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土壤微生物群落在维持耕地生态多样性和生产力中发挥了重要作用，并且是保障耕地土壤生态系统能量流动和物质循环持续运行的关键所在[1]。研究表明，土壤细菌群落通常包含少数分布广泛的丰富类群和大量分布有限的稀有类群[2]。两者的分布模式往往不同，其功能形状也有较大差异[3]，且可能受到不同的控制因素或生态过程的影响[4-5]。丰富类群在生态系统生物量和碳循环中占比很大[2]，稀有类群不仅有助于维持生态系统稳定[6-7]，还参与元素循环，从而诱导更丰富的微生物代谢反应[8]。土壤稀有细菌类群对于预测生物多样性对生态系统功能的影响尤为重要[9]。因此，研究丰富和稀有类群组成对于理解土壤生态系统功能十分重要[3]。
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四川是我国的农业大省，其耕地面积占全国的 7%，农产品产量占全国的 10%[10]。紫色土坡耕地是四川盆地主要的耕地类型，占比超过 65%[11]。紫色土土层浅薄，有机质含量低，常施用粪肥以提高土壤肥力和作物产量。已有研究发现了长期施用猪粪对紫色土坡耕地土壤中微生物群落结构的影响[12]，但目前仍缺乏关于长期施肥紫色土中丰富和稀有细菌群落组成的报道。此外，细菌之间的相互作用在细菌群落构建过程中起着至关重要的作用[13]。许多报道采用共生网络分析的方法来研究丰富和稀有细菌之间潜在的相互作用[14-16]。因此，本研究采用高通量测序技术分析长期施用粪肥的紫色土坡耕地土壤中丰富和稀有细菌类群的分布特征以及两者相互作用的分子生态网络，以期为维持土壤健康和生产力提供科学指导。
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1 材料和方法
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1.1 样品采集及高通量测序
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本研究中使用的样品信息及序列数据可在课题组已发表论文[12] 中获取。测序数据已上传至美国国家生物技术信息中心（NCBI），登录号为 SRP127191。长期施肥样地位于中国科学院盐亭紫色土农业生态试验站内（31°16′N，105°27′E）。于 2016 年 9 月使用 5 点混合法采集样地中不施肥处理（CK）、单施猪粪处理（OM）、猪粪配施氮肥处理（OMN）和猪粪配施氮磷钾肥处理 （OMNPK） 的表层（0～5 cm） 土壤样品。各施肥处理方案如表1 所示，每个处理设有 3 个重复小区，共采集 12 份土壤样品。样品置于冰盒内带回实验室后使用 PowerSoil DNA 提取试剂盒提取 DNA（MoBio Inc，Carlsbad，USA）。采用引物对 515F/909R 扩增样品 16S rRNA 的 V4~V5 区，并使用 Illumina Miseq 平台对扩增产物进行测序[17]。获得的高质量序列采用 QIIME 1.9.1 进行 OTU 聚类以及物种注释。
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表1 不同处理中猪粪和化肥的施用量[12]
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1.2 数据分析
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将相对丰度高于 0.1% 的 OTUs 定义为丰富 OTUs （Abundant），而相对丰度低于 0.01% 的 OTUs 定义为稀有 OTUs（Rare）。丰富 OTUs 中，相对丰度在所有样品中均高于 0.1% 的被定义为常态丰富 OTUs （Always abundant），其余为正常丰富 OTUs（Normal abundant）。常态稀有 OTUs 和正常稀有 OTUs 的定义方式与常态丰富 OTUs 和正常丰富 OTUs 相似[18]。此外，在部分样品中相对丰度高于 0.1%，同时在部分样品中相对丰度低于 0.01% 的 OTUs 定义为条件稀有或丰富 OTUs（Conditionally rare or abundant）[19]。正常丰富 OTUs 和正常稀有 OTUs 中包括条件稀有或丰富 OTUs。
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基本的数据处理和统计分析采用 Excel 2016 进行，由于不满足正态性和方差齐次性要求，各组间α 和β 多样性以及网络拓扑特性差异采用 Kruskal-Wallis 检验、Wilcoxon 秩和检验进行分析，并使用 R 语言“ggplot2”包进行可视化。在网络分析中筛选具有鲁棒性（r>0.6，P<0.01）的相关关系用于共现网络构建，随后通过 Gephi 进行网络拓扑特性的计算[20]。
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2 结果与分析
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2.1 丰富和稀有细菌的数量和丰度
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本研究共得到 602 个丰富 OTUs 和 5786 个稀有 OTUs，分别占总 OTUs 的 9.7% 和 93.4%，其中有 286 个 OTUs 为条件稀有或丰富 OTUs。样品中存在 35 个常态丰富 OTUs，占丰富 OTUs 的 5.8%，但并不存在常态稀有 OTUs（图1a）。每个样品中平均仅有 5.4% 的 OTUs 被定义为丰富 OTUs，但其相对丰度较高，平均约为 40%。稀有 OTUs 的数量相对较多，均值为 58.8%，但其平均相对丰度仅为 12%（图1b）。门水平上，两类细菌的群落组成差异不大，但稀有细菌（33）比丰富细菌（11）包含更多的分类群（图1c）。
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2.2 丰富和稀有细菌的α 多样性和β 多样性
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如图2 所示，稀有细菌的 Shannon 指数和 BrayCurtis 差异指数均高于丰富细菌，表明稀有细菌群落的α 多样性和β 多样性都更高。不同处理间稀有细菌的 Shannon 指数有显著差异，其中以 CK 处理最高，OM 处理最低（图2a）。但施肥并未影响丰富细菌的α 多样性。对于β 多样性，丰富和稀有细菌在不同处理间均存在显著差异，且两者对施肥处理的响应相似，表现为 OMNPK>OM>OMN>CK （图2b）。
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2.3 丰富和稀有细菌的共发生模式
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采用网络分析研究了细菌 OTUs 之间的相互作用，在该分析中将条件稀有或丰富 OTUs 单独析出，结果表明网络图共包括 6192 个节点，其中 Rare OTUs、Abundant OTUs、CRA OTUs、Null 占比分别为 88.8%、5.1%、4.6%、1.5%（图3）。分别对各施肥处理构建子网络，并计算子网络的拓扑特性，结果如表2 所示。OMN 处理样品网络的边、平均度、度中心性和图密度的指数最高（表2）。本研究进一步评估了不同施肥处理中丰富和稀有细菌的节点拓扑特性（图4）。结果发现，稀有细菌的度和特征向量中心性都高于丰富细菌，但中介中心性和接近中心性均以丰富细菌更高。
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图1 土壤中丰富和稀有细菌 OTUs 的分布及组成
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注：图1c 中仅列出了丰度前十的菌门类名称，其余菌门被归为 Others。
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图2 不同施肥处理下的丰富和稀有细菌群落的α 多样性和β 多样性
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注：* 表示 P<0.05。
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图3 整体土壤群落的共发生网络分析
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注：根据不同类群着色，节点大小表示 OTUs 在网络中的度的大小。Rare OTUs：稀有 OTUs；Abundant OTUs：丰富 OTUs；CRA OTUs：条件稀有或丰富 OTUs；Null：不属于任何类群的 OTUs。
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图4 不同施肥处理下丰富和稀有细菌的节点拓扑特性比较
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注：**** 表示 P<0.0001。
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3 讨论
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3.1 丰富和稀有细菌的分布模式
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了解不同施肥处理对土壤微生物群落的影响十分重要。已有研究发现施用化肥、有机肥以及二者配施会改变微生物生存的环境条件，从而直接或间接影响土壤微生物区系[21]。Wan 等[22]也表明施肥会影响土壤中细菌群落的组成。先前的研究已经证明施加猪粪显著改变了紫色土坡耕地土壤中的细菌群落结构[12]。本研究进一步分析了不同施肥处理土壤的丰富和稀有细菌类群之间是否存在差异。结果表明，OM 处理的稀有 OTUs 数量最高，CK 处理的最低，但不同处理间丰富细菌的数量基本没有差异（图1b）。对于相对丰度，不同处理间丰富类群的丰度变化相对较为明显，其变化趋势与稀有类群的数量变化相似（图1b）。因此，施肥处理主要对稀有 OTUs 的数量以及丰富 OTUs 的相对丰度产生影响，其中 OM 处理的影响较大，但另外 2 种混施处理并不显著。
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本研究中稀有 OTUs 分布在 33 个菌门，而丰富 OTUs 仅为 11 个，说明稀有细菌群落可能具有更多的代谢功能多样性（图1c）。根据保险假说，丰富的功能多样性可以确保生态系统能够更好地响应外界干扰并恢复[23]。因此，紫色土中稀有细菌可能在维持生态系统的稳定以及功能多样性上发挥重要作用，这与焦硕[20]、黄玲玲[24]的研究结果保持一致。变形菌门（Proteobacteria）内的物种可促进氮肥利用、修复土壤和降解复杂污染物等；放线菌（Actinobacteria）可对植物产生良好的促生作用[25]；蓝细菌（Cyanobacteria）是生物固氮的主要贡献者[26]。尽管稀有类群具有高分类学多样性，但其对整体群落的丰度贡献很小（图1b）。因此，丰富细菌在上述功能上发挥了更多的效用。
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3.2 丰富和稀有细菌的群落多样性
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生态系统的稳定性取决于物种的多样性[27]，而不同类型的物种又占据着不同的生态位[2]。本研究发现稀有细菌类群比丰富细菌类群拥有更高的α多样性和β多样性（图2），这与之前的研究结果一致[9，24，28-29]。该结果表明在生境内多样性上稀有类群占据主导位置[30]，但其群落的波动性也会更大[9]。相对于 CK，施肥处理会降低细菌群落的α 多样性，稀有群落的结果较为显著，降低的原因可能是肥料的施用带入了重金属等物质，其对土壤微生物的生长产生了抑制作用[31]。其中 OMN 处理高于 OM 处理，但 OMNPK 与 OM 处理无较大差异。研究表明，土壤细菌群落的 Shannon 指数会随着土壤的酸碱性变化，越靠近中性指数越高[21]，此前研究结果的 pH 值也证实了这一点[12]。此外，施肥处理提高了土壤细菌群落的β多样性。较大的环境差异（盐度、氧气、温度）会导致较高的β多样性[32]。OM 处理虽高于 OMN 处理，但其差异性较小。OMNPK 处理可能是引发了环境因子的变化，导致其β多样性显著高于其他处理。而试验过程中，丰富和稀有细菌群落所处的环境条件是相同的，因此两者β多样性差异的形成可能是由于新物种迁移造成的[20，28，33]。
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3.3 丰富细菌的核心生态地位
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研究发现群落中微生物分类群之间存在复杂的相互作用网络[13]，对其进行共现网络分析有助于揭示不同微生物子群落的生态地位以及潜在关系[15，34]。本研究对整体以及不同施肥处理下的子群落分别进行了网络分析。结果发现，虽然网络中的大多数节点是稀有细菌，但丰富细菌处在网络更中心的位置（图4c），这与先前的研究类似[9，18，28，35-36]。因此，对于一个良好的生态系统环境而言，丰富和稀有细菌都是不可或缺的存在。此外，网络中的微生物之间的关系可借助网络的拓扑性质来解释[37]。网络的边、平均度和图密度越高，表明该网络的节点连接更多且更紧密。度中心性越大，表示该网络影响力越大[38]。高模块化分数表明网络具有复杂的内部结构。4 个处理中，OMN 处理的网络拓扑属性值大都最高（表2），OMNPK 次之，说明混施肥料的土壤细菌群落之间有更密切且更复杂的联系，其子群落的生态系统相对更加稳定[39]。
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4 结论
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本研究通过对紫色土坡耕地土壤细菌群落进行丰富和稀有类群的划分，研究了其内部细菌群落的组成、多样性以及不同施肥处理对 2 种细菌群落的影响。在该土壤生态系统中，稀有细菌类群在维持系统稳定以及功能多样性上做出了更高的贡献，但丰富细菌才是位于核心生态位的类群，可能在群落中发挥主要功能。施肥对 2 种细菌群落的组成基本没有产生影响。相较于另一细菌群落，不同施肥处理间稀有细菌群落的α 多样性以及丰富细菌群落的β 多样性表现出更明显的波动。这些结果揭示了长期施肥紫色土坡耕地土壤中丰富和稀有细菌的分布及其生态意义，促进了对其生态系统群落更深层次的理解。
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摘要
土壤微生物组可分为丰富和稀有类群，其组成与土壤生态系统的健康及功能息息相关。对长期施用粪肥紫色土坡耕地土壤中丰富和稀有细菌群落的组成进行分析，结果表明：稀有细菌的数量、α 多样性指数和β 多样性指数均高于丰富细菌。门水平上稀有细菌比丰富细菌包含更多的分类群，说明两者的分类组成存在明显差异。施肥处理分别对稀有类群的数量和丰富类群的丰度产生了影响。网络分析显示少数丰富细菌占据了网络的中心节点，表明其在土壤细菌生态网络中的核心地位。这些结果有助于理解长期施肥耕地土壤中细菌群落组成及其生态网络。
Abstract
Soil microbiome can be divided into abundant and rare groups，and their composition is closely related to the health and function of soil ecosystem．In this study，the composition of abundant and rare bacterial communities in hilly cropland of purple soil with long-term manure application was analyzed. The results showed that the number，α diversity index andβ diversity index of rare bacteria were higher than those of abundant bacteria．At the phylum level，rare bacteria contained more taxa than abundant bacteria，indicating that there were obvious differences in taxonomic composition between them．Fertilization treatments affected the number of rare groups and the abundance of abundant groups，respectively．Network analysis showed that a small number of abundant taxa occupied the central node of the network，indicating its core position in the soil bacterial ecological network．These results are helpful to understand the composition of bacterial community and its ecological network in hilly cropland of soil with long-term fertilization.
Keywords
purple soil ； abundant bacteria ； rare bacteria ； network analysis ； co-occurrence pattern