随着蔬菜生产设施化、规模化的不断发展，设施蔬菜产业得到快速发展。截至 2015 年，湖北省设施蔬菜面积达到 11.43 万 hm²，产量达到 461.21 万 t^[1]。在蔬菜产量不断增加的同时，尾菜资源量也逐渐增加，且具有数量大和危害多的污染特点，如何资源化处理面临着一系列新的问题和挑战^[2]。因此，科学有效地无害化处理和资源化利用是蔬菜产业健康绿色发展和环境保护的重要前提。

与堆肥、简易堆沤或沼气等方式处理尾菜相比，原位还田成本较低^[3]。蔬菜尾菜具有较低碳氮比（C/ N）（平均 11.04）和较高的含氮量（平均 3.45%），易被微生物分解和矿化^[4]。大量的研究表明，尾菜还田后能够增加当季作物的产量和改善土壤肥力^[5-7]。但是，由于蔬菜废弃物（尾菜）中含有较多的病虫草害，直接还田易传播病菌，同时加重了连作障碍，严重限制了蔬菜废弃物（尾菜）的还田^[8-9]。

高温闷棚是防效较为稳定的物理防治措施之一，一般在每年夏季 6—8 月，以塑料薄膜封闭温室，利用夏季光热资源提高温室内温度，从而有效杀灭温室中有害病原菌及部分害虫^[7，9-12]。李佳川等^[13]和袁根兰^[14]研究发现，高温闷棚结合土壤消毒增加了土壤放线菌数量，显著降低了土壤真菌数量，增加了细菌与真菌菌落的比值。何志刚等^[15]将玉米秸秆还田结合高温闷棚进行了尝试，结果表明湿闷可以明显增强杀菌消毒效果，添加玉米秸秆后整体效果更优。董海龙等^[8]研究发现，秸秆 + 石灰氮 +X-20 菌肥 + 高温闷棚综合处理具有明显的防控作用和显著的增产效果，但是有关尾菜直接还田结合高温闷棚方面的尝试和研究尚不多见。鉴于此，本文拟通过研究设施蔬菜尾菜直接还田结合高温闷棚对设施连作土壤微生物群落结构和理化性质的影响，探讨闷棚前后土壤微生物群落结构的变化规律，以期为设施蔬菜尾菜无害化处理提供新途径和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于湖北省武汉市黄陂区武汉农业科学院北部园区，6—8 月历史温度分别为 23.0～31.0、 26.0～34.0、25.0～34.0℃，供试土壤为砂壤土， 0～20 cm 土层基本理化性质如下：pH 值 6.74、有机质 10.73 mg·kg^-1、碱解氮 214.91 mg·kg^-1、有效磷 22.50 mg·kg^-1、速效钾 211.36 mg·kg^-1。供试微生物腐熟菌剂由湖北宜施壮农业科技有限公司提供。高温闷棚期间土壤（10 cm）和棚内空气温度见图1。

1.2 试验设计

试验于 2020 年 6—8 月进行，还田废弃物为番茄尾菜。试验设计 4 个处理，处理 1（T1）：尾菜不还田直接高温闷棚；处理 2（T2）：番茄尾菜还田结合高温闷棚；处理 3（T3）：番茄尾菜还田 + 秸秆腐熟剂 + 高温闷棚；处理 4（CK）：自然状态不闷棚。“-”后面的 1 和 2 分别表示闷棚前（MPQ） 和闷棚后（MPH）。

高温闷棚操作：在尾菜收获结束时，先均匀撒施腐熟菌剂（1.0 kg·棚^-1），再用旋耕机翻整田块，旋耕深度为 30 cm，次数为 2～3 次，直至地面平整。采用喷灌方式进行灌水，少量多次，土表不宜积水，控制土壤水分含量为田间持水量的 60%～70%。选用厚度为 0.008 mm 的薄膜，交叉覆盖，薄膜四周用土压实。检查棚膜并封闭棚室进行闷棚 30 d。闷棚结束后打开通风，揭去地膜，晾棚 3～5 d，即可进行下一季种植。每处理 3 次重复，即每个温室大棚作为 1 个重复，棚内面积 250 m²（长25 m、宽 10 m），12 个大棚分两排随机排列。采用 5 点法采集闷棚前后土壤样品，一式两份，一份用于土壤理化性质分析，一份用于土壤微生物分析。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 土壤理化性质分析

pH 采用电位法测定（水土比为 2.5∶1），土壤总有机碳含量采用重铬酸钾氧化分光光度法测定，碱解氮含量采用碱解扩散-滴定法测定，有效磷含量采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定，速效钾含量采用醋酸铵提取-火焰光度法测定^[16]，活性有机碳含量采用重铬酸钾氧化法测定^[17]。

1.3.2 土壤微生物群落结构分析

土壤微生物总 DNA 采用土壤 DNA 提取试剂盒 （MOBIO Laboratories，Carlsbad，CA，USA） 提取，其纯度和浓度用核酸定量仪（ND-1000，美国 Nano 公司）检测。将纯化后的基因组 DNA 作为聚合酶链反应（PCR）的模板。细菌 V3-V4 区扩增引物采用 515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）/907R （5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）^[18]，真菌 ITS1 区段扩增引物采用 ITS5（5 ′-GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3 ′）^[19]。PCR 产物用 1.7% 琼脂糖凝胶电泳检测后，送至南京德维生物科技有限公司应用 Illumina 平台的 Hi Seq 进行测序。获得原始序列后进行质量控制，并在 97% 序列相似性水平上聚类成可操作的分类单元（Operational Taxonomic Units， OTUs）。对照 RDP 和 UNITE 数据库进行分类注释，获取对应的细菌和真菌分类学信息^[20]，得到的 OTU 列表并对其进行序列数量标准化，借助 PICRUSt 对细菌 16S rRNA 基因功能进行预测。

1.3.3 数据处理及分析

采用 Excel 2019 进行数据的记录与统计分析，采用 SPSS 21.0 进行单因素方差分析（P<0.05），采用 Origin 2019 进行细菌群落组成与环境因子的冗余分析（RDA）和绘图。利用 Mothur 计算 Shannon、 Simpson 多样性指数及 Chao1、ACE 丰富度指数，用于评价细菌α多样性。基于 Bray-Curtis 矩阵，主坐标分析（PCoA）使用自编函数结合 R 包 phyloseq 进行数据分析，使用 ggplot 进行绘图，群落差异检测使用 R 包 vegan 中的 adonis 进行多元置换方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理闷棚前后土壤化学性质分析

由表1 可知，与闷棚前相比，闷棚后土壤活性有机碳含量均有所降低，其中与 T1-1 和 T2-1 处理相比，T1-2 和 T2-2 处理土壤活性有机碳含量分别减少了 25.03% 和 38.84%，且差异均达到显著水平。与 T2-1 相比，T2-2 显著降低碱解氮含量，达到了 11.33%。 T3-2 与 T3-1 相比，显著增加了碱解氮含量，且达到了 20.56%。不同处理闷棚前后有机碳、有效磷和速效钾含量没有显著差异。此外可以看出，高温闷棚的基础上尾菜还田增加了碱解氮、有效磷和速效钾的含量，且速效钾含量间差异达到显著水平（P<0.05）。

注：同列数值后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。

2.2 不同处理闷棚前后土壤细菌和真菌α和β多样性分析

从表2 可以看出，与 CK-1 相比，CK-2 处理降低了细菌和真菌的α多样性指数，但是处理间差异不显著。而与 T1-1 相比，T1-2 处理显著降低土壤细菌 Shannon 指数、Simpson 指数、Richness 指数、Chao1 和 ACE，分别降低了 16.03%、73.38%、 25.17%、24.28% 和 23.79%，但是却增加了真菌的 α多样性指数。T2-2 较 T2-1 显著降低了土壤真菌 Shannon 指数，而其他真菌和细菌α多样性指数虽然有所降低，但是差异均不显著。与 T3-1 相比， T3-2 增加了土壤细菌 Shannon 指数和 Simpson 指数，但是降低了其他细菌和真菌多样性指数，且处理前后差异均不显著。

通过 PCoA 分析可以看出，MPQ（T1-1、T2-1 和 T3-1） 和 MPH（T1-2、T2-2 和 T3-2） 处理的细菌和真菌群落分布于两个不同的区域，虽然从图2 上看出真菌似乎有交集，但是经过 Adonis 检验表明，闷棚前后土壤细菌和真菌群落出现了显著性的差异。

注：A 为细菌；B 为真菌。

2.3 不同处理闷棚前后土壤细菌和真菌群落结构分析

从图3 可以看出，虽然不经过高温闷棚处理，温室土壤细菌和真菌门丰度均亦发生了变化，与 CK-1 相比，CK-2 处理的 Firmicutes、Proteobacteria、 Deinococcota、Actinobacteriota、Chloroflexi 和 Kryptonia 丰度增加，而其他门类丰度则有所降低。与 T1-1 相比，T1-2 处理土壤细菌 Firmicutes （增加了 19.59 个百分点，只统计 1 个百分点以上门类，下同）、Deinococcota（增加了 8.06 个百分点）、Gemmatimonadota（ 增加了 1.86 个百分点） 和 Chloroflexi（增加了 1.05 个百分点）丰度呈现出增加的趋势，而其他门类丰度均有所减少，其中 Proteobacteria、Bacteroidota、Acidobacteriota、 Crenarchaeota、Myxococcota 和 MBNT15 丰度分别减少了 7.75、2.40、2.53、3.13、1.79 和 1.05 个百分点。与 T2-1 相比，T2-2 分别主要增加了 Proteobacteria （2.65 个百分点）、unidentified_Bacteria（12.26 个百分点）、Deinococcota（1.08 个百分点）和 Chloroflexi （1.07 个百分点） 丰度，但是降低了 Bacteroidota （8.62 个百分点）、Actinobacteriota（2.48 个百分点）、 Acidobacteriota（2.77 个百分点）和 Crenarchaeota（1.23 个百分点）丰度。与 T3-1 相比，T3-2 分别主要增加了 Proteobacteria（6.95 个百分点）、unidentified_ Bacteria（9.66 个百分点） 和 Gemmatimonadota （1.08 个百分点）丰度，但是主要降低了 Firmicutes （10.43 个百分点）、Bacteroidota（1.05 个百分点）、 Acidobacteriota（4.10 个百分点）、Crenarchaeota（1.21 个百分点）和 Myxococcota（1.27 个百分点）丰度。整体而言，与 T1-1 和 T2-1 相比，T1-2 和 T2-2 均增加了 Firmicutes、Deinococcota 和 Chloroflexi 丰度，但是闷棚后主要降低了 Bacteroidota、Acidobacteriota 和 Crenarchaeota 丰度。由此可见，与闷棚相比，尾菜还田后闷棚增加了 Proteobacteria 相对丰度，但是降低了 Firmicutes 相对丰度。

对于真菌门类丰度而言，与 CK-1 相比，CK-2 处理增加了 Unknown（20.73 个百分点）丰度，但是主要降低了 Ascomycota（13.97 个百分点）、 Mortierellomycota（3.63 个百分点）和 Basidiomycota （2.32 个百分点）丰度。与 T1-1 相比，T1-2 处理增加了 Ascomycota（16.42 个百分点）和 Mortierellomycota （10.22 个百分点）丰度，而降低了 Unknown（20.73 个百分点） 和 Mucoromycota（5.21 个百分点） 丰度。与 T2-1 和 T3-1 相比，T2-2 和 T3-2 均增加了 Ascomycota（17.02 个百分点） 和 Ascomycota（34.01 个百分点）丰度，但是分别降低了 Unknown（15.25 个百分点）、Mortiere-llomycota（1.20 个百分点）、 Unknown（13.45 个百分点）、Mortierell-omycota（1.20 个百分点）、Basidiomycota（16.83 个百分点）、 Rozellomycota（2.44 个百分点）丰度。由此可以看出，与闷棚前相比，闷棚后 Ascomycota 丰度增加了 16.42～34.01 个百分点，且尾菜还田的增加幅度更大，与直接闷棚相比，尾菜还田后闷棚则降低了 Mortierellomycota 相对丰度。与 T1-1、T2-1 和 T3-1 相比，T1-2、T2-2 和 T3-2 镰刀菌属丰度分别减少了 4.46、7.03 和 1.46 个百分点，而 CK 则闷棚前后增加了 0.46 个百分点。

2.4 不同处理闷棚前后土壤细菌功能预测分析

从图4 中可以看出，与 CK-1 相比，CK-2 增加了氮呼吸、反硝化和氨化作用相关基因相对丰度，但是降低了硝酸盐还原和硝化作用相关基因相对丰度。与 T1-1 相比，T1-2 增加了反硝化、硝酸盐还原和氨化作用基因相对丰度，但是显著降低了硝化作用相关基因相对丰度。但是 T2-2 与 T2-1 相比，均降低了氮代谢相关功能基因相对丰度。与 T3-1 相比，T3-2 则降低了氮呼吸、反硝化、硝酸盐还原和氨化作用相关功能基因相对丰度，但是增加了硝化作用相关功能基因相对丰度。与 CK-2 相比，T1-2、T2-2 和 T3-2 氮呼吸作用（硝酸盐呼吸、亚硝酸盐呼吸和氮呼吸）的相对丰度均有所降低，且下降幅度 T1-2>T2-2>T3-2。对于反硝化作用（硝酸盐反硝化、亚硝酸盐反硝化和反硝化）和氨化作用（硝酸盐氨化、亚硝酸盐氨化和氧化亚氮脱氮）基因相对丰度而言，T1-2、T2-2 和 T3-2 所占丰度均低于 CK-2，且下降幅度 T2-2>T1-2>T3-2。由此可见，闷棚降低了氮呼吸、反硝化和氨化作用基因相对丰度，且以尾菜还田添加腐熟菌剂降低最多。与直接闷棚相比，尾菜高温闷棚还田则降低了反硝化、氨化和硝态氮还原作用基因相对丰度。

注：不同小写字母表示各处理间差异显著（P<0.05）。下同。

从图5 可以看出，与 CK-1 处理相比，CK-2 降低了 hydrocarbon degradation（碳氢化合物降解）、 aromatic hydrocarbon degradation（芳烃降解）、aromatic compound degradation（芳香化合物降解）和 cellulolysis（纤维素降解）功能基因相对丰度，但是增加了 xylanolysis（木聚糖）和 chitinolysis（几丁质）降解相关功能基因相对丰度。与 T1-1 相比， T1-2 增加了碳氢化合物、芳香化合物和纤维素降解功能基因相对丰度。T2-2 则比 T2-1 均降低了这 6 种碳代谢相关功能基因相对丰度，T3-2 则比 T3-1 增加了碳氢化合物、芳烃、木聚糖、几丁质和纤维素降解功能基因相对丰度。不管是否闷棚，均降低了芳烃降解功能基因相对丰度。与不闷棚相比，直接闷棚增加了碳氢化合物、芳香化合物和纤维素的降解功能基因相对丰度，尾菜高温闷棚还田则降低了这 3 种相关功能基因相对丰度，然而，尾菜还田配施腐熟菌剂则又增加了这 3 种相关功能基因相对丰度。

2.5 土壤化学性质与细菌和真菌群落结构冗余分析

对于细菌而言，两个坐标 RDA1 和 RDA2 对其响应变量的解释比例分别为 26% 和 4%，两轴的累计解释比例达到 30%。图6 中碱解氮和速效钾与细菌群落结构均呈现出显著的相关性（P<0.05）。对于真菌而言，两个坐标 RDA1 和 RDA2 对其响应变量的解释比例分别为 17% 和 15%，两轴的累计解释比例达到 32%。图6 中碱解氮和有效磷与真菌群落结构呈现出显著的相关性（P<0.05）。

注：A 为细菌；B 为真菌。TOC 为总有机碳，AOC 为活性有机碳，AN 为碱解氮，AP 为有效磷，AK 为速效钾。

3 讨论

3.1 不同处理闷棚前后土壤化学性质分析

本文中不闷棚处理仍然会显著增加土壤有机碳和碱解氮的含量，这与李英梅等^[21]研究结果相似，这可能是由于夏季较高的温湿度条件促进了前茬作物残留尾菜的腐解。李英梅等^[21]研究表明，高温闷棚后降低了有机碳和速效氮的含量，在本文中主要降低了活性有机碳和速效钾的含量，这可能是由于本试验土壤活性有机碳含量占比较高，优先为微生物所用，然而，对于速效钾含量的影响比较复杂，还有待于深入研究。戚嘉琦等^[11]研究结果表明，菜籽饼高温闷棚还田后降低了土壤有机质和碱解氮含量，在本文中尾菜高温闷棚还田后降低了活性有机碳和碱解氮的含量，可能是由于土壤活性有机碳具有较高的生物活性而被优先矿化，同时消耗土壤中氮作为矿化氮源。在尾菜高温闷棚还田的基础上添加微生物菌剂能够显著增加碱解氮的含量，这可能是由于持续的较高土壤温度，使土壤中微生物和酶的代谢活性增强，促进土壤氮素释放^[21]。

3.2 不同处理闷棚前后土壤细菌和真菌群落结构和多样性的变化

从本文可以看出，高温闷棚后虽然显著降低了细菌 Shannon 和 Simpson 等 5 个多样性指数，但是却增加了真菌 5 个多样性指数。在美国大平原地区研究发现，气温升高促进了土壤真菌优势，进而导致群落结构发生改变^[22]。即使在不闷棚的情况下，细菌和真菌的多样性（Shannon 指数、Simpson 指数、Richness 指数、Chao1 和 ACE）指数均有所降低，何伟等^[23]研究也发现，不闷棚情况下降低细菌的 Shannon 指数和 Chao 指数以及真菌的 Chao 指数，但是却增加了真菌 Shannon 指数，之所以产生这样的差异可能是由于供试土壤自身真菌群落结构有所差异，还需要后续的试验进一步论证。在尾菜高温闷棚还田以及配施腐熟菌剂的情况下，降低了真菌 Shannon 和 Simpson 等 5 个多样性指数，这与戚嘉琦等^[11]研究结果一致，可能是由于物料和菌剂的添加对真菌群落进行了定向选择，从而导致其多样性指数的降低。

本文中高温闷棚前后显著改变了土壤细菌和真菌群落结构，这与何伟等^[23]研究结果相似。直接高温闷棚增加了土壤细菌厚壁菌门和绿弯菌门的丰度，但是降低了变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、泉古菌门和黏菌门细菌丰度。尾菜高温闷棚还田或者再添加腐熟菌剂均能增加变形菌门丰度，降低了拟杆菌门、酸杆菌门和泉古菌门细菌丰度。由此可见，尾菜高温闷棚还田会降低拟杆菌门、酸杆菌门和泉古菌门细菌丰度。何伟等^[23]研究也发现，不同闷棚措施对细菌门类丰度的影响不一。已有研究证实，子囊菌能降解纤维素和木质纤维素^[24]，秸秆还田后能够增加子囊菌门真菌的相对丰度^[25-26]。尾菜高温闷棚还田均能增加子囊菌门真菌丰度。戚嘉琦等^[11]研究也发现子囊菌门是高温闷棚后土壤中主要的真菌门类之一，同时也可以看出，高温闷棚与尾菜高温闷棚还田的处理土壤中真菌优势菌门有显著差别^[23]。通过对真菌优势属分析看出，不论尾菜是否还田，高温闷棚均能降低镰刀菌属的丰度，这与前人的研究结果一致^[11，13-14]。

3.3 不同处理闷棚前后土壤细菌和真菌功能预测分析

从本文可以看出，直接高温闷棚会降低氮呼吸和硝化作用，而尾菜高温闷棚还田或者再添加腐熟菌剂则主要降低了氮呼吸、反硝化、硝酸盐还原和氨化作用，说明尾菜高温闷棚还田会加快氮素的流失^[27-28]。对于碳代谢而言，直接高温闷棚后增加了纤维素、木聚糖、芳香化合物和碳氢化合物的降解功能基因丰度，但是尾菜高温闷棚还田则降低了碳代谢相关功能基因丰度，可能是由于高温条件下大量的物质投入对土壤微生物群落进行了筛选，导致细菌和真菌多样性和功能的降低，但是还需要后续的试验进一步验证。此外，在尾菜高温闷棚还田的基础上增施腐熟菌剂，又增加了甲壳素、纤维素、木聚糖和碳氢化合物降解相关功能基因丰度，这可能是由于添加的菌剂在闷棚过程中得到了繁殖和强化，从而增强了碳代谢的相关功能。

本文研究结果发现，夏季闷棚处理均能降低植物病原真菌基因丰度，特别是镰刀菌属真菌丰度，这可能是因为闷棚过程中高温的消杀作用，这与何志刚等^[15]研究结果一致，湿闷可以增强杀菌消毒效果，添加秸秆等物料后整体效果更优^[29]。根据肖健等^[30]研究结果，本文中真菌主要包括共生营养型（Symbiotroph）、病理营养型（Pathotroph）和腐生营养型（Saprotroph）3 种类型，不论是直接高温闷棚，还是尾菜高温闷棚还田和配施腐熟菌剂都增加了土壤内生基因表型相对丰度，说明促进了共生营养性的真菌生长，肖健等^[30]和纪程等^[31]研究结果都说明了子囊菌门是秸秆或者尾菜还田后土壤的主要真菌门类。

3.4 土壤化学性质对细菌和真菌群落结构的影响

本文研究结果表明，高温闷棚处理时碱解氮显著影响细菌和真菌群落结构，这可能是由于尾菜还田带来的大量有机碳促进土壤微生物繁殖而要求更多的氮源，导致氮成为影响土壤微生物群落结构的主要因子^[32]。虽然大量研究表明秸秆还田后也会引起氮素的缺乏^[33]，但是尾菜高温闷棚还田在土壤有机质降解和氮素需求方面的差异还有待于深入研究。

4 结论

（1）直接高温闷棚会显著降低活性有机碳含量，减低细菌多样性而增加真菌多样性。尾菜高温闷棚还田以及配施腐熟菌剂增加了土壤碱解氮和速效钾含量，但是均降低了真菌多样性指数。

（2）高温闷棚前后细菌和真菌群落结构均发生了显著的变化。闷棚后主要降低了 Bacteroidota、 Acidobacteriota 和 Crenarchaeota 丰度，但是真菌 Ascomycota 丰度增加了 16.42～34.01 个百分点，且尾菜还田的增加幅度更大。闷棚后镰刀菌属丰度降低了 1.46～7.03 个百分点，而不闷棚则增加了 0.46 个百分点。

（3）与直接闷棚相比，尾菜高温闷棚还田或者添加腐熟菌剂降低了反硝化、氨化和硝态氮还原作用基因相对丰度，而只有尾菜高温闷棚还田降低了碳氢化合物、芳香化合物和纤维素的降解功能基因相对丰度，配施腐熟菌剂则又增加了这 3 种相关功能基因相对丰度。

（4）碱解氮是影响高温闷棚后土壤细菌和真菌群落结构的主要因子之一。

参考文献