砒砂岩主要分布在高原丘陵地区，因其粗粉粒含量大，土壤中缺乏粘粒使其结构及稳定性降低，抗腐蚀性减弱^[1-2]。调查显示，砒砂岩土壤 pH 值处于第六级，属于碱性土壤，微生物难以生存，土壤总体养分含量非常低，植物很难从土壤中获取营养元素^[3]。目前，砒砂岩的治理主要是通过砒砂岩土壤复配，种植人工植被防沙固土以及建设支流坝系等物理工程措施方法^[4-5]。微生物在土壤生态系统中发挥着重要作用，因此许多学者已经开始利用微生物修复技术来治理砒砂岩的土壤问题。

芽孢杆菌作为植物促生菌在促进植物生长、改善土壤质量和微环境上发挥着重要的作用，且芽孢杆菌具有超强的耐受性，在抵御外界环境胁迫方面具有较好的优势。目前，已经有学者通过促生芽孢杆菌与基质复配来改良砒砂岩，发现菌剂能够显著改善土壤肥力并促进植物生长^[6]。王涛等^[7]利用 4 种植物促生芽孢杆菌制成单一菌剂与复合菌剂并应用于砒砂岩土壤，施用后发现复合菌剂能够显著增加紫花苜蓿和柠条的生物量，提高土壤团聚体水稳性。曾仟等^[8]通过植物促生芽孢杆菌 P75 与腐殖酸配施能够显著改善土壤的理化性质及土壤肥力，促进黑麦草的生长及其抗逆性。而目前应用于砒砂岩修复的菌株多是具有产吲哚乙酸（IAA）、铁载体等促进植物生长特性，但砒砂岩土壤的盐碱性强、持水能力差，因此筛选出能够耐受高盐碱度的菌株有望更好适应砒砂岩环境。

聚谷氨酸是一种高分子多肽聚合物，存在大量游离亲水性羧基和氢键，使其具有较强的保水能力、絮凝性等，能够改善黏质土壤的膨松度及孔隙度、砂质土壤的持水持肥能力^[9]。在农业上，聚谷氨酸能够促进植物对营养物质的吸收，提高基质养分有效性，增产提质^[10]，作为肥料增效剂既能促进植物生长，又能达到肥料减量的效果。史文娟等^[11]通过外源施用聚谷氨酸发现其可以增强土壤持水能力，改变土壤水分分布剖面形态。目前，使用聚谷氨酸对土壤进行改良已取得了一定的成果，主要应用于盐碱土壤、干旱土壤和重金属污染土壤等^[9]。但目前国内外对于直接利用产聚谷氨酸芽孢杆菌发酵液来改良砒砂岩土壤还未见大量研究报道。

本研究从不同土壤样品中分离筛选聚谷氨酸产量较高且耐盐耐碱的芽孢杆菌，通过施用菌株发酵液的盆栽试验，探究其对砒砂岩土壤中黑麦草生长和土壤改良作用，从而为聚谷氨酸产生菌改良砒砂岩土壤提供理论依据及基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试土壤：砒砂岩土壤（内蒙古鄂尔多斯）、黄棕壤（江苏南京）、盐碱土（山东滨州）。

LB 培养基：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl10.0 g，蒸馏水 1 L，pH=7.0。固体培养基需再添加 20.0 g 琼脂。

分离培养基：葡萄糖 10.0 g，酵母膏 5.0 g，L-谷氨酸钠 5.0 g，KH₂PO₄·3H₂O 0.5 g，CaCl₂ 0.2 g， MgSO₄ 0.1 g，琼脂 20.0 g，蒸馏水 1 L，pH=7.5。

种子培养基：葡萄糖 20.0 g，酵母膏 5.0 g，L-谷氨酸钠 10.0 g，NaCl5.0 g，MgSO₄ 0.25 g，K₂HPO₄· 3H₂O2.0 g，MnSO₄·H₂O0.03 g，蒸馏水 1 L，pH=7.5。

发酵培养基：葡萄糖 40.0 g，L-谷氨酸钠 40.0 g，MgSO₄ 0.3 g，K₂HPO₄·3H₂O 2.0 g，MnSO₄0.03 g，（NH₄）₂SO₄ 10.0 g，蒸馏水 1 L，pH=7.5。

盆栽土壤：内蒙古鄂尔多斯市准格尔旗 109 国道道路边坡的风化砒砂岩土壤；生物炭，购自富华纳米新材料有限公司。

供试植物：黑麦草（Lolium perenne），种子购自江苏省农业科学院种子站。

1.2 产聚谷氨酸的耐盐碱芽孢杆菌的筛选

1.2.1 产聚谷氨酸芽孢杆菌初筛

称取 20 g 土样于摇瓶中，再加入 10% 的 NaCl 混匀，置于 30℃培养箱温育 30 d。分别取 10 g 温育后的土样加入已灭菌的 90 mL 无菌水摇瓶中，煮沸 5～10 min 后 180 r/min 充分振荡 30 min，再用无菌水进行梯度稀释，取 100 μL 稀释梯度为 10^-2、 10^-3、10^-4、10^-5 和 10^-6 的土壤悬液涂布于分离培养基上，30℃培养 2 d。挑出生长快、表面光滑黏稠且拉丝的单菌落再次进行划线分离纯化，将纯化后的菌株接种到 LB 斜面固体培养基上，4℃保存。

1.2.2 菌株耐盐碱能力检测

将分离纯化的菌株分别接种到 NaCl 浓度为 10%、12%、13%，pH 10、11 的固体 LB 平板上，30℃ 培养 1～2 d，挑取在以上盐碱度上生长的菌株。将上述菌株再次接种到 NaCl 浓度 10% 和 pH 10、NaCl 浓度 12% 和 pH 10 的复合 LB 琼脂培养基上，30℃ 培养 3～5 d，观察菌株生长情况，以是否生长作为耐盐碱能力判定，挑选耐盐碱芽孢杆菌。

1.2.3 菌株产聚谷氨酸能力

参考 Bai 等^[12]的方法并作适量改进。将上述筛选到的产聚谷氨酸耐盐碱的菌株接种到 50 mL 种子培养基富集培养 16 h，以 2% 的接种量接种到 50 mL 发酵培养基中，30℃、180 r/min 振荡培养 72 h，将发酵液置于 12000 r/min 离心 20 min，取上清液加入四倍体积的预冷无水乙醇，过夜沉淀，离心收集沉淀物，再加入等体积的无菌水溶解，透析过夜，与配制好的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 的 NaOH 溶液（5% 的 CTAB 溶于 8%NaOH）混合静置，观察是否有絮状物产生来快速判断能否产聚谷氨酸，离心收集絮状沉淀并称重，作为聚谷氨酸产量。

1.3 菌株的生物学特性测定

细菌产 IAA 检测参考 Jiang 等^[13]的方法；铁载体检测采用 Payne^[14]的方法，按照陈伟等^[15]的方法计算其相对活性；溶磷量测定参考刘文干等^[16] 的方法。

溶血性测定：将供试菌株接种在血琼脂平板上，30℃培养 24 h，若菌落周围有清晰的环带出现，则表明有溶血现象。

细菌菌落形态：将供试菌株分别接种在 LB 固体培养基及分离培养基上，30℃培养 24 h，肉眼及电子显微镜观察细菌菌落形态并拍照。

1.4 基于 16S rDNA 序列分析的菌株鉴定

提取菌株总 DNA 作为模板，采用通用引物进行 PCR 扩增 16S rDNA，扩增程序为 95℃ 预变性 10 min；94℃变性 1 min，55℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，30 个循环；72℃最后延伸 10 min。将凝胶电泳显示具有明亮单条带的扩增产物测序，序列经 BLAST 比对，通过 MEGA-X 构建系统发育树。

1.5 菌株对黑麦草生长的影响

布置盆栽试验，每盆装入 200 g 过 2 mm 筛的砒砂岩土壤，除对照外，其余土壤均以 10% 的体积比加入生物炭并混匀。试验分 4 个处理组，分别是未接菌处理组（CK）、未接菌加生物炭处理组 （SCK）、YF20 发酵液加生物炭处理组（YF20）、 YG35 发酵液加生物炭处理组（YG35），每个处理设置 3 个重复。选取饱满、大小一致的黑麦草种子，用 5% 的 H₂O₂ 消毒 10 min，用去离子水反复冲洗多次后，分别以发酵液浸种约 2 h。每盆均匀铺洒黑麦草种子，接种 1∶1 稀释的发酵液 30 mL，对照接入等体积的无菌培养基，表面盖薄土。种子萌发 10 d 后间苗，每盆留生长一致的苗 30 株，每日浇水。30 d 后收获黑麦草，称取地上部鲜重，测量株高。

1.6 菌株对砒砂岩土壤的改良作用

将 30 d 盆栽试验结束后的砒砂岩土壤进行理化指标测定。

土壤中多糖含量采用硫酸-苯酚法^[17]；参考《土壤农化分析》^[18]，采用重铬酸钾容量法－ 稀释热法测量土壤中有机质的含量；采用 0.5 mol/L NaHCO₃ 浸提－钼锑抗比色法测量土壤中有效磷的含量；采用 NH₄OAc 浸提－火焰光度法测定土壤中速效钾的含量；土壤阳离子交换量采用氯化钡置换法^[19]；土壤蔗糖酶及脲酶活性参考《土壤酶及其研究法》^[20]进行测定。

土壤渗水率测定：在装有 70 g 砒砂岩土壤的盆钵下方放置培养皿，取 50 mL 水缓缓倒入，5 h 后测定培养皿中渗水体积，计算渗水率。

土壤保水率的测定参考于江姗等^[21]的方法并做适量改进：在含有 70 g 砒砂岩土壤的盆钵中喷入 30 mL 的水，每隔 24 h 测定其含水量。

土壤 pH 测量：取 10 g 土壤加入 25 mL 去离子水，180 r/min 振荡 2 h，12000 r/min 离心 10 min，取上清液测定 pH 值。

1.7 数据处理与统计分析

所有试验数据均采用 Excel 2016 及 GraphPad Prism 8.0.2 作图，使用 SPSS 25.0 进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 耐盐碱菌株的筛选

根据产聚谷氨酸菌株的菌落表面湿润黏稠、流动性好、能拉丝等特性，从砒砂岩土壤、盐碱土、黄棕壤中分离得到 35 株菌，对其分别进行耐盐能力和耐碱能力测定。随着 NaCl 浓度增加，仅有 YF25、YF27、YF29、YG35 4 株细菌能够在 NaCl 浓度 13% 的培养基生长，而菌株 PY2、YF19、YF20、 YF23～29、YG31、YG35 均能在 NaCl 浓度 12% 培养基上生长。pH 为 9 的条件下，所有菌株都能生长；在 pH 为 11.0 的条件下多数菌株能生长，包括 PY5、PY6、QX10、QX11、YF19、YF20、YF23~25、 YF27、YF29、YG33、YG35。

根据上述测定结果选取了 12 株菌进行耐盐碱复合试验，如表1 所示。当 NaCl 浓度为 10%、pH为 10.0 时，菌株 PY6、YF23、YF25、YF27、YF29、 YG35 可以生长；而当 NaCl 浓度为 12%、pH 为 10.0 时，只有菌株 YG35 生长良好，其他菌株均无法生长。

综合菌株生长速度，菌落特性及耐盐碱能力各项指标，选取 YF20、YF27、YF29、YG35 4 株菌继续下一步试验。

注：+ 指菌株能生长；-指菌株不生长。

2.2 聚谷氨酸产量测定

将供试菌株进行发酵培养，分别在 24、48、72 h 时测定聚谷氨酸产量，对不同发酵时间收集的絮状沉淀进行离心并称重。随着发酵时间增加，聚合物湿重变大，当发酵时间为 72 h 时，供试菌株均达到最大聚谷氨酸产量，其中 YF20 产量最高，聚合物湿重约为 0.15 g/mL，YG35 次之，产量约为 0.12 g/mL（图1）。

注：不同小写字母表示不同处理间有显著差异（P<0.05）。图4、5、6、7 同。

2.3 供试芽孢杆菌的生物学特性

因后续试验重点在聚谷氨酸改良砒砂岩土壤，通过聚谷氨酸产量、耐盐碱能力及生长速率等综合分析后，选取产量较高的两株细菌 YF20 和 YG35 作为供试菌株，其促生特性如表2 所示，两株菌溶磷量可达 95 mg/L 以上，IAA 产量为 4.70～7.63 mg/L，其中，YG35 能产微量铁载体。在分离培养基上，菌株菌落呈不透明乳白色，倒置平板菌落中心有明显倒挂液滴，流动性较强 （图2）。LB 培养基上菌落为乳白色，较干燥，其中 YF20 菌落在生长后期会呈现淡黄色。革兰氏染色镜检发现两株菌均为杆状革兰氏阳性菌。

通过 MEGA-X 构建菌株的系统发育树如图3 所示。菌株 YF20 与 Bacillus zanthoxyli strain1433 相近，同源性可以达到 99.51%，鉴定为花椒芽孢杆菌，YG35 与 Priestia megaterium 同源性可以达到 99.51%，鉴定为普利斯特氏芽孢杆菌。

注：溶血能力：无-；有 +。

2.4 供试菌株对黑麦草的影响

与 CK 相比，添加生物炭基质后均能显著影响黑麦草的生长，其鲜重显著增加 43%～90%，株高显著增加 17%～34%（P<0.05）。与 SCK 处理相比，YG35 处理能分别显著增加黑麦草鲜重和株高 33% 和 15%；YF20 处理显著增加黑麦草株高 8%，结果表明，YG35 发酵液的施用更有益于改善黑麦草的生长。

2.5 供试菌株对砒砂岩土壤的影响

2.5.1 供试菌株对土壤酶活性、有机质含量、多糖含量、有效磷含量及速效钾含量的影响

如图5 所示，与 CK 相比，各处理均能显著提高土壤蔗糖酶活性 21%～42%，脲酶活性 28%～49%。与 SCK 处理相比，接种菌株 YF20 和 YG35 均能显著增强土壤蔗糖酶活性 17%，脲酶活性分别约 16% 和 13%。如图6 所示，CK 处理组土壤各项肥力指标均较低，各处理能使多糖含量增加 75%～145%，有机质含量增加 138%～193%，有效磷含量增加 156%～235%，速效钾含量增加 5.6%～7.9%。与 SCK 处理相比，菌株 YF20 与 YG35 能够显著增加土壤有机质含量 15%～23%；接种菌株 YF20 对土壤多糖含量、有效磷含量无显著影响（P>0.05），但可显著增加土壤速效钾含量约 7.5%；接种菌株 YG35 能使土壤多糖含量显著增加 40%，有机质含量增加 23%，有效磷含量增加 31%，速效钾含量增加 9.7%。表明添加生物炭、生物炭与发酵液复合使用均能增加土壤酶活性、有机质含量、土壤多糖、有效磷和速效钾含量，另外，两株菌对改善砒砂岩土壤肥力效果不同，YG35 更有利于增强砒砂岩土壤肥力。

2.5.2 供试菌株对土壤 pH 和阳离子交换量的影响

如图7 所示，与 CK 相比，各处理均能降低砒砂岩土壤 pH，提高土壤阳离子交换量 4.5%～12%。与 SCK 处理相比，接种菌株 YF20 与 YG35 均能够显著降低砒砂岩土壤 pH 0.1～0.2 个单位，显著提高土壤阳离子交换量 6.2%～7.2%，且两处理之间并无显著性差异（P>0.05）；结果表明，施用发酵液会进一步改善土壤 pH 和增加土壤阳离子交换量。

2.5.3 供试菌株对土壤渗水率、保水率的影响

如表3 所示，与 CK 相比，各处理均能显著提高土壤保水率 3.5%～5.8%，渗水率减少 10.51%～13.25%。与 SCK 处理相比，两处理均能显著减少土壤渗水率 2.74%～3.63%；接种菌株 YF20 能显著提高土壤保水率约 2.2%，而接种菌株 YG35 与 SCK 相比并无显著差异（P >0.05）。结果表明，添加生物炭基质可以有效提高砒砂岩土壤的持水能力，而再接种菌株 YF20 发酵液对改善砒砂岩土壤的持水能力具有更显著的效果。

注：不同小写字母表示不同处理间有显著差异（P<0.05）。

3 讨论

砒砂岩土壤通常存在于高原地区，由于其土壤肥力较差，水分流失严重，植物无法生长，严重制约着我国农业及畜牧业的发展，因此改良砒砂岩土壤至关重要。聚谷氨酸含有较多的亲水基团，具有极好的保水能力，有利于改善土壤持水持肥能力。有研究表明外源添加聚谷氨酸能够提高作物对水分的利用率，促进植物的生长并提高作物产量^[22-23]，但直接利用聚谷氨酸产生菌来改良砒砂岩土壤还鲜有报道。因此，利用产聚谷氨酸的耐盐碱芽孢杆菌来减少土壤中水分、养分流失，提高土壤肥力，促进植物生长，有望对砒砂岩区水土流失起到一定防治作用。

本研究从 3 种不同土壤中分离筛选出两株具有不同生物学特性的耐盐碱聚谷氨酸产生菌，通过盆栽试验发现，YG35 能够显著促进黑麦草生长，主要由于其能够分泌大量铁载体及 IAA 等促植物生长激素，所以在本试验中促生效果更好。YF20 因聚谷氨酸产量较高，在改善土壤持水能力上效果更好。

土壤 pH 是衡量土壤酸碱度的标准之一，与土壤肥力评价密切相关。接种菌株 YF20 及 YG35 发酵液均能降低砒砂岩土壤 pH，推测是两株菌产生的聚谷氨酸分解产生的大量弱酸性羧基官能团及其在其各种生理活动过程中可能会产生大量有机酸，同时还能够刺激黑麦草根系产生部分酸性物质^[23-24]，从而降低砒砂岩土壤 pH，而有机质含量及阳离子交换量的增加被认为是缓解土壤过度酸化的缓冲剂，其中阳离子交换量贡献程度最大^[25]，这也是本试验土壤未过度酸化的原因之一。

有机质、有效磷、速效钾、阳离子交换量及酶活性等是评价土壤肥力的重要指标^[18]。本研究 3 个处理均添加了生物炭，其原因是由于砒砂岩土壤较贫瘠，植物难以正常生长，而生物炭既可以作为基质，又可以作为生物有机材料提高土壤质量^[26]。本试验结果表明只施加生物炭能够改善土壤肥力，而生物炭与菌株 YF20 及 YG35 发酵液配施在改善砒砂岩土壤、提高土壤肥力上效果更显著。主要原因是接菌处理后微生物生物量、微生物代谢产物及微生物残留物的增加促进了有机质的增加^[27]，同时聚谷氨酸的产生也增加了土壤中有机物质的分解^[28]。相关研究发现，蔗糖酶和脲酶活性与土壤中可吸收利用的有效营养物质含量正相关，可以促进土壤中碳转化及含氮有机化合物的分解^[29]，与本试验结果相符。施用保水剂有利于增加土壤磷素和钾素的利用率并加速有机物质的分解^[27，30]。本试验结果中，与菌株 YG35 相比，施用聚谷氨酸产量高的菌株 YF20，其土壤中有效磷和速效钾及有机质含量略低，推测是由于聚谷氨酸含量的增多促进了植物对土壤养分的利用。

有机质含量越丰富的土壤，其保水性和保肥能力越好^[31]，而阳离子交换量与土壤有机质含量及理化性质呈显著正相关^[32]，表明土壤阳离子交换量与土壤水分入渗率具有相关性。本试验中，接种 YF20 能够显著提高砒砂岩土壤的阳离子交换量和有机质含量，这可能就是能够增加土壤保水能力，减少其渗水率的原因之一。另外，与前人研究结果相比^[7-8]，两株菌在增加土壤有机质含量上效果显著，土壤改良效果总体优于复合菌剂处理，但不及腐殖酸与菌株配施。其原因可能是供试菌株产生的 IAA 等次生代谢产物量较少，侧面说明了聚谷氨酸在改善砒砂岩土壤持水能力上发挥着重要作用。今后的研究重点可能在如何增加菌株聚谷氨酸产量方面，使其更有利于改良砒砂岩土壤和促进植物生长。

4 结论

接种菌株 YF20 及 YG35 均能够增加黑麦草生物量及株高，促进黑麦草的生长，改善砒砂岩土壤理化性质，增加土壤肥力及持水能力。其中接种菌株 YF20 在改善砒砂岩持水能力上更为显著，接种菌株 YG35 在改善土壤肥力和促进植物生长上表现出更好的作用。

参考文献