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微生物广泛分布于生物圈的各个角落，是地球上生物量最大、进化历史最长、多样性最丰富的生命形式。提取环境样品中所有微生物的基因组 DNA，进行 16S rRNA 基因测序和序列比对分析结果发现，有大量的序列与已获得纯培养菌株的 16S rRNA 基因亲缘关系较远，被认为代表了尚未培养或难培养的微生物，其中有的在分类上属于全新的科、目，甚至没有培养代表的门[1-2]。有研究分析认为，目前能够被培养和分类的微生物不到总量的 1%[3-4]，主要原因是不同种微生物的丰度、营养和理化环境需求、生长速度等方面存在较大差异，人类对微生物生长条件的认识还非常有限，培养基营养组分、接种量、分离方法、培养时间等的不同均可导致某些种类的特异性分离而遗漏其他的种类，目前的技术很难获得复杂环境中所有的纯培养菌株。土壤、海洋、人体、动物和植物等复杂环境中的未培养或难培养微生物具有潜在巨大的理论与应用价值，一直是微生物学研究中的重要内容之一[5]。
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土壤是微生物的大本营，微生物的种类和功能多样性非常丰富。土壤中（尤其是植物根际土壤中）的微生物群落结构及组成对植物生长发育、适应环境和抵御土传病原菌的侵染有重要影响，在植物根组织内、根组织上或根组织周围生长着一些可以直接或间接促进植物生长的细菌，称为根际促生细菌（PGPR）。在 PGPR-宿主植物互作过程中，植物获得的益处包括促进生长、抗病和抗非生物胁迫[6-7]。PGPR 直接促进宿主植物生长的主要机制有：（1）产生 ACC-脱氨酶以降低发育中植物根系中的乙烯水平；（2）生产植物生长调节剂，如生长素、赤霉素、细胞分裂素和某些挥发物；（3） 固氮，促进磷、钾、铁等矿质元素的获取。间接促进生长主要与生物防治相关，一些 PGPR 通过诱导植物系统抗性、干扰细菌群体感应等来增强对植物病原微生物的拮抗活性。有的 PGPR 可能使用一种以上的机制来促进植物生长[8]。16S rRNA 基因扩增子高通量测序技术分析结果显示，在同一块田中健康植株和发病植株周围土体及根际土壤细菌群落结构和组成均有明显差异，深入认识健康植株根际土的微生物组成，调控土壤微生物区系，可以有效防控土传病害，还可以改善土壤的理化性质和营养状态[9]，在实现绿色和可持续农业目标上很有潜力[10]。由于微生物肥料在农作物种植中可以发挥节肥、减药、促生长等重要作用[11]，经过几十年的发展，微生物菌肥已迈入一个新阶段，具有一定的市场规模，截至 2020 年 10 月 21 日，我国获得微生物肥料登记证的产品有 7608 个，生产企业有 2852 个[12]。
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番茄为茄科番茄属一年生或多年生草本植物，果蔬两用，栽培品种多样，在我国广泛种植。据农业农村部蔬菜生产农情监测项目统计，2018 年我国番茄栽培面积 110.9 万 hm2，鲜食番茄产量稳居世界第一，加工番茄产量位居世界第二或者第三[13]。然而，长期连作和化肥农药的大量施用导致土壤结构破坏、养分失调、酸化和微生物群落组成显著变化等[14]，番茄青枯病、枯萎病等土传病害日益严重[15]，这些都制约了番茄产业的可持续发展。目前，已经从番茄根际土壤中分离获得的对青枯病有较好抑制作用的细菌有芽孢菌属（Bacillus）、地芽孢杆菌属（Geobacillus）、多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）、黄杆菌属 （Flavobacterium）、松江菌属（Mitsuaria）、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）等[16-17]。施用微生物菌肥和菌剂能促进番茄植株生长，增加番茄产量，提高果实品质，同时还显著提高土壤孔隙度和养分含量[18-19]。
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微生物资源的纯培养物是构建根际益生菌群落的基础，分离培养获得作物根际土中新的微生物资源，对构建理想植物益生菌群落有重要意义。调整培养条件是获得新微生物资源的有效途径[20]，一些研究者通过调低营养物质配比、增添特定化合物、改变培养温度或时间[21-22]，结果获得一些新的细菌种类。在低有机营养培养基上，由于营养物质供给严苛，细菌普遍生长较慢，从而给更多种类细菌的生长提供了机会，更容易分离获得尚未获得纯培养的种类。例如，Janssen 等[23]研究发现，适当降低培养基营养成分，可提高土壤中变形杆菌、放线菌、嗜酸性细菌的可培养性。本研究从培养基有机营养、无机营养、抗氧化物质和凝固剂等方面进行了调整，探究从番茄植株根际土中分离培养细菌资源的方法。
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1 材料和方法
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1.1 土壤样品及培养基
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土壤样品采自湖南省长沙市蔬菜研究所高桥实验基地，为抗病品种 H7996 移栽 1 个月后健康植株根际土。基于文献已经有的培养基配方，本研究从凝固剂、有机营养、无机盐、环境因子和抗氧化剂角度进行了调整和组合，设置了 2 组共 8 种培养基（表1）。MS 为含有维生素的 Murashige &Skoog 无机盐培养基（美国 Caisson labs 生产）；TSB 为胰蛋白大豆肉汤琼脂培养基；R2A（含琼脂）为常用的微生物培养基（美国 BD 公司生产）；土壤浸提液（SE）制备程序是称取 100 g 土样于研钵中，研磨均匀，加入到 1000 mL 蒸馏水中，充分振荡摇匀，静置 30 min 后过滤，上清液再用蒸馏水定容至 1000 mL。丙酮酸钠培养基是在低有机营养的无盐培养基中添加丙酮酸钠至终浓度为 1.5 g/L[24]。培养基 pH 7.2，灭菌条件为 0.1～0.15 MPa、121℃维持 20 min。用于从土壤中分离培养细菌时，为抑制真菌的生长，倒平板前加入制霉菌素至终浓度为 50 mg/L[15]。
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1.2 菌株的分离培养、纯化和保存
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称量土壤样品 10 g 于无菌研钵中捣碎，加入含 90 mL 无菌水的锥形瓶中，充分振荡 30 min，得到浓度为 10-1 的土壤悬浊液。采用无菌水对悬浊液进行 10 mL 体积的梯度稀释，制得浓度为 10-4、 10-5、10-6 的悬浊液。取 200 μL 悬浊液涂布接种于培养基平板上，于 28℃恒温培养箱中倒置培养。 4 周后统计菌落数，并根据菌落大小、色泽、表面和边缘特征对菌落进行分类。根据每类菌落的数量按比例随机挑取菌落进行划线纯化，直至出现均匀的单菌落。挑单菌落接入培养基斜面，待斜面上形成明显菌苔后加入 2～3 mL ddH2O，充分振荡制成菌悬液。取菌悬液 100 μL 与等量的无菌 50% 甘油溶液于冻存管中混匀，放到-80℃ 保存。
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1.3 菌株的分类鉴定
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挑取单克隆于装有 30 μL 无菌水的离心管中，沸水浴 10 min，冷却至室温后，转到-20℃冰箱冷冻 30 min，取出融化后即为粗制 DNA 溶液。用细菌通用引物 27 F 和 1492 R 扩增 16S rRNA 基因。PCR 扩增体系为 25 μL：粗制 DNA 溶液 2 μL， 2×Taq PCR Mix 12.5 μL，27F（10 μmol/L）1 μL， 1492R（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 扩增程序为：94℃预变性 3 min；94℃变性 30 s， 55℃退火 30 s，72℃延伸 150 s，30 个循环；72℃ 终延伸 10 min。PCR 扩增产物于 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，对于出现大小 1500 bp 左右、条带清晰的样品送往北京生工物工程公司进行测序。将测序得到的序列上传到 Ezbiocloud（https：//www.ezbiocloud. net/identify）进行序列比对，并提交至 GenBank 数据库以获得序列号。菌株序列用 MEGA 7.0 中的 Neighbor-Joining 方法来构建系统发育树，并分析菌株亲缘关系。
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2 结果与分析
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2.1 培养基凝固剂和有机营养对土壤细菌分离培养的影响
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培养基平板在 28℃温箱中培养 4 周后，10-4 稀释度样品菌落数大于 300 个 / 皿，所以后面只用 10-5 和 10-6 稀释度样品进行统计和挑取菌落。 MS+TSG 和 MS+TSA 营养成分相同，凝固剂分别为结冷胶和琼脂，在稀释度为 10-5 或 10-6 时 MS+TSG 平板上菌落数比 MS+TSA 上的分别高出 22.87% 和 36.11%（表2），两者差异达显著水平（P<0.05）。此外，结冷胶培养基较透明，有利于进行菌落计数和形态特征观察（图1）。为了抑制真菌生长，需要在倒平板前将抗真菌药物加入培养基中。由于浓度为 1% 的结冷胶比浓度为 1.5% 的琼脂凝固点高得多，在加入相同浓度制霉菌素条件下，琼脂平板上基本无真菌污染，而结冷胶平板上有较多真菌生长（图1），说明用结冷胶作凝固剂时需更耐热的抗真菌药物。
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MS+TSA 和 MS+R2A 凝固剂均为琼脂，有机营养不同。接种的悬浊液浓度分别为 10-5 和 10-6 时， MS+R2A 平板上的菌落数较 MS+TSA 上的分别高出 32.02% 和 11.11%。在不添加有机营养而仅添加土壤浸提液的培养基（MS+SE）平板上，悬浊液浓度为 10-5 时菌落数分别比 MS+TSA 和 MS+R2A 平板上高出 50.32% 和 17.95%（表2）。
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注：接种量为 200 µL/ 皿。
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图1 琼脂和结冷胶培养基平板上菌落的比较
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注：接种土壤菌悬液稀释度为 10-6，28℃温箱中培养 4 周。A 为 TSA； B 为 TSG，大而明显的克隆都是真菌。
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4 种培养基中的大多数菌落表面光滑、湿润，边缘比较规则，菌落颜色以无色或白色为主，少部分菌落呈现黄色、橘色、红色、棕色 （ 表3）。根据直径（Φ） 将菌落分为大（Φ>1 mm）和小（Φ<1 mm）2 大类。当土壤悬浊液浓度为 10-5 时，有机营养为 R2A 时大菌落的比例最低，有机营养为 TSB 时大菌落的比例增加，而在含有土壤浸提物 SE 的培养基中大菌落的比例最高 （表3），说明不同种类细菌对有机营养类型有一定偏好。
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2.2 丙酮酸钠对土壤细菌分离培养效果的影响
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据文献报道，许多微生物在生长过程中产生超氧化物，对其他细菌生长有抑制作用[25]。丙酮酸钠具有抗氧化作用，向培养基中添加丙酮酸钠能够促进一些细菌的生长[26]。因此本实验设置了一组添加丙酮酸钠培养基，在不同的低有机营养培养基上添加了 1.5 g/L 的丙酮酸钠（表1）。对土壤细菌的分离培养结果显示，所有培养基平板生长的菌落高度相似，菌落大，颜色多为淡黄到橙色，表面光滑湿润（图2A），而未添加丙酮酸钠的培养基上菌落明显小得多，颜色多为无色到白色，类型也更丰富（图2B）。以上说明，在低有机营养条件下添加丙酮酸钠时对土壤中的一些细菌起到选择性培养的作用，它们得以优先、快速生长，从而抑制了其他细菌种类的生长，不利于分离获得多种类型的细菌。
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图2 低有机营养培养基上丙酮酸钠对一些细菌的富集效应
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注：A 和 B 的基础培养其均为 MS+SE，A 添加了丙酮酸钠，B 未添加。
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2.3 不同培养基上分离培养细菌种类的比较
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根据表3 中记录的 4 种培养基上的菌落类型，挑取了代表性菌落进行 2 次划线分离纯化，得到单克隆用于 16S rRNA 基因测序，最后有 84 个菌落纯化良好并成功测序（表4）。与 Ezbiocloud 数据库模式菌株相比较结果显示，这些菌落包括 34 属的 52 个种，其中有 77 个与数据库记录的种类相似度高于 98.65%，有 7 个菌落与数据库记录种类的相似度在 96.95%～98.48% 之间，依据目前划分细菌新种的 16S rRNA 基因序列相似性阈值是 98.65% 为标准[27]，它们很有可能为潜在的新种。
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MS+TSG 由于有真菌污染，最后成功分离纯化的分离物最少，MS+R2A 及 MS+SE 菌落数多，最后成功纯化鉴定的菌落数量也相对较多。基于 4 种培养基上代表性克隆的分子鉴定结果，在属级的分类水平，MS+R2A 和 MS+TSA 上属的多样性更丰富，而在 MS+SE 中假节杆菌属（Pseudarthrobacter）相对富集，在 MS+TSG 中鞘氨醇单孢菌属（Sphingomonas）相对富集，说明培养基配方对土壤细菌的分离培养效果影响很大（表4，图3）。在所鉴定的克隆中，4 种培养基上的克隆 50% 以上为不同种，其中 MS+TSA 上分类不重复菌落高达 76.47%，说明所采用的培养条件有利于获得种类丰富的细菌。所检测的 84 个克隆所包含的 52 个种中，没有 1 个种同时来源于 4 种培养基，源于 3 种培养基的仅有 2 个种（3.85%），源于 2 种培养基的仅有 9 个种（17.31%），仅源于 1 种培养基的有 44 个种（84.61%），说明各培养基上生长细菌种类有较大差异。4 种培养基上均分离到新的细菌资源（表4），进一步支持了所用培养条件的可行性。
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2.4 可能新种的分类地位
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本研究获得的 7 个可能新分离物分别归 7 个属。分别将各分离物的 16S rRNA 基因序列与 Ezbiocloud 数据库模式菌株进行比对，下载相似度高的同源序列构建系统进化树，分析新分离物的系统发育地位。
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分离物 C2-2 与 Caulobacter profunda 的模式菌株相似度为 96.95%。到目前为止，该属中有效命名的种有 12 个。系统发育树分析结果显示， Caulobacter 属的 12 个种聚集在一个大的分支， C2-2 位于 Caulobacter 和 Brevundimonas 属之间，形成一个独立的分支（图4），推测它可能是同科下面的一个新属，且与这 2 个属的亲缘关系较近。
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图3 不同培养基上代表性群落在属水平结构的比较
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图4 依据 16S rRNA 基因序列构建的 C2-2 相关菌株的 N-J 系统发育树
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分离物 C4-6 与 Clavibactermichiganensis subsp. michiganensis式菌株相似度为 97.32%。在 Ezbiocloud 数据库中 Clavibacter 属记录的有 9 个种，其中 C. michiganensis 为引起番茄溃疡病的密执安棍状杆菌，有 4 个亚种。在该属的系统发育树中，C4-6 与 C. michiganensis 的 2 个亚种聚在一起（图5），致病性值得研究。
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分离物 A3-19 与 Nocardioidesginkgobilobae 的模式菌株遗传距离最近（图6），两者 16S rRNA 基因序列相度为 97.79%。N. ginkgobilobaea 曾从广西的白杨、黄花、红树林植物等内生细菌群中分离出来过，对植物病原体表现出拮抗活性[28]。分离物 B2-44 可能是 Pusillimonas 属的一个新种。该属目前包含 5 个种，属内的系统进化树分析结果显示 B2-44 与 P. thiosulfatoxidans 相距最近（ 图7），两者 16S rRNA 基因相似度为 98.49%。P. thiosulfatoxidans 可以氧化硫代硫酸盐，但是不产生 H2S [29]。A3-19 和 B2-44 抗菌及促进植物生长功能值得研究。
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图5 依据 16S rRNA 基因序列构建的 C4-6 相关菌株的 N-J 系统发育树
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图6 依据 16S rRNA 基因序列构建的 A3-19 相关菌株的 N-J 系统发育树
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图7 依据 16S rRNA 基因序列构建的 B2-44 相关菌株的 N-J 系统发育树
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分离物 D3-72 分离物与分离自人参种植园土壤中的模式菌株 Sphingomonasginsengisoli[30]的相似度为 97.81%，其系统进化地位见图8。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）种类丰富，已经有 146 个种有效发表并正确命名（http：//www.bacterio.net/ sphingomonas.html），它们大多是从土壤、水、空气、沙漠砂、淡水、沉积物、植物、医院环境和废水中分离得到的，其中的一些种可以产生一些生物活性分子，有非常重要的应用潜力[31]。
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与分离物 C2-78 的 16S rRNA 基因相似度最高（98.41%）的是 Metalliresistens 属中的唯一种 M. boonkerdii，在系统进化树中两者的遗传距离也最近 （图9）。该模式菌株具有抗重金属的能力[32]，后续可以对 C2-79 的抗重金属能力和对番茄促进生长能力进行评估研究。
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分离物 A4-80 可能为 Cohnella 属中的一个新种，与分离自北极冻土带土壤中[33]的模式菌株 C. arctica 相似度最高（97.39%），在该属中的系统进化地位见图10。
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图8 依据 16S rRNA 基因序列构建的 D3-72 相关菌株的 N-J 系统发育树
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图9 依据 16S rRNA 基因序列构建的 C2-78 相关菌株的 N-J 系统发育树
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图10 依据 16S rRNA 基因序列构建的 A4-80 相关菌株的 N-J 系统发育树
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3 讨论
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由于土壤中微生物种类丰富多样，而且与生境理化性质和生物因素之间有复杂的关系，需要采用不同的条件来分离获得不同的微生物种类。基于土壤中有机物含量低、无机盐丰富、温度相对较低、微环境复杂的特征，本研究采用低有机营养、高无机营养培养基，从培养基凝固剂、有机营养类型、土壤因子和添加抗氧化剂丙酮酸钠 4 个方面探究了分离培养土壤新细菌资源的方法。基于 16S rRNA 基因测序结果，与 Ezbiocloud 数据库进行比对，所检测的 84 个分离物中包括 34 个属 52 个种，其中 7 个为可能新分离培养物。
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结冷胶具有透明度高和抗氧化的特征，是一种良好的培养基凝固剂，广泛用于植物组织培养和微生物培养中，使用结冷胶作为培养基凝固剂时获得多种新微生物。在同样的条件下，在结冷胶培养基上新分离得到的微生物中有一半在琼脂培养基上不能形成菌落，一方面可能与结冷胶组成成分为鼠李糖而琼脂为葡萄糖和葡糖醛酸相关[34]，另一方面可能是琼脂与磷酸盐在经过高温灭菌时会产生活性氧（H2O2），抑制细菌的生长[35]，但是结冷胶凝固点会受到溶剂中金属多价阳离子的影响，在较高温度下即凝固[36]。在本研究中发现，结冷胶浓度为 1% 以上时培养基平板硬度才适用于涂布接种，但是此培养基在温度为 70℃以上即开始凝固，在倒平板前加入制霉菌素后使药物抗真菌活力大幅度下降，接种土壤悬浊液后平板上有不少真菌菌落长出，严重影响细菌菌落的形成和后期的纯化。所以用结冷胶作为分离细菌培养基的凝固剂时，不宜用高温敏感的抗真菌药剂，或者可以考虑倒完平板后再将药剂涂布于培养基表面上。
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传统的细菌分离培养方法是用有机营养丰富的培养基、在较高温度下培养，这些培养方法仅能获得一少部分细菌类群。培养基营养物质组成及含量、培养温度对土壤细菌分离培养效果的影响巨大，对于同一种待检测样品，用不同营养因子组合的培养基可分离得到各自独特的细菌类群[37]。考虑到土壤环境中有机养分含量较低，本研究采用了低有机营养和富含无机盐的培养基分离根际细菌，在 4 种培养基上所检测的菌落中有 50% 以上分类不重复；所鉴定到的 52 个种，仅来自 1 种培养基的占 84.61%，说明所用的培养方法可以获得多样性丰富的培养物，不同培养基上的培养产物之间有较大差异。人为设计的培养基营养因子种类及含量很难达到与自然环境完全一致，因此在培养基中添加土壤浸提液是分离获得难培养微生物的一个有效方法，已有实验证明添加土壤浸提液能提高分离黏细菌的多样性[38]。在本研究所设置的培养条件下，菌落出现高峰在 2 周左右，培养 4 周时间内均有新菌落长出，后面出现的菌落通常都非常小，说明延长培养时间有利于生长缓慢的微生物生长，可提高未培养微生物获得率，该结论与其他实验的结果一致[39]。
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丙酮酸钠为微生物提供丙酮酸，它既可以作为电子受体，还可以有效缓解活性氧胁迫，因此在 R2A 等常用的微生物培养基中均含有一定量的丙酮酸钠。李正华等[40]在 TSA 培养基基础上再添加浓度为 1.25 g/L 的丙酮酸钠，结果能够明显增加平板上土壤微生物的菌落总数。在本研究中，当在培养基中添加浓度为 1.5 g/L 的丙酮酸钠后，淡黄色至橙黄色的大菌落在平板上得到明显富集，菌落总数和多样性均显著下降（图2），结果与以上文献结果不相符。产生这种差异最可能的原因是基本培养基为贫有机营养（1/50 的 R2A、 1/100 的 TSB 或土壤浸提的微量有机营养），当添加 1.5 g/L 的丙酮酸钠后相当于是对嗜好丙酮酸的微生物起到了选择性富集培养的作用，并抑制了其他微生物的生长。该实验结果也很好地证明了营养因子对土壤微生物分离培养结果的重要性，当用丙酮酸钠作为培养基抗氧化剂时一定要注意其他有机营养的水平，否则结果可能会与预期的相悖。
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综上所述，采用低有机营养的无机盐培养基是获得土壤难培养细菌的有效方法，可以用于从作物根际土壤中分离筛选新的细菌资源。
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摘要
为探究获得土壤中尚未培养细菌资源的方法，以 MS 无机盐为基础养分，设置 1/100×TSB、1/50×R2A 和土壤浸提液（SE）3 种低有机营养类型，凝固剂用琼脂（A）或结冷胶（G），得到一组培养基 MS+TSG、 MS+TSA、MS+R2A 和 MS+SE，以及在此基础上添加 1.5 g/L 丙酮酸钠作为抗氧化剂的第二组培养基。用上述 8 种培养基分离培养健康番茄根际土壤中的细菌，并对各种培养基平板上代表性菌落进行 16S rRNA 基因分析。结果表明，在 MS 无机盐和低有机营养组合的培养基平板上，在 28℃下培养 28 d 后可检测到菌落数达 1×107 CFU/g 土， 4 种培养基平板上检测到的菌落数量由多到少顺序为 MS+SE>MS+TSG>MS+R2A>MS+TSA；在相同的低有机营养条件下，用结冷胶作为凝固剂可获得更多菌落，添加丙酮酸钠为抗氧化剂会显著降低菌落的多样性。鉴定的 84 个代表性菌落属于 34 个属的 52 个种，其中 7 个（占检测菌株数的 8.33%）为可能新种，不同培养基上种丰富度表现为 MS+TSA>MS+R2A>MS+TSG>MS+SE。结果说明，采用低有机营养的 MS 无机盐培养基有利于分离获得土壤中的一些尚未培养细菌。
Abstract
In order to develop effective approaches to obtain uncultured bacteria in soil，four culture media containing MS mineral salt and reduced organic nutrition named as MS+TSG，MS+TSA，MS+R2A and MS+SE respectively，were designed by adding 1/100×TSB，1/50×R2A or soil extraction（SE）into the MS basic medium with agar（A）or gellan gum（G） as coagulant. A content of 1.5 g/L sodium propionate was added into the media mention above to obtain a group of antioxidant culture media. Bacteria in the rhizosphere soil of healthy tomato plants were cultured on the eight media mentioned above， and the representative colonies selected randomly from different media were identified by 16S rRNA gene sequencing. The results indicated that，on the four media containing MS mineral salt plus reduced organic nutrition，more than 1×107 cfu were obtained from per gram of soil after being cultured at 28℃ for 28 d. The order of colony account on media from high to low was MS+SE > MS + TSG > MS + R2A > MS + TSA. In the condition of mineral salt plus low level of organic nutrients，gellan gum could help to obtain more colonies compared to agar，but the supplement of sodium propionate dramatically reduced the diversity of colonies. Among the 84 representative colonies identified，a total of 52 species from 34 genera were included，of which 7（8.33% of detected colonies）are possible new species. The order of species diversity on media from high to low was MS + TSA>MS+R2A>MS+TSG>MS+SE. The results suggest that media consisting of MS mineral salt and low level of organic nutrients are effective to isolate uncultured bacteria and new antagonism resource to plant pathogens from soil.