长期的化肥、农药施用引起土壤理化性质改变和农田生态环境破坏已经引起人们高度关注。绿色无污染的有机肥施用可以改善土壤结构，提高土壤养分的利用率，刺激土壤微生物生物量增加，提高土壤肥力并维持土壤健康。近年来，以木质纤维为原料的蚯蚓养殖及其相关产品的开发在国内占有重要地位。我国目前蚯蚓养殖量达到 860 t，生产的蚯蚓用于饲料、酶制剂、医药等产品生产^[1]。蚯蚓生产过程中产生的蚯蚓粪被用于多种作物的有机肥，目前已经在番茄、万寿菊、黄瓜、红小豆、苹果等作物上施用，株高、茎粗、产量、抗氧化性质均有提高，不仅降低了果实中重金属和农药残留，果实品质也有显著提升^[2-5]。

山药，多指薯蓣，块茎既作为食品，又可入药。河南铁棍山药因富含皂甙、氨基酸等有机物，具有补肾健脾、固肾益精、益心安神、养颜抗衰等功效，其药用价值和营养价值远远高于其他山药品种，而成为我国的名牌产品。蚯蚓粪在山药种植过程中的应用研究还未见报道。本研究以蚯蚓粪为基质，将本试验室筛选研发的山药益生菌剂负载到蚯蚓粪颗粒上制成蚯蚓粪益生菌肥，在铁棍山药种植前作为底肥施用，研究其对铁棍山药的促生长和改善品质的作用。

1 材料与方法

1.1 益生菌剂制备

试验用菌为河南省农业微生物生态与技术国际联合实验室自行研发的山药益生菌菌剂，包含哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），分别在发酵罐中培养 24 h 后，各菌株等量（有效活菌数量）混合，真空干燥箱中 50℃烘干 30 min 至粉末状，制作成浓度为 2.0×10¹⁰ CFU/g 的干粉菌剂。

1.2 蚯蚓粪益生菌肥的制备

试验用赤子爱胜蚓（Eisenia foetida，大平二号）蚯蚓粪来自河南省鑫饰板业有限公司，包含粗蛋白（5.87%），其有机质含量为 70.1%，总氮 （3.38%）、磷（0.94%）、钾（0.60%）及重金属含量（Cd 0.9 mg/kg、As 0.1 mg/kg、Pb16.7 mg/kg、Hg 0.1 mg/kg、Cr 21.4 mg/kg）符合《有机肥料》（NY/T525—2021）应用标准。将已制备好的益生菌菌剂和蚯蚓粪按照 1∶500 质量比例混合后制备成为蚯蚓粪益生菌肥，其中两种益生菌的含量均为 2.0×10⁷ CFU/g。

1.3 蚯蚓粪益生菌肥在铁棍山药大田的施用

试验区域选择在温县农科所、温县国家农业示范园及新乡县 3 个地方，铁棍山药的种植完全按照常规农田种植方法。种植前将蚯蚓粪益生菌肥按照 3750 kg/hm² 撒在欲种植山药的沟中，山药生长过程中益生菌剂追加 2～3 次。大田分别设置蚯蚓粪益生菌肥试验组（T），不施肥为对照组（C）。试验小区采用随机区组排列，每组处理重复 3 次，共设置 18 个小区，定期进行观察山药生长情况，测定土壤理化因子（总氮、总磷、铵态氮、硝态氮、亚硝态氮和 pH），并采集根际土壤和山药地下块茎进行根际微生物、内生微生物和山药营养成分的测定。

1.4 铁棍山药生长的测定

铁棍山药收获时，每个小区随机选取 3 株山药，采用直尺测量铁棍山药株长，电子天平称量块茎鲜质量。并且统计整个小区的产量，换算成公顷产量。

1.5 铁棍山药营养成分和药效成分测定

对成熟期铁棍山药冷冻打粉后用于测定其营养及药效成分指标。营养指标包括山药块茎可溶性糖、淀粉、蛋白质的含量，药效成分指标包括薯蓣皂苷、黄酮及酚类物质的含量。可溶性糖的含量参考 Chow 苯酚硫酸法测定^[6]、淀粉含量参考郝小燕等^[7]的蒽酮比色法测定，蛋白质含量参考 Maehre 等^[8]的考马斯亮蓝法测定，酚类物质含量测定参考 Ainsworth 等^[9] 的福林酚比色法进行提取并测定，总黄酮含量参考 Batista 等^[10]的三氯化铝比色法测定，薯蓣皂苷含量参考 Yuan 等^[11]的高效液相色谱法测定。每个样本做 3 次重复。

1.6 根际微生物群落分析

每个小区按五点法采集铁棍山药萌发期、膨大期、成熟期的不同土壤样品，选取距离铁棍山药根系最近的土壤，轻轻抖掉铁棍山药上附着的大块土壤，剩余附着在根系上的土壤颗粒即为根际土壤，通过在摇床上摇动（20 min，120 r/min），收集这些直接从根部脱落的土壤颗粒为根际土壤样本^[12-15]。共收集 3 个地点根际土壤样本 60 份，24 h 内返回实验室进行后续测序的取样工作，须采样存放于超低温冷冻冰箱保存。土壤微生物的 DNA 提取采用 MP 土壤微生物 DNA 提取试剂盒，取质量合格的 DNA 样品，采用 Illumina Miseq 测序平台进行高通量测序（上海美吉生物公司）。

1.7 内生微生物群落分析

将新鲜铁棍山药根茎部分按照顺序用无菌水 （30 s）、70% 乙醇（2 min）、次氯酸钠溶液（5 min）和 70% 乙醇（30 s）表面灭菌并洗涤后，分隔成小块的植物样本即为植物内生组织样本，共收集 3 个地点铁棍山药根茎组织样本 50 份。内生微生物群落样本的处理分析过程同上，与根际土壤微生物群落分析一致。

1.8 数据处理及分析

采用 Excel 2021 对所测铁棍山药的生长指标、营养及药效成分指标进行统计并分析。

测序原始数据为双端的 fasta 文件，首先使用 Fast QC 进行原始数据的质量控制，对测序原始数据进行拼接、过滤，获得最终用于分析的序列。使用 Usearch 在 0.97 的相似度下进行去冗余、聚类和操作分类单元 OTU 表格生成。共生微生物群落数据采用 Qiime2 进行 16S 的相关比对分析后，以 R 4.0 进行相关数据的可视化表现。Lefse 差异物种分析采用在 linux 平台下的 Lefse 包进行（LDA score>2.0），线性判别分析 | LDA |>2 且 P<0.05 作为阈值评估差异显著的物种的效应值，得到组间丰度有显著差异的物种，并对结果进行可视化展示。利用 Spearman 相关性分析研究微生物群落物种组成与环境因子间的关系。在 R 4.0 下使用 Corrplot 包（P<0.05，r=0.6）分析微生物群落的网络相关性，并且计算其网络的拓扑结构特性来描述由此产生的节点间的相互关系，之后在 Gephi9.0 中进行数据可视化表现。

2 结果与分析

2.1 蚯蚓粪益生菌肥对铁棍山药生长和产量的影响

如图1 所示，与对照相比，施加蚯蚓粪益生菌肥后，铁棍山药在株长、重量还有产量上均有不同程度的提高。平均株长增加约 14.21 cm，增长了 21.54%，平均重量增加 65.70 g，增幅约 26.28%。平均产量增加 4488 kg/hm²，增产约 25.37%。

注：* 代表处理间差异显著（P<0.05），NS 代表处理间差异不显著。下同。

2.2 蚯蚓粪益生菌肥对铁棍山药品质的影响

对成熟期铁棍山药的营养及活性成分进行测定，其中淀粉含量最高，其次是可溶性糖类、蛋白质、酚类物质、黄酮类物质，薯蓣皂苷在铁棍山药中含量较低。施加蚯蚓粪益生菌肥后，糖类、淀粉、蛋白质、酚类、黄酮及皂苷物质上均不同程度地升高，每克铁棍山药干样分别增加约 9.35、46.41、2.08、0.32、2.48、0.02 mg，增幅分别为 25.68%、32.79%、14.49%、5.18%、37.48%、31.03% （图2）。

2.3 蚯蚓粪益生菌肥对铁棍山药根际微生物群落结构的影响

从铁棍山药根际土壤的样本中共获得细菌有效序列 3027818 条，分属于 16647 个 OTU 分类单元；获得真菌有效序列 3254628 条，分属于 6767 个 OTU 分类单元。蚯蚓粪益生菌肥的添加明显影响了细菌及真菌群落的共生网络结构，分析铁棍山药整个生长时期的共生网络结构（图3）可以看出，根际土壤细菌群落的正相关连接数约在 76.0% 以上，真菌群落正相关连接数约 98.4% 以上。经蚯蚓肥益生菌肥施用后，根际土壤细菌群落和真菌群落的关键节点数目相差不大，网络连接数均有增加，分别增加了 140、23，并且节点平均度略有升高，分别为 0.9、1.33，节点距离中心连通度也均上升。这些都表明无论是真菌还是细菌群落，在施用蚯蚓粪益生菌肥后，群落间相互作用都更加紧密，表现出更为稳定的网络结构。

试验土壤的根际土壤细菌优势菌门为放线菌门 （Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、 Methylomirabilota、粘球菌门（Myxococcota）、拟杆菌门（Bacteroidota），包含了整个群落的 90.26%～94.17%。铁棍山药根际土壤中主要细菌分属于 Vcinamibacteraceae、污物假节杆菌属（Pseudarthrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、棒状杆菌属 （Rokubacteriales）、Gaiella 属、假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptomyces）等（图4A）。微生物群落随山药生长萌发期、膨大期、成熟期出现变化，污物假节杆菌、假单胞菌、A4b、MB-A2-108 等属的丰度升高，芽孢杆菌、Vcinamibacteraceae、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等属的丰度不断下降。添加蚯蚓粪益生菌肥后，芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、从毛单胞菌（Comamonadaceae）、贪食菌（Variovorax）、短芽孢杆菌（Brevibacillus）、梭菌（Clostridium） 等益生菌的种类和数量较高，Pajaroellobacter、Bdellovibrionota 等病原菌开始递减（图4A、B）。

铁棍山药根际土壤中主要的真菌类群为子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉菌门（Motierellomycota） 及担子菌门（Basidomycota）等，在群落中占比为 69.90%～89.17%。进一步分析表明，铁棍山药根际土壤中主要真菌分属于被孢霉属（Mortierella）、镰刀霉属（Fusarium）、假散囊菌属（Pseudeurotium）、枝顶孢属（Acremonium）、Solicoccozyma、毛葡孢属 （Botryotrichum）等属中（图4A）。其中假散囊菌、枝顶孢菌随着山药生长时期丰度逐渐增加，被孢霉菌、Solicoccozyma、篮状菌（Talaromyces）、链格孢菌（Alternaria）等属随山药生长丰度逐渐降低。添加蚯蚓粪益生菌肥提高了被孢霉菌、Solicoccozyma、枝顶孢菌等菌的丰度，降低了假散囊菌、篮状菌、丛赤壳菌（Nectriaceae）等菌的丰度，特别是病原菌如菌寄生菌（Hypomyces）、绿僵菌（Metarhizium） 等大量减少（图4A、B）。

注：A 为根际细菌及根际真菌组成；B 为差异物种分析。

随蚯蚓粪益生菌肥添加，山药根际物种丰度差异较大的微生物与土壤理化因子两两之间的 Spearman 相关性热图（图5）表明，土壤微生物群落受到土壤全氮、全磷、铵态氮、硝态氮、亚硝态氮及 pH 等的影响，土壤全氮、全磷、pH 等理化因子对 Pajaroellobacter、Bdellovibrionota、寄生菌、绿僵菌等病原微生物产生显著的负向作用 （P<0.05），土壤氮、磷、碳氮比等理化因子与被孢霉、Solicoccozyma 及潜在益生菌芽孢杆菌、短芽孢杆菌、梭菌等呈显著正向作用（P<0.05）。

2.4 蚯蚓粪益生菌肥对铁棍山药内生组织微生物群落结构的影响

铁棍山药的地下块茎为食用部分，该部分从 6 月下旬开始萌发并逐渐膨大向下垂直生长，直到 11 月成熟。本研究从不同膨大时期的铁棍山药地下块茎样本中获得内生细菌有效序列 883818 条，分属于 3666 个 OTU 分类单元；获得内生真菌有效序列 3334517 条，分属于 4434 个 OUT 分类单元。蚯蚓粪益生菌肥的添加同样影响了内生组织细菌和真菌群落的共生网络结构，如图6 所示，内生细菌群落 90% 以上为正相关，内生真菌群落 99.8% 以上为正相关，施加蚯蚓粪益生菌肥后，共现性群落的网络节点度数目上升，分别为 31、29，连接数增加，分别为 585、420，节点平均度分别提高 1.2 和 3.3，距离中心性连通度也均有所上升，同样表现出更加明显的群落间相互作用和更趋于稳定复杂的群落结构。

注：TN 为总氮，TP 为总磷。

铁棍山药从萌发期、膨大期、成熟期，细菌的主要优势门为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等，占比约 96.44%～99.91%。进一步分析其种属结构，铁棍山药内生组织的主要细菌分属于青枯菌属（Ralstonia）、假单胞菌属、肠杆菌属（Enterobacter）、芽孢杆菌属、链丝菌属等 （图7A）。其中，芽孢杆菌属、假单胞菌属、代尔夫特菌属（Delftia）、金黄杆菌（Chryseobacterium）、混养反硝化硫细菌（Thiopseudomons）、短波单胞杆菌（Brevundimonas）、Rhodococus 等的丰度从山药生长的萌发期到成熟期呈上升趋势，肠杆菌属、黄杆菌属（Flavobacterium）的丰度大幅下降，青枯菌属在膨大期大量增加后急剧减少。经蚯蚓粪益生菌肥处理后，显著降低了青枯菌属的丰度，提高了芽孢杆菌、链霉菌、泛菌（Pantoea）等细菌属的丰度，特别是链孢囊菌（Streptosporanglales）、气球菌（Aerococcaceae）这些潜在的益生菌显著改变并增多（图7A、7B）。

铁棍山药内生组织真菌优势门为担子菌门、子囊菌门及被孢霉菌门，约占整个群落的 82.50%～92.90%。分属于镰刀霉属、Setophoma、曲霉属、酵母属（Rhodotorulla）、新赤壳属（Necosmospora）、 Cutaneotrichosporon、枝孢属等（ 图7A）。从山药生长开始到成熟，枝孢菌、枝顶孢菌、枝鼻菌（Cladorrhinum）、节菌（Wallemia）等属的丰度不断升高，而镰刀霉菌、酵母菌、新赤壳菌等属则随山药生长时期呈现不断下降的趋势，曲霉菌 （Aspergillus）在膨大期大量增大后大量减少。添加蚯蚓粪益生菌后，新赤壳菌、链格孢菌、枝孢菌等的丰度明显增多，这其中也包括对植物有益的线虫草菌 （Ophiocordycipitaceae）显著增加，而曲霉菌、病原菌杯梗孢属（Cyphellophora）等明显减少（图7A、7B）。

注：A 为内生细菌及内生真菌组成；B 为差异物种分析。

3 结论与讨论

已有众多研究发现，施用蚯蚓粪能够提高番茄、甘薯、草莓等作物的生长和产量，证明了蚯蚓粪的有效性^[4，16]。本研究结果表明，施用蚯蚓粪益生菌肥不仅可以提高铁棍山药的株高，促进植株的生长发育，增加其单株重从而提高产量，也提高了铁棍山药可溶性多糖、淀粉、蛋白质以及黄酮、总酚、皂苷等药效成分含量。以上结果说明山药的品质得到提高。这与已有文献报道的蚯蚓粪及益生菌在瓜果、叶菜类上的施用效果一致^[5]。蚯蚓粪是良好的腐熟有机肥料，除提供作物生长所需的有效元素外，还富集了源自植物的赤霉素、生长素、细胞分裂素、乙烯酸等植物生长调节物质以及大量组成尚不明确的腐殖物质。这些物质可能更有利于提高外加益生菌的活性，发挥其功效，改善作物生长环境，从而对铁棍山药的生长和品质改善起到重要作用，也更好地维持植物-微生物健康的生态系统。本试验中添加的两种益生菌为哈茨木霉和巨大芽孢杆菌，无论在内生还是根际微生物群落，试验组中木霉属及芽孢杆菌属的丰度均有明显增加，说明本试验中添加的两种益生菌在山药内生及根际有效定殖并存活。本试验以蚯蚓粪为基质，添加的哈茨木霉及巨大芽孢杆菌除有增强植物抗逆性，阻止病原真菌接触到植物根系及叶片表面，产生多种抗菌素和酶作用外，也具有产生长素、固氮、增磷和对植物有益的激素及化合物等作用，因而可以促进铁棍山药的生长发育^[17]。

蚯蚓粪益生菌肥的施加影响了土壤的微生物群落，从而促进了铁棍山药的生长发育。微生物共现网络越复杂代表微生物可利用的养分越高，微生物间相互作用越强，也有助于菌群更有效地利用养分^[18]。本试验结果表明，在山药内生组织及根际土壤微生物群落的网络拓扑结构中，网络节点的平均度升高、距离中心连通度上升，这不仅说明蚯蚓粪益生菌肥施用后的群落结构更加复杂和稳定，也证明蚯蚓粪益生菌肥的施用导致微生物之间的相互作用增强，根际健康微生物群落更加稳定，有助于植物健康生长^[19]。而且蚯蚓粪本身具有丰富的微生物群落，可以通过影响植物根际的微生物繁殖所需的能源来影响根际微生物群落种类和数量的分布，增加土壤中有益微生物的丰度，增强其与病原真菌争夺竞争碳、氮等营养资源的能力^[1]。试验结果也进一步印证了这些观点，蚯蚓粪益生菌肥的添加一方面抵御了铁棍山药相关病原菌的侵害，影响了山药内生群落中的青枯菌、Pajaroellobacter、 Cyphellophora、寄生菌以及土壤中存在的广普性虫生真菌绿僵菌等病原微生物的丰度，它们的生长明显被抑制。另一方面，已有大量数据表明，土壤中有益的微生物可帮助植物更有效地获得养分并促进植物生长^[20-23]，例如芽孢杆菌具有固氮、溶磷、解钾等作用可以促进植物对氮、磷、钾等元素的吸收。鞘氨醇单胞菌有利于土壤有机碳的累积和肥力的提高。链霉菌和枝顶孢菌等通过产生抗生素或抗菌物质参与到植物的抗逆过程来促进番茄或棉花的抗性和生长。本研究中山药根际芽孢杆菌、链霉菌、鞘氨醇单胞菌、枝顶孢菌等微生物在蚯蚓粪益生菌肥的作用下大量增加即说明这些潜在的生防菌活动更加频繁，以促进植物生长发育。土壤理化性质是微生物群落结构变化和空间分布的主要驱动力，蚯蚓粪益生菌肥的添加，改善了土壤理化性质，推测土壤氮、磷被有益微生物更好地利用，也抑制了病原微生物的发展，这些推测还需要后续试验的验证。

本研究中，蚯蚓粪益生菌肥的施用明显增加了山药的营养成分和功效成分的积累。有关益生菌与植物功效成分积累之间的相关性已有大量报道^[24-29]。例如，经芽孢杆菌处理的人参中 9 种单体皂苷总量获得大幅提高。泛菌不仅同多花黄精中的多糖含量呈显著正相关关系，也对丹参中酚类物质迷迭香酸、丹酚酸 B 的积累有显著促进。另外，链格孢菌有助于黄芪中类黄酮、皂苷等活性成分的合成。枝孢菌促进了丹参根系的生长和生物量的提高，并提高了丹酚酸 A 和总酚物质的含量。从本研究结果看，经蚯蚓粪益生菌肥处理后地下块茎内生细菌中芽孢杆菌、泛菌和内生真菌中链格孢菌、枝孢菌等明显增加，可能与这些有效成分的累积有关，但还需进一步的试验验证。

总的来说，蚯蚓粪益生菌肥的施用改善了作物品质、提高了作物产量，并且通过改善共生微生物群落结构的稳定性促进了山药的生长，更有利于提升山药品质。因此，施用蚯蚓粪益生菌肥可以降低大量施用化肥带来的环境污染，作为田间栽培管理的一项农业措施进行推广实施。

参考文献