多菌灵是一种苯并咪唑类杀菌剂，由于其具有高效、对人畜低毒、抑菌谱广的特点，在市面上被广泛用于蔬菜、果树、中草药病害的防治，可用于农业生产中的作物和土壤的处理等。在实际农业生产过程中，人们为了达到所需的抗病抗虫害的效果，通常会在生产过程中反复施用农药，致使土壤的农药残留问题严峻，并且土壤微生物受到很大影响^[1]。

土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分，可以反映土壤的质量和健康状况，对土壤养分循环、土壤理化结构以及有机污染物的降解等起着至关重要的作用。大多数的土壤酶来源于土壤微生物，因此土壤酶作为参与土壤能量循环和养分转移的重要部分，在土壤微生物生态环境中起到重要的作用^[2]。大部分用于农业生产的农药会进入土壤中，进而可能会影响土壤中的微生物活性。多项研究也表明施用农药会影响土壤酶活性^[3-5]。土壤脲酶可以水解催化土壤中的尿素，并将其水解生成氨和二氧化碳，是参与氮素循环非常重要的水解酶，其活性与土壤氮素状况有密切的关系，是指示土壤氮素状况的灵敏指标^[6-7]。杀菌剂的施用浓度显著影响土壤脲酶等酶的活性，能通过影响土壤酶活性进而抑制土壤的养分循环^[8]。土壤几丁质酶参与了生物细胞壁物质几丁质转化为氨基糖的过程，而氨基糖是土壤矿化氮的主要来源之一，因此几丁质酶在氮素循环中起到重要作用^[9]。几丁质酶活性对不同类型农药的施用反映最为敏感，并且不同类型农药的施用对土壤微生物氮循环均有抑制作用^[10]。土壤微生物生物量不仅可以作为评价土壤质量的指标，而且可以反映微生物在土壤中的实际含量和活性，是土壤微生物质量变化的重要指标^[11-12]。施用高剂量农药可显著降低微生物生物量氮，而施用低剂量农药的土壤微生物生物量氮会在短期内增加^[13]。氮的矿化是由微生物参与的将土壤有机氮转化为无机氮的过程，矿化氮的高低以及氮矿化速率反映了土壤有机氮的矿化能力，对土壤氮素循环具有重要意义。研究表明农药的施用对土壤氮素转化具有影响^[14-15]，农药影响土壤的生化过程是由微生物和酶反应驱动的，土壤酶动力学特征可以表征土壤酶含量的高低，反映土壤酶与底物之间结合的紧密程度和作用过程，是研究者探究土壤酶与外来物质之间作用机理的重要依据和指标。K_m 即米氏常数，通常表示当土壤酶反应速度是体系中给定酶的总浓度下最大反应速度一半时的底物浓度。V_max 即最大反应速度，是酶被底物完全饱和时的酶催化反应速度，它是表征土壤酶促过程潜在能力的容量指标。V_max/K_m 即酶促反应初速度，是衡量酶催化能力的重要指标，也可作为评判农药对土壤肥力影响的指标^[16-18]。

农药在土壤中的降解与土壤的理化性质密切相关，土壤湿度的变化影响农药在土壤中的分解速率和土壤微生物群落结构^[19]。土壤湿度的提高有利于刺激微生物活性，水分与农药竞争吸附位点，从而促进农药的降解^[20]。目前各研究学者对于土壤湿度对土壤酶活性的影响有不同的观点，有研究表明土壤湿度与土壤酶活性呈正相关^[21]，也有研究发现土壤湿度与水解酶活性呈负相关^[22]。目前尚未有针对土壤湿度和多菌灵的连续施用是如何影响土壤多菌灵降解、氮素状况以及脲酶动力学参数等指标的研究报道，因此，通过在室内模拟不同湿度的土壤连续施用多菌灵的条件，研究其在土壤中的残留状况，对酶活性、土壤氮素、脲酶动力学参数、土壤微生物生物量的影响，有助于全面地评价连续施用多菌灵对土壤生态环境的风险，并为其提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

试验土壤采于长沙市长沙县金井镇中国科学院长沙农业环境站（112°59′30″E，28°7′51″N） 内土层为 0～20 cm 的水稻土，除去植物残根和石砾等杂物后混匀风干过 0.15 mm 筛备用，一部分用于培养试验，供各试验指标分析；一部分用于土壤化学性质分析。土壤基本化学性质见表1。多菌灵为 50% 可湿性粉剂，购自江苏蓝丰生物化工股份有限公司。

1.2 试验设计

本试验设置 2 个影响因素，分别为土壤湿度和多菌灵施用剂量。设置 2 个土壤湿度和 4 个多菌灵添加量，共包括 8 个处理：（1）在 60% 土壤最大持水量（WHC）条件下土壤中不添加多菌灵（CBD0-60%）； （2）在 90%WHC 条件下土壤中不添加多菌灵（CBD0-90%）；（3）在 60%WHC 条件下每隔 7 d 添加 5 mg·kg^-1 的多菌灵，共添加 4 次（CBD5-60%）；（4） 在 90%WHC 条件下每隔 7 d 添加 5 mg·kg^-1 的多菌灵，共添加 4 次（CBD5-90%）；（5）在 60%WHC 条件下每隔 7 d 添加 10 mg·kg^-1 的多菌灵，共添加 4 次（CBD10-60%）；（6）在 90%WHC 条件下每隔 7 d 添加 10 mg·kg^-1 的多菌灵，共添加 4 次（CBD10-90%）；（7） 在 60%WHC 条件下每隔 7 d 添加 25 mg·kg^-1 的多菌灵，共添加 4 次（CBD25-60%）； （8）在 60%WHC 条件下每隔 7 d 添加 25 mg·kg^-1 的多菌灵，共添加 4 次（CBD25-90%）。

称取过筛的 100 g 风干土于三角烧瓶中，多菌灵溶于超纯水后加入土壤混匀，补加超纯水调节试验土壤湿度为 60%WHC 与 90%WHC。多菌灵每隔 7 d 施用 1 次，共施用 4 次，每个试验处理包含 4 个重复。用组培封口膜密封，置于 25℃恒温箱中避光培养，在培养过程中每天补加蒸馏水以保持土壤湿度，于第 28 d 采取土样。

1.3 测定方法

土壤有机质采用重铬酸钾容量法，土壤全氮采用凯氏定氮仪测定；土壤铵态氮和硝态氮通过 2 mol·L^-1 氯化钾浸提，靛酚蓝比色法测定铵态氮，紫外分光光度法测定硝态氮；土壤全磷采用高氯酸-硫酸-钼锑抗比色法测定；土壤有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定^[23]。几丁质酶活性采用 N-乙酰-葡糖胺比色法测定，几丁质酶活性单位为 pNP mg·kg^-1·d^-1[24]。脲酶动力学参数测定以尿素为基质，配置 4 个浓度分别为 0.833、1.665、2.498 和 3.33 mol·L^-1 的尿素溶液作为酶促反应的底物，在 37℃条件下培养 24 h，土壤脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定，脲酶活性单位为 NH₄ ⁺-N mg·kg^-1·d^-1[25]。土壤微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮 （MBN）经氯仿熏蒸后，用 0.5 mol·L^-1 硫酸钾浸提，分别采用重铬酸钾容量法^[26]和碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法^[27]测定，微生物生物量磷（MBP） 经氯仿熏蒸后，用 0.5 mol·L^-1 碳酸氢钠浸提，采用钼锑抗比色法测定^[26]。

多菌灵残留测定方法参考朱凤霞等^[28]的研究并略作修改。称取 5.00 g 冻干过 0.15 mm 筛的土样于 50 mL 离心管中，加入 30 mL 乙腈震荡 15 min，加入 1.00 g 无水醋酸钠和 3.00 g 无水硫酸镁，震荡 5 min 后 6000 r·min^-1 离心 5 min，将上清液倒入干净容器中，再加入 30 mL 乙腈震荡 5 min，反复操作萃取 6 次，合并萃取液 180 mL 于旋转蒸发仪浓缩，并用乙腈定容至 10 mL，待液相色谱检测。液相色谱检测色谱柱：4.6 mm（id）×250 mm， ZORBAX SB-C₁₈ 柱；粒径：5 μm；流动相：0.1% 氨水∶甲醇（40∶60）；检测波长：280 nm；进样量： 20 μL；流速：1 mL·min^-1；柱温：30℃；多菌灵出峰时间：6.2 min；检出限：0.15 mg·L^-1；多菌灵提取回收率：90%～98%。

1.4 数据处理与分析

室内培养前后的铵态氮和硝态氮含量的差值计算净氮矿化速率（NMR），计算公式如下：

$NMR=\frac{\left(C_t-C_{t0}\right)}{t}$

式中，NMR 的单位为 N mg·kg^-1·d^-1；C_t 为培养后的无机氮含量，C_t0 为培养前的无机氮含量，单位为 N mg·kg^-1；t 为培养天数。

脲酶动力学参数计算公式如下：

$V=\frac{V_{max}\cdot \left[S\right]}{\left[S\right]\cdot K_m}$

式中，V 为酶促反应初始浓度；V_max 为最大反应速度；S 为底物浓度；K_m 是米氏常数。此方程经过数学变换后得到：

$\frac{1}{V}=\frac{K_m}{V_{max}}\times \frac{1}{\left[S\right]}+\frac{1}{V_{max}}$

用$\frac{1}{\left[S\right]}$对$\frac{1}{V_{}}$作图，得出米氏常数 K_m 与最大反应速度 V_max。

采用双因素方差分析揭示土壤湿度、多菌灵添加量及其交互作用对土壤基本化学性质、氮矿化、几丁质酶活性以及脲酶动力学参数的影响；采用单因素方差分析揭示不同土壤湿度、不同多菌灵添加量处理间的统计学差异；通过主成分分析揭示土壤湿度、多菌灵添加量对研究对象的解释程度以及各因素之间的相关性；通过构建结构方程模型来解析多菌灵添加量对土壤氮素、微生物量、几丁质酶活性和脲酶动力学参数的直接和间接影响。

2 结果与分析

2.1 不同土壤湿度下多菌灵连续施用对土壤中的多菌灵残留量及残留率的影响

CBD5-60%、CBD10-60% 和 CBD25-60% 处理中的多菌灵残留量分别为 0.67、5.64 和 8.53 mg·kg^-1。 CBD5-90%、CBD10-90% 和 CBD25-90% 处理土壤中的多菌灵残留量分别为 0.64、1.25 和 0.74 mg·kg^-1。 CBD5-60%、CBD10-60% 和 CBD25-60% 处理中的多菌灵残留率分别为 3.32%、14.10% 和 8.53%。CBD5-90%、CBD10-90% 和 CBD25-90% 处理土壤中的多菌灵残留率分别为 3.22%、3.13% 和 0.74%。在相同多菌灵添加量下 60%WHC 条件下的土壤多菌灵残留量和残留率高于 90%WHC 条件下的土壤多菌灵残留量和残留率（表2）。

注：数据均是 4 个重复的平均值，不同大写字母表示不同浓度多菌灵添加量间差异显著，不同小写字母表示不同土壤湿度间差异显著 （P<0.05）。下同。

2.2 不同土壤湿度下多菌灵连续施用对土壤基本化学性质的影响

土壤湿度和多菌灵添加量及其交互作用对土壤有机质和全氮无显著影响（表3）。在不同土壤湿度和不同多菌灵添加量的条件下各处理土壤的有机质和全氮均无显著差异（图1a、b）。土壤湿度和多菌灵添加量及其交互作用对铵态氮含量有显著影响 （表3）。在 60%WHC 条件下各处理的土壤铵态氮含量分别为 26.14、26.65、26.52 和 26.54mg·kg^-1。CBD5-60% 处理的铵态氮含量显著高于不添加多菌灵的处理，但与其余处理差异不显著。在 90%WHC 条件下各处理的土壤铵态氮含量分别为 23.19、22.67、 19.89 和 22.85 mg·kg^-1。CBD10-90% 处理的铵态氮含量显著低于其他处理。在相同多菌灵添加量下 60%WHC 处理的土壤铵态氮含量均高于 90%WHC 处理条件下的土壤铵态氮含量（图1c）。土壤湿度和多菌灵添加量及其交互作用对硝态氮含量有显著影响（表3）。在 60%WHC 条件下各处理的土壤硝态氮含量分别为 8.76、8.87、9.45 和 16.94 mg·kg^-1。CBD25-60% 处理的硝态氮含量显著高于 CBD0-60% 和 CBD5-60% 处理。在 90%WHC 条件下各处理的土壤硝态氮含量分别为 50.39、52.79、 54.19 和 54.91 mg·kg^-1。CBD25-60% 处理的硝态氮含量显著高于其他处理。在相同多菌灵添加量条件下 60%WHC 的各处理土壤硝态氮含量均低于 90%WHC 的各处理土壤硝态氮含量（图1d）。在不同土壤湿度和不同多菌灵添加量的条件下，各处理土壤的全磷和有效磷含量均无显著差异（图1e、f）。

注：表内数值为 F 值，*、** 分别表示显著性达到 P<0.05、P<0.01。

注：数据均是 4 个重复的平均值，图柱上不同大写字母表示不同多菌灵添加量间差异显著，不同小写字母表示不同土壤湿度间差异显著（P<0.05）。下同。

2.3 不同土壤湿度下多菌灵连续施用对土壤氮矿化与几丁质酶活性的影响

土壤湿度以及土壤湿度和多菌灵添加量的交互作用对土壤氮矿化速率有显著影响（表3）。在不同土壤湿度和不同多菌灵添加量的条件下各处理的矿化速率的差异均显著。与不添加多菌灵的处理相比，CBD10-60% 处理的矿化速率显著提高；在 90%WHC 条件下，随着多菌灵添加量的增加，各处理的矿化速率显著降低。在相同多菌灵添加量条件下，60%WHC 处理的矿化速率均高于 90%WHC 处理的矿化速率（图2a）。土壤湿度及多菌灵添加量对几丁质酶活性有显著影响（表3）。在不同土壤湿度条件下，各处理土壤的几丁质酶活性均随着多菌灵添加量的增加而降低。60%WHC 条件下各处理的土壤几丁质酶活性分别为 311.03、274.22、181.65、 115.85 pNP mg·kg^-1·d^-1，相较于不添加多菌灵的处理，添加不同剂量多菌灵的各处理的抑制率分别为 11.84%、41.60% 和 62.75%。90%WHC 条件下，各处理的土壤几丁质酶活性分别为 251.56、184.15、 114.76 和 90.81 pNP mg·kg^-1·d^-1，相较于不添加多菌灵的处理，添加不同剂量多菌灵的各处理的抑制率分别为 26.80%、54.39% 和 63.90%（图2b）。

2.4 不同土壤湿度下多菌灵连续施用对土壤脲酶动力学参数的影响

在 60%WHC 条件下 CBD10-60% 处理的土壤脲酶酶促反应速度高于其他处理。60%WHC 条件下处理的土壤脲酶反应速度高于 90%WHC 下处理的土壤脲酶反应速度（图3）。

土壤湿度对土壤脲酶 K_m 值有显著影响，多菌灵添加量对土壤脲酶 K_m 值没有显著影响（表3）。在相同的多菌灵添加量条件下，60%WHC 条件下的各处理土壤脲酶 V_max 值均显著低于 90%WHC 条件下各处理的土壤脲酶 V_max 值。在 60%WHC 条件下 CBD25-60% 处理的 V_max/K_m 值显著低于 CBD5-60% 和 CBD10-60% 处理的 V_max/K_m 值。在 90%WHC 条件下各处理土壤的脲酶 V_max/K_m值无显著差异 （表4）。

2.5 不同土壤湿度下多菌灵连续施用对土壤微生物生物量的影响

土壤湿度和多菌灵添加量及其交互作用对 MBN 有显著影响（表3）。如图4a、c 所示，各处理对 MBC 和 MBP 没有显著影响。60%WHC 条件下各处理的 MBN 分别为 9.96、12.62、5.63 和 3.58 mg·kg^-1。CBD5-60% 处理的 MBN 显著高于 CBD10-60% 和 CBD25-60%处理的 MBN。90%WHC 条件下各处理的 MBN 分别为 3.38、6.88、2.14 和 3.52 mg·kg^-1。CBD5-90% 处理的 MBN 显著高于 90%WHC 条件下其他 3 个处理的 MBN （图4b）。

2.6 土壤湿度和多菌灵添加量与各测定指标的综合关系

主成分分析结果表明，土壤湿度和多菌灵添加量对土壤氮素、微生物生物量及几丁质酶活性有显著影响（图5）。不同多菌灵添加量的处理之间差异明显，在 60%WHC 条件下，CBD10-60%、CBD25-60% 处理与 CBD0-60% 处理相比差异显著，CBD0-60% 处理处于二维图的右上角，CBD10-60% 和 CBD25-60% 处理同处于二维图的右下角。在 90%WHC 条件下， CBD10-90%、CBD25-90% 处理与 CBD0-90% 处理相比差异显著。MBC、MBN、铵态氮、矿化速率与几丁质酶活性和脲酶V_max/K_m值均呈正相关，与脲酶 V_max 值和 K_m 值呈负相关。硝态氮与几丁质酶活性和脲酶V_max/K_m值均呈负相关，与脲酶 V_max 值和 K_m 值呈正相关。结构方程模型的结果表明，多菌灵添加量可以通过影响土壤矿质氮含量与生物学属性，从而影响土壤脲酶动力学的参数。多菌灵的连续施用抑制了土壤几丁质酶活性、降低了土壤微生物量氮含量，但是却提高了土壤硝态氮含量，同时土壤硝态氮含量与脲酶V_max/K_m值具有显著负相关性（图6）。

注：OM：有机质；TN：全氮；TP：全磷；AP：有效磷；NH₄ ⁺：铵态氮； NO₃^-：硝态氮；NMR：矿化速率；MBC：微生物量碳；MBN：微生物量氮；MBP：微生物量磷；CHI：几丁质酶；K_m：脲酶米氏常数；V_max：脲酶最大反应速率；V_max/K_m：脲酶酶促反应初速度；QMA：多菌灵残留量。

注：实线表示正效应，虚线表示负效应；箭头旁数字表示标准化路径系数；用 *、**、*** 分别表示显著水平 P<0.05、P<0.01、P<0.001；R² 表示自变量对因变量的共同解释度。

3 讨论

3.1 不同土壤湿度下多菌灵连续施用对土壤中的多菌灵残留量及残留率的影响

在不同土壤湿度条件下各处理的多菌灵残留量和残留率有显著差异。在 60%WHC 条件下各处理土壤的多菌灵残留量随着多菌灵添加量的增加而增加，添加量越大，土壤中多菌灵残留量越大。不同土壤湿度下的土壤多菌灵残留量有明显差异，在 60%WHC 条件下连续添加 10、25 mg·kg^-1 多菌灵处理的多菌灵残留量及残留率均显著高于在 90%WHC 条件下连续添加 10、25 mg·kg^-1 多菌灵处理的多菌灵残留量及残留率。在高浓度多菌灵施加和较高土壤湿度的条件下多菌灵降解率提高，可能是土壤水分含量增加，促进了农药在土壤中的扩散和水解^[28-30]，增强了药物和土壤的吸附作用^[31]。

3.2 不同土壤湿度下多菌灵连续施用对土壤化学性质的影响

在不同土壤湿度条件下，CBD25-60% 和 CBD25-90% 处理的硝态氮含量显著增加，说明农药对土壤微生物的影响具有明显的浓度正效应，硝化作用随着一定范围内多菌灵浓度的增加而增强。有学者研究发现，某些农药导致硝态氮积累是由于微生物在代谢过程中，因碳源不足而导致对氮源利用减少而形成过剩所致^[32]。在相同多菌灵添加量的条件下，90%WHC 条件下各处理的土壤硝态氮含量均高于 60%WHC 条件下各处理的土壤硝态氮含量。研究发现土壤进行硝化作用的合适水分含量是 60%WHC，过低或过高都会对土壤硝化作用产生抑制^[6]。但也有研究报道在饱和持水量或淹水条件下土壤硝化作用反而更强，这与土壤类型有关^[33]。因此，在不同土壤湿度条件下的硝态氮含量产生差异有可能是因为供试土壤为水稻土， 90%WHC 接近于饱和持水量，在室内培养条件下能够保证充足的氧气和足够的水分，反而促进了底物扩散而有利于硝化作用。

3.3 不同土壤湿度下多菌灵连续施用对土壤氮矿化与几丁质酶活性的影响

在相同多菌灵添加量的条件下 90%WHC 条件下处理的土壤氮矿化速率显著低于 60%WHC 处理的矿化速率，可能是因为水分超过一定范围，对微生物的胁迫作用而导致矿化作用减慢^[34]。在 60%WHC 条件下多菌灵添加量的增加使土壤矿化速率提高，这可能是由于多菌灵在土壤中的毒性较大，微生物遭到破坏，其体内的有机氮被释放出来转化为无机氮，增加了土壤中的无机氮^[35]。在不同土壤湿度条件下各处理的几丁质酶活性均随着多菌灵添加量的增加而受抑制，可能是多菌灵及其产物使土壤微生物死亡^[14]，对几丁质酶活性产生抑制作用^[36]。

3.4 不同土壤湿度下多菌灵连续施用对土壤脲酶动力学参数与微生物生物量氮的影响

在 60%WHC 条件下 CBD25-60% 处理的V_max/K_m值显著低于 CBD5-60% 和 CBD10-60% 处理，说明多菌灵的加入减弱了土壤脲酶在酶促反应过程中的催化强度^[17]。在相同多菌灵添加量的条件下 60%WHC 处理的土壤脲酶 K_m 值和 V_max 值显著低于 90%WHC 处理的土壤脲酶 K_m 值和 V_max 值，这可能是由于土壤水分影响了土壤微生物的生长，土壤水分过高使得土壤孔隙减少，从而限制土壤呼吸^[37]，抑制土壤微生物生长，使土壤脲酶活性降低，从而抑制了酶与底物的结合以及酶-底物复合体形成产物的能力，使 K_m 值和 V_max 值减小。 60%WHC 条件下各处理的土壤脲酶V_max/K_m值显著高于 90%WHC 条件下各处理的土壤脲酶V_max/K_m值，说明土壤水分含量过高会减弱其催化强度^[37]。在相同土壤湿度条件下不同剂量多菌灵的施用对 MBN 具有显著的影响。CBD5-60% 和 CBD5-90% 处理的 MBN 均显著增加，可能是添加的多菌灵在农药分解后增加了土壤的碳源与氮源，使得微生物活性有所提高，MBN 随之增加^[38]。而在不同土壤湿度条件下连续添加 10 和 25 mg·kg^-1 的多菌灵使土壤 MBN 显著减少，可能是由于高浓度多菌灵的连续添加对土壤微生物有毒害作用，抑制了微生物繁殖，使得 MBN 减少^[39]。

4 结论

土壤湿度显著影响多菌灵的降解，连续添加 10、25 mg·kg^-1 多菌灵的处理在 60%WHC 条件下的土壤多菌灵残留量及残留率显著高于 90%WHC 条件下的土壤多菌灵残留量及残留率。不同添加量的多菌灵连续施用与土壤湿度对土壤铵态氮、硝态氮、氮素矿化、几丁质酶活性、土壤脲酶动力学参数和微生物生物量有显著影响。在 60%WHC 条件下连续添加 5 mg·kg^-1 多菌灵处理的土壤铵态氮含量显著增加；在不同土壤氮湿度条件下多菌灵的添加使土壤硝态氮含量增加。在 60%WHC 条件下多菌灵的添加提高了土壤氮矿化速率，但在 90%WHC 条件下多菌灵的添加使矿化速率下降。在不同土壤湿度条件下多菌灵的添加显著抑制了土壤几丁质酶活性。不同土壤湿度条件下 MBN 在连续添加 10 和 25 mg·kg^-1 多菌灵的处理组中均显著降低。在 60%WHC 条件下连续添加 25 mg·kg^-1 多菌灵处理组的脲酶V_max/K_m值显著降低。多菌灵添加量可以通过影响土壤矿质氮含量与生物学属性从而影响土壤脲酶的动力学参数。本研究结果可以为农药多菌灵的施用对土壤氮循环与生态环境的影响提供更科学的依据。

参考文献