土壤有效磷可相对说明土壤的供磷水平，在实际生产中作为土壤施用磷肥与否的标准^[1-3]，因此，准确测定土壤有效磷的含量是十分必要的。现期常用的土壤有效磷浸提方法有 Bray I 法、Olsen 法、Mehlich 3 法和双酸法等^[4-6]。其中 Olsen 法所用的 0.5 mol/L 碳酸氢钠浸提液对有效态的 Fe-P、 Al-P 和 Ca-P 均可适当地提取，有一定应用优势。钼锑抗比色法灵敏度高，检测的有效磷含量准确稳定。因此，碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法是土壤有效磷含量测定的经典方法之一^[7-10]。可是，此方法的整个检测程序均需人工操作，工作强度大，费工费时，不利于批量土壤样品有效磷含量的快速检测。随着检测技术的不断发展，流动分析仪等大型仪器因具备自动化程度高、检测准确高效等特点而倍受关注，以其代替人工检测成为现代检测技术的发展趋势。至今，使用流动分析仪测定土壤有效磷含量方面的研究取得了一定成果。李朝英等^[11]使用流动分析仪测定双酸法浸提的有效磷含量的加标回收率为 95.6%～97.8%，重复试验的变异系数为 1.57～7.07%。罗雪华等^[12]使用流动分析仪测定 Mehlich 3 法浸提的有效磷含量的平均回收率为 98.23%，重复试验的变异系数小于 0.5%。庞世花等^[13]使用流动分析仪法测定碳酸氢钠浸提的土壤有效磷含量与钼锑抗比色法比较，两者无显著性差异，两种方法的测定结果有良好的相关性。现行农业行业标准和林业行业标准将流动分析仪法与碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法都列为土壤有效磷含量测定的标准方法^[8，14]。

然而，李枝武等^[15]提出碳酸氢钠浸提的有效磷含量大于 0.5 mg/L 土壤样品（即 10 mg/kg）时可使用流动分析仪测定，小于 10 mg/kg 的则建议采用钼锑抗比色法测定。李小涵等^[16]在测定石灰性有效磷低含量土壤样品时，也出现仪器基线持续波动，检测不稳定的状况。张英利等^[17]指出现有流动分析仪法测定碳酸氢钠浸提的有效磷含量的灵敏度较低，基线波动大，测定有效磷低含量样品的精密度差，仪器适宜检测有效磷高含量样品。上述研究表明现有流动分析仪法存在局限性，不适用于有效磷低含量样品检测分析。庞世花等^[13]使用现有流动分析仪测定有效磷含量在 2.5 mg/L（即 50 mg/ kg）以上的土壤样品，属于有效磷高含量范畴，检测准确稳定，未出异常。因所用样品缺乏代表性，其研究对有效磷低含量样品的准确检测未能提供参考。从某个角度看，流动分析仪法是将碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法移植到仪器上，但其检测效果差于碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，说明其中存在一定的问题。至此，使用流动分析仪准确测定碳酸氢钠浸提的有效磷低含量样品的方法讨论甚少，基于现状提出的方法改进讨论未见报道，使用流动分析仪准确高效地测定有效磷低含量样品方面难以得到可行的技术指导，方法移植过程存在问题的解决办法尚不清楚。在实际工作中，批量土壤样品有效磷含量常常会出现高低不一，或者整批土壤有效磷含量均偏低的情况，这使得现有流动分析仪法难以适用于日常检测。

值得注意的是，土壤微生物生物量研究成为当代土壤学研究的热点之一，此研究对深入探讨土壤养分循环机理，开展生态系统优化及资源保护等方面工作有着重要意义^[18-19]。土壤微生物生物量所包含的生物量磷含量的主要测定方法也是碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法。土壤生物量磷含量受各种因素影响，其含量也会有高低变化^[20-21]，故使用流动分析仪测定生物量磷含量与测定有效磷含量存在相同问题。在此问题未能解决之前，使用人工检测不利于批量样品的自动化检测分析工作的开展。

由上可见，使用流动分析仪准确测定碳酸氢钠溶液浸提的有效磷低含量样品的方法有必要进一步探讨，解决存在问题，优化现有方法，能准确高效地检测有效磷含量高低不一的样品，从而充分发挥仪器优势，满足批量土壤有效磷或生物量磷含量的检测需求。此项工作对流动分析仪法的进一步完善优化，以及相关研究工作开展和仪器功能开发利用等有着重要的现实意义。鉴于此，本试验选择了 49 个土壤，有效磷含量在 0.04～1 mg/L（即 0.8～20 mg/kg），结合碳酸氢钠-钼锑抗比色法的检测程序，对流动分析仪测定碳酸氢钠浸提的有效磷含量的方法进行深入讨论，以期提出一种改进方法，与现方法、钼锑抗比色法进行比较分析，为使用流动分析仪准确高效测定有效磷含量高低不同的土壤样品提供可行的方法，为批量土壤有效磷和生物量磷含量的快速检测给予参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

电子分析天平（万分之一）；AA3 流动分析仪 （配置 MT7 模块，AACE 操作软件）；UV765 紫外分光光度计。

1.2 样品

2020 年 9 月于广西友谊关森林生态系统国家定位观测研究站样地采集土壤 49 份，依次编号 1～49。将土壤中植物根、石砾等挑拣干净，过孔径 2 mm 筛待用。

1.3 实验方法

1.3.1 土壤样品处理

称取 2 g 土壤入 100 mL 塑料瓶，加入 0.5 mol/L 碳酸氢钠溶液 40 mL，加入 0.5 g 无磷活性碳，加盖振荡 30 min，过滤。空白不加土壤样品，同上操作。所得滤液供有效磷的检测。

1.3.2 钼锑抗比色法（后称人工比色法）

1.3.2.1 试剂

0.5 mol/L 碳酸氢钠溶液：称取 42 g 碳酸氢钠溶于适量水中，定容 1 L。钼锑抗贮存液：量取 153 mL 硫酸缓慢注入约 400 mL 水中，搅匀，冷却。另取 10.0 g 钼酸铵溶于 300 mL 约 60℃的水中，冷却。然后将该硫酸溶液缓慢注入钼酸铵溶液中，搅匀，再加入 100 mL 的 5 g/L 酒石酸锑钾溶液，最后用水定容至 1 L，此溶液贮存于棕色瓶中。 5 g/L 酒石酸锑钾溶液：称取 0.5 g 酒石酸锑钾，溶于 100 mL 水中。钼锑抗显色液：称取 1.5 g 抗坏血酸，溶于 100 mL 钼锑抗贮存液。2 mol/L 氢氧化钠溶液：称取 80 g 氢氧化钠，溶于水，用水定容 1 L。 2 g/L 2，4-二硝基酚指示剂：称取 0.20 g2，4-二硝基酚溶于 100 mL 水中。0.5 mol/L 硫酸溶液：量取 28 mL 硫酸，缓慢注入水中，用水定容 1 L。1∶1 硫酸：50 mL 水中加入 50 mL 浓硫酸。

1.3.2.2 样品检测

抽取 1.3.1 所得滤液 10 mL，加入 1～2 滴二硝基酚指示剂，先加入 1∶1 硫酸 4 滴，摇动溶液，促进气泡逸失，滴加 0.5 mol/L 硫酸溶液至待测液由黄色恰变为无色，再滴加 2 mol/L 氢氧化钠溶液至待测液呈淡黄色，加入 1.5 mL 钼锑抗显色液，定容 15 mL，摇匀，放置 40 min，用 1 cm 比色皿于波长 700 nm 处比色检测。空白试验同上。

1.3.2.3 标准曲线建立

抽取 10 mg/L 磷标准溶液的 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 mL，加 1～2 滴二硝基酚指示剂，加 0.5 mol/L 硫酸溶液使其由黄色变为无色，之后加 2 mol/L 氢氧化钠溶液、钼锑抗显色液及检测同 1.3.2.2，建立有效磷的标准曲线。

1.3.3 现有流动分析仪法（后简称现方法）

1.3.3.1 试剂

进样清洗液：配制同 1.3.2.1 中的 0.5 mol/L 碳酸氢钠溶液。十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取 1 g SDS 溶于 500 mL。钼酸铵溶液：称取 1.8 g 钼酸铵溶入约 600 mL 水中，加入 0.05 g 酒石酸锑钾溶解，加入 1 g SDS 溶解，用水定容 1 L。抗坏血酸溶液：8 mL 浓硫酸加入少量水，称取 1.5 g 抗坏血酸溶解，定容 100 mL。以上试剂均为分析纯级别。

1.3.3.2 仪器条件

流速 40 个样 /h，样品对冲时间 2 s，进样时间 48 s，清洗时间 24 s，仪器默认设置基线和漂移校正，自动基线参比为 5%。

1.3.3.3 流动分析仪-MT7 模块管路

现方法管路图设置见图1。

1.3.3.4 待测液

1.3.1 所得滤液倒入检测杯中待测。

1.3.3.5 标准曲线建立

抽取 100 mg/L 磷标准溶液 0、0.1、0.2、0.25、0.5、0.75 mL，用清洗液定容 25 mL，配制磷浓度为 0、0.4、0.8、1、2、3 mg/L，按 1.3.3.2 中流动分析仪检测条件进行测定，建立标准曲线。

1.3.4 改进方法

1.3.4.1 试剂

进样清洗液：配制同 1.3.2.1 中 0.5 mol/L 碳酸氢钠溶液。SDS 溶液：同 1.3.3.1 中 SDS 溶液。酸液：少量水中加入 28 mL 硫酸，定容 500 mL。钼酸铵溶液：称取 1.8 g 钼酸铵溶入约 600 mL 水中，加入 22.3 mL 硫酸，加入 0.05 g 酒石酸锑钾溶解，加入 1 g SDS 溶解，用水定容 1 L。抗坏血酸溶液：称取 1.5 g 抗坏血酸溶解少量水中，定容 100 mL。以上试剂均为分析纯级别。

1.3.4.2 仪器条件

同 1.3.3.2。

1.3.4.3 流动分析仪-MT7 模块管路

改进方法管路设置见图1。

1.3.4.4 待测液

1.3.1 所得滤液倒入检测杯中待测。

1.3.4.5 标准曲线建立

操作同 1.3.3.5。

1.3.5 流动分析仪的精密度与准确性检验

1.3.5.1 重复性试验

土壤样品 1、2、8 按 1.3.1 操作制备待测液，按 1.3.4 检测，此试验重复 9 次。测量值 x_i 的算术平均值为样品有效磷含量的估计值，标准偏差（SD）用贝塞尔公式计算，即：

$SD=\sqrt{\frac{\sum _{i=1}^n{\left(x_i-\stackrel{-}{x}\right)}^2}{N-1}}$

相对标准偏差（RSD）= 标准偏差（SD）/ 算术平均值（$\stackrel{-}{x}$）×100%

1.3.5.2 方法回收率实验

土壤样 1、2、8 分别称 2 g，加入 100 mg/L 磷标准液 0.2 mL，0.5 mol/L 碳酸氢钠溶液定容 40 mL，按 1.3.1 操作制备待测液，按 1.3.4 检测。此试验重复 3 次，计算回收率，进行方法准确性检验。

回收率（%）=（加标后测定值-本底值）/ 加标量 ×100

1.4 数据分析

采用 Excel 2003 进行数据统计、绘图，采用 SPSS 19.0 对人工比色法、流动分析仪现方法、改进方法所测的有效磷含量进行多重比较，分析 3 种方法所测有效磷含量的差异显著性。利用直线方程进行回归分析，分析人工比色法与流动分析仪现方法、改进方法所测的有效磷含量的相关性及显著性。

2 结果与分析

2.1 改进方法的检测条件设置

以碳酸氢钠-钼锑抗比色法的检测程序为依据，按照先调酸碱度、排气、比色的原则对流动分析仪检测条件进行设置，由此提出改进方法。酸性试剂与进样管路均设置在透析器前，以便及时排出管路中的二氧化碳。通过计算及多次试验，1 L 酸液加入 28 mL 硫酸，1 L 钼酸铵溶液中加入 22.3 mL 硫酸为宜，管路中酸与碳酸氢钠待测液反应充分，排气迅速，进入检测器前的气泡长度变化不明显，减少了检测干扰，反应后的混合液酸度符合显色酸度。在标准溶液最高浓度为 3 mg/L 的情况下，增益可控制在 200 以内，确保仪器的灵敏度。

2.2 人工比色法与流动分析仪现方法、改进方法所测有效磷含量的比较

由图2 可见，现方法、改进方法、人工比色法同时测定 49 个土壤样品有效磷含量，测定结果分别为 0.03～0.90、0.06～0.91、0.05～0.85 mg/L，现方法所测结果整体呈偏低趋势。人工比色法与改进方法所测结果较接近。

由表1 可见，现方法、改进方法与人工比色法所测 49 个土壤有效磷含量均值分别为 0.196、 0.324、0.315 mg/L。现方法与人工比色法、改进方法所测有效磷含量均有显著性差异（P<0.05），人工比色法与改进方法所测有效磷含量无显著性差异（P>0.05）。有效磷含量在 0.60～1 mg/L 的 6 个土壤样品，现方法、人工比色法、改进方法所测有效磷含量趋一致，经方差分析，3 种方法测定结果无显著性差异（P>0.05）。有效磷含量 0.04～0.60 mg/L 的 43 个土壤样品，现方法与人工比色法、改进方法所测有效磷含量均有显著性差异 （P<0.05），人工比色法与改进方法所测有效磷含量无显著性差异（P>0.05）。可见，与人工比色法相比，改进方法可用于有效磷含量高低不同的土壤样品。现方法可用于测定有效磷含量高的土壤样品，不适用于测定有效磷含量低的土壤样品。

注：数据为平均值 ± 标准误，同列数据后的相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）。

2.3 人工比色法与现方法、改进方法所测有效磷的相关性

由图3 可见，人工比色法与现方法测定有效磷含量回归方程：Y（人工比色法）=0.759X（现方法）+0.166（R² =0.811 P<0.01），两种方法所测有效磷呈极显著性相关。人工比色法与改进方法测定有效磷含量回归方程：Y（人工比色法）=0.894X （改进方法）+0.024（R² =0.973 P<0.01）。两种方法所测有效磷呈极显著性相关，可是人工比色法与改进方法的回归方程的斜率更趋近于 1，回归方程的截距更接近于 0，说明人工比色法与改进方法所测有效磷含量更为相近，这与图3 所示情况一致。

2.4 改进方法测定有效磷的准确性与精密度检验

采用标准加入法进行方法回收率检验。3 个土壤样品的有效磷加标量为 0.500 mg/L。由表2 可见，改进方法测定有效磷的平均回收率在 94.40%～105.20%。说明改进方法测定有效磷的准确性可以满足检测需求。

使用改进方法测定 3 个土壤有效磷含量进行精密度检验。由表3 可见，3 个样重复检测 9 次的有效磷含量的 RSD 在 5.54%～8.81%。可见，改进方法测定有效磷含量的精密度均较好，测定结果稳定。

3 讨论

本试验所用的 49 个土壤有效磷含量在 0.04～1 mg/L（即 1～18 mg/kg），有效磷含量高低不一，包含了有效磷高含量及低含量土壤，有良好的代表性。人工比色法与现方法测定有效磷含量回归方程：Y（人工比色法）=0.759X（现方法）+0.166 （R² =0.811 P<0.01），两种方法所测有效磷呈极显著性相关。人工比色法与改进方法测定有效磷含量回归方程：Y（人工比色法）=0.894X（改进方法）+0.024（R² =0.973 P<0.01），两种方法所测有效磷含量呈极显著性相关。有效磷含量在 0.60～1 mg/L 的 6 个土壤样品，现方法、人工比色法、改进方法所测有效磷含量趋一致，三者无显著性差异（P>0.05）。有效磷含量 0.04～0.60 mg/L 的 43 个土壤样品，现方法与人工比色法、改进方法所测有效磷含量均有显著性差异（P<0.05），人工比色法与改进方法所测有效磷含量无显著性差异 （P>0.05）。以上说明现方法可准确测定高含量有效磷，但测定低含量有效磷的准确性欠佳。这与李枝武等^[15]所述一致。本试验提出的改进方法不受土壤有效磷含量高低影响，检测稳定。重复试验中所测土壤有效磷含量的 RSD 小于 8.90%，回收率在 93%～106% 之间，检测准确性和精密度良好。改进方法可用于检测有效磷含量高低不同的土壤样品。

人工比色法与现方法、改进方法测定有效磷含量都是基于磷钼蓝原理，即磷酸盐和钼酸铵在一定酸性条件下形成蓝色的磷钼杂多酸，其六价钼离子被抗坏血酸还原为五价钼离子，生成磷钼蓝物质^[22-23]。从理论上讲，3 种方法的测定结果应该是一致的，可是改进方法与人工比色法一致，现方法测定有效磷含量 0.04～0.60 mg/L 土壤的结果与另两种方法有显著性差异。现方法与改进方法同用仪器检测，但两种方法管路设置不同，结合仪器设计原理及碳酸氢钠浸提液显色反应而伴随的产气反应分析可知，两种方法有着明显不同的检测效果。流动分析仪采用了空气片断的连续流动分析技术，均匀的气泡将样品与样品分开，降低样品之间的污染，确保灵敏度高，稳定性好。流动分析仪正常检测时，气泡均匀，基线稳定。改进方法在透析器前进样，注入酸液和酸性钼酸铵溶液，在透析器后的管路中注入未加酸的抗坏血酸溶液；碳酸氢钠与酸中和反应产生的大量二氧化碳气体通过透析器排废管路排出，透析器后管路气泡大小形状变化不明显，基线稳定，故测定有效磷含量高低不同的土壤样品的结果准确稳定。现方法在透析器前进样，注入未加酸的钼酸铵，在透析器后管路中注入酸性抗坏血酸溶液；碳酸氢钠与酸中和反应产生的二氧化碳气体在封闭管路中无法排出，管路气泡变长，气体冲击力对气泡大小形状的稳定性存在一定破坏性，造成基线漂移，这对高含量有效磷的准确测定影响不明显，但对低含量有效磷的准确测定影响明显，因此，现方法与人工比色法所测有效磷含量趋势一致，但两者测定低含量有效磷的结果有显著性差异。张英利等^[17]指出因化学反应特征决定，碳酸氢钠浸提液与酸反应产生的大量二氧化碳气体导致管路气泡变长，且不规则，影响低含量有效磷的测定结果准确性及稳定性。这与本试验结果一致。可见，碳酸氢钠浸提液的有效磷含量测定存在一定特殊性，酸化过程产生的气体是影响准确检测的重要干扰因素。人工比色法中，通常是边加酸边摇动待测液，等气泡不再发生后再显色检测，以避免干扰。改进方法结合仪器特点，优化了管路设置，排除了气体干扰，其效果类同于人工比色法，故改进方法检测准确稳定，其适用性优于现方法。鲁如坤等^[24]、叶祥盛等^[25]提出将碳酸氢钠浸提液调完酸碱度后再上流动分析仪测定，此做法消除了二氧化碳气体干扰，有利于准确检测，但增加了抽样、调酸碱度、摇匀静置等一系列人工操作，无形中占用大量容器，增加清洗工作量。批量样品的检测分析工作繁琐费时，易出人为差错，并不是理想的选择。本试验提出的改进方法直接用碳酸氢钠浸提液上机检测，充分利用仪器特点，排除检测干扰，操作简单高效，更适用于代替人工比色法完成批量样品的检测分析。

张英利等^[17]提出标准溶液最高浓度不要低于 8 mg/L，否则测定有效磷含量在 2 mg/L 以下的农田土壤的基线噪音大，精密度较差。李小涵等^[16]提出测定低含量有效磷标准溶液最高浓度适宜设置为 3 mg/L。本试验将标准溶液最高浓度设置为 2.4、3 mg/L，增益分别达到 246、176。考虑到增益过大，仪器灵敏度下降。本试验将标准溶液最高浓度设置为 3 mg/L，方法精密度与准确性良好。说明在此条件下，仪器灵敏度尚可满足检测需求。

使用改进方法完成 100 个土壤浸提液的检测分析，试剂配制、自动检测和数据整理用时共计 4.5 h，其中需人员操作（即配制试剂、仪器操作和数据整理）的用时约 1.5 h。人工比色法的试剂配制、浸提液酸碱调整及显色、比色分析和数据整理约计 8 h，且均为人员操作。可见，改进方法省工省时，经济高效。

4 结论

本试验提出的改进方法优化了管路设置，消除了测定干扰，可用于有效磷含量高低不一的土壤样品检测，所测结果与人工比色法呈显著性相关，且无显著性差异。加标回收率为 94.40%～105.20%， RSD 为 5.54%～8.81%。方法精密度及准确性良好。可推荐用于检测有效磷含量高低不一的土壤样品。

参考文献