolla 属真菌 2.13%、毛壳菌属 Chaetomium 1.93% 等。

2.4 不同处理方式菌渣微生物多样性指数（OTU 水平）

M2、M3 样品的 ACE、Shannon 和 Chao1 指数较高（表2），说明经过堆肥处理和轻简化处理的菌渣样品中所含细菌的种类及数量较多，二者差异不显著，说明轻简化处理菌渣可以保留堆肥菌渣的细菌数量及种类。群落的真菌丰富度表现为 M1<M2<M3，其他指标也同样说明 M1 多样性最小， M2 次之、M3 最大。

注：同列数据后小写字母、大写字母分别表示各样品间差异显著（P<0.05）、差异极显著（P<0.01）。

2.5 不同处理方式菌渣样品细菌、真菌属水平样品相对丰度比较分析

为进一步探究样本间菌属差异及变化，通过费舍尔精确检验对不同菌渣样品 M1、M2、M3 两两间的物种差异进行分析，置信区间为 0.95，双尾检验，显著性水平为 0.05，由图4、5 可见，选择属水平上前 15 位物种进行比较，在细菌、真菌属水平上各样本 M1、M2、M3 相对丰度达到了差异显著性水平（P≤0.001），其中丰度最高的前 4 种细菌主要是沙雷菌属 Serratia（46.96%、0、0.0034%）、类芽孢杆菌属 Paenibacillus（29.8%、0.8237%、0.5043%）、假单孢菌属 Pseudomonas（13.1%、2.444%、1.341%）、芽孢杆菌属 Bacillus（8.035%、3.107%、3.254%）（M1、 M3；M1、M2）；Arthrobacter（2.7%、4.391%）（M2、 M3）。其中丰度最高的前 3 种真菌是 Trichoderma、 Wardomyces、Talaromyces（M1、M2）、Trichoderma、 Tausonia、unclassified_o_Pleosporales（M1、M3）、 Wardomyces、Tausonia、Trichoderma（M2、M3）。说明不同处理状态的菌渣细菌、真菌属水平种群结构存在显著性差异，菌渣处理方式对菌渣微生物构成产生显著影响。

2.6 菌渣样本与环境因子关联分析

选取前 10 个优势属作属水平不同状态菌渣中主要细菌、真菌群落结构与环境因子 Spearman 相关性，分析不同的环境因子对菌渣样品属水平细菌、真菌群落组成的影响，如图6 所示。细菌属具体表现为沙雷菌属 Serratia、芽孢杆菌属 Bacillus 与 C/N、速效钾、有机质和总有机碳呈极显著性正相关，与总钾呈极显著性负相关。类芽孢杆菌属 Paenibacillus、假单孢菌属 Pseudomonas 与总氮呈极显著性负相关，Arthrobacter 与总氮呈极显著性正相关（P<0.001）。Flavobacterium、 Galbitalea 与总钾呈极显著性正相关（P<0.001），与 C/N、速效钾、有机质和总有机碳呈极显著性负相关。真菌属具体表现为 unclassified_o_Pleosporales、 Schizothecium 与环境因子无相关性，其他 8 种属均与部分环境因子存在相关性，且均是极显著性相关（P<0.001）。其中，Fusarium、Mortierella、Soilcoccozyma、 Tausonia 与有效磷、总磷和碱解氮呈极显著性负相关。 Tirchoderma 与总氮呈极显著性负相关，Wardomyces、 Talaromyces 与 C/N、速效钾、有机质和总有机碳与总钾呈极显著性正相关（P<0.001）；Pseudombrophila 与总氮呈极显著性正相关（P<0.001）。

注：左侧柱形图横坐标表示 2 个样本某一物种丰度占比均值，纵坐标表示 2 个样本的细菌 / 真菌物种相对丰度均值在 1～15 的物种。右侧图横坐标表示所设定的置信度区间内物种丰度差异占比，纵坐标为 P 值，P≤0.05 表示差异显著，且 0.01<P≤0.05 标记为 *，0.001<P≤0.01 标记为 **， P≤0.001 标记为 ***。下同。

注：* 代表 P<0.05，** 代表 P<0.01，*** 代表 P<0.001，R 值在图中以不同颜色展示，热图右侧色卡是不同 R 值颜色分区。

3 讨论

3.1 不同状态菌渣的基本理化性质

M2、M3 物料的 GI 分别经堆肥和轻简化处理后显著性增高，达到 98.66%、95.44%，较堆肥前分别增加了 50.97%、46.19%（P<0.05，表1），完全达到无害化效果。菌渣传统堆肥及轻简化堆肥处理均达到了菌渣无害化处理的目的，传统堆肥对物料的总氮及速效养分提升显著，但有机质及速效钾含量有所降低，这与处理时添加营养调控物料基础养分有关。菌渣作为食用菌产业末端的废弃物，经过堆肥后酸碱度有碱化趋势（M2 pH 较 M1 增加了 5.26%），这与周祖法等的研究相似^[22-25]。轻简化处理后的菌渣显著地提高了基础物料的总氮、总钾养分含量，总磷及速效养分及有机质变化大不。相关性热图分析结果表明菌渣细菌、真菌属水平群落同时受到物料养分含量的影响，不同的细菌、真菌属类受菌渣特性影响的情况存在差异，多种属类与部分环境因子存在相关性，且均是极显著性相关（P<0.001）。

3.2 不同状态菌渣的微生物多样性

3.2.1 不同处理方式菌渣细菌属水平主要物种丰度

M1 中的前 4 种菌属占其细菌种类的 98.17% 以上，其中沙雷菌属是肠杆菌科的 1 属，一般存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中。芽孢杆菌是细菌的 1 科，包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌杆菌科的 1 属细菌，适应于有机肥、农家肥、复合肥、化肥添加、生物农药添加、激活土壤、堆肥、液肥制作、粗纤维降解、厨余处理、饲料添加、环境净化、水产水质净化。类芽抱杆菌属的细菌，特别是多黏类芽抱杆菌是土壤中常见的细菌也是一类重要的病害生物防治微生物，有不少还具有刺激植物生长的特点。假单孢菌经常用来净化污水，可以通过自身的酶系统将污水里的汞离子转化为金属汞^[26]。以上说明 M1 中含有的各种细菌不仅无害，且均为对土壤环境有益的菌，其直接还田不会对土壤带来外源污染菌。M2 是 M1 经过传统高温堆肥后制成的，在堆肥过程中由于受其他物料影响，成品中的细菌种类增多，在属水平上有 17 种类组分在 0.82%～5.60%。不仅保留了 M1 含有的类芽孢杆菌 Paenibacillus、假单孢菌 Pseudomonas、芽孢杆菌 Bacillus 3 个菌属，虽相对丰度有所降低，但是经传统堆肥后的微生物种类增多，但单一菌属的相对丰度有所降低。M3 是经过轻简化处理的食用菌废弃菌渣，相比 M2 增加了微生物种类，可见，轻简化堆肥处理保留了堆肥处理中较好的肥效菌属，增加了细菌丰度。M3 样品与 M2 的细菌类别基本一致，二者无显著性差异。说明轻简化处理菌渣（M3） 可以达到堆肥菌渣（M2）的微生物种类与数量。

3.2.2 不同处理方式菌渣真菌属水平主要物种丰度

从测序结果可以看出，M1、M2 菌渣样品中含有大量可以降解纤维素的木霉属（M1 占比 99.51%，M2 占比 23%），广泛存在于自然界中，木霉属是纤维素酶的重要生产菌，主要种类有绿色木霉（T. viride）和康氏木霉（T. koningi）等，是木材和有关工业产品的破坏者。由于木霉常寄生于某些真菌的子实体上，因此是栽培食用菌的劲敌，但是对于秸秆还田地块的土壤新鲜有机质或堆肥物料的腐熟都具有促进意义^[27-29]。因此，可将菌渣作为纤维素降解菌的菌源提取物质，菌渣经堆肥和轻简化处理后木霉属的丰度有所降低，但是物种多样性增加，尤其是 M3 中含有多种抗农业致病真菌活性的真菌，像 Pleosporales（9.57%）、柄孢壳属另分出一个裂壳属 3.87%（防治香蕉枯萎病的内生真菌 L-14），将其还田可以提高土壤的生防功能，对土传病害的防治具有积极意义。

3.3 菌渣轻简化还田可行性分析

前期研究结果显示，菌渣中不仅含有较多的纤维素、半纤维素和木质素，而且还含有丰富的菌丝残体蛋白、脂肪、氨基酸、矿物质、菌丝体的次生代谢产物和钙、磷、钠、铜等多种微量元素^[30]，利用微生物技术开展轻简化处理后，可充分利用菌渣中丰富的营养成分、有益微生物及菌渣中的菌丝在生长过程中分泌的一些生物活性物质，对有害菌繁殖有较好的抑制作用，能够有效地控制和减轻地上病害和土传病害的发生，又可以达到肥效释放速率快、培肥土壤、减少作物肥料投入^[31]，对降低农业成本投入具有重要作用。不仅解决菌渣处理难题，增加生态效益，更能增加种植业的经济效益，而且对区域内土壤生物肥力和各种农业病害防治具有积极意义^[32-34]。

4 结论

本研究通过比较不同菌渣处理方式对菌渣理化性质的影响，发现轻简化菌渣处理方式可以提高物料的总氮含量，降低物料的 pH，同时可以达到菌渣无害化标准，与传统堆肥相比可以节约时间，提高堆肥效率。

群落丰度组成表明，不同菌渣处理方式下，在细菌、真菌属水平上菌渣的微生物多样性相对丰度达到了差异显著性水平（P≤0.001）。说明不同处理状态的菌渣细菌、真菌属水平种群结构存在显著性差异，菌渣处理方式对菌渣微生物构成产生显著影响，其中以轻简化处理的菌渣微生物（细菌、真菌）丰度最高。

菌渣经轻简化处理后既保留了原有堆肥的微生物种类，提高了其他微生物的丰度，菌渣中含有大量肥效微生物和生防微生物，因此，从微生物丰度、养分含量及有无毒害作用来看，废弃菌渣经轻简化处理后具备还田的优势。

参考文献