柑橘（Citrus reticulata Blanco）是芸香科，柑橘属植物。其味美色鲜，营养丰富，既可鲜食，又可加工成果汁。柑橘是世界第一大水果，面积和产量均居全球第一。2017 年，全球柑橘栽培面积 953 万 hm²，产量 1.84 亿 t。全世界有 138 个国家生产柑橘^[1]，是仅次于小麦、玉米的第三大国际贸易农产品。而目前我国种植的柑橘大多都是嫁接苗，嫁接苗是由接穗品种（下称接穗）与砧木品种（下称砧木）嫁接组合而成的共同体。砧木是柑橘嫁接的基础，对接穗的树体营养、生长活力、果实产量、品质和抗逆性具有显著的影响^[2-5]。柑橘产业中几乎所有的柑橘栽培品种都是嫁接在砧木上进行生产的，因此，选择合适的砧木对于提高柑橘产量、品质和抗逆性具有重要意义。枳（Poncirus trifoliate Raf）是一种传统的，也是目前生产上应用较为广泛的砧木，具有亲和力强、早期丰产、抗旱、抗寒、抗脚腐病等优点。资阳香橙（Citrus Junos Sieb. ex Tanaka）根深，多粗根，树势强壮，嫁接后树冠高大、产量高、果形大，有极强的耐碱性，是我国桂南地区沃柑的理想砧木，也是华南地区砂糖桔的优良砧木^[6]，因其抗碱性和植株长势强，也是四川盆地紫色碱性（pH 7.2～8.4）土壤上柑橘种植的理想砧木。

丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌在系统发育树上属于球囊霉亚门（Glomeromycotina），现已发现的 AM 真菌约 348 种，是重要的专性活体营养的植物共生真菌^[7]，广泛分布于土壤，能与地球上大约 90% 的植物形成共生体，是迄今发现与植物关系最密切的微生物之一，也是农作物的重要有益微生物^[8]。其孢子萌发后可在宿主植物的根际周围形成根外菌丝，且可侵入到根内形成根内菌丝、丛枝和泡囊等侵染结构^[9]。独特的丛枝结构能有效促进宿主植物对土壤中水分和养分的吸收，还促进宿主植物对有机物质的分解，从而促进植物的生长。而宿主植物将 20% 的碳水化合物提供给丛枝菌根以促进生长发育和生命周期的正常进行^[10]。

柑橘具有较少且短的根毛或不生根毛，是菌根依赖型植物，因此，需要强烈依靠与其共生的真菌协作吸收土壤中各种矿物质营养^[11]。有研究表明，接种 AM 真菌能促进宿主植物的生长发育，提高根系活力、光合作用和生物量，改善果实品质等。但也有研究表明，接种 AM 真菌后抑制了植物的生长。造成这一结果的原因有可能是跟宿主植物与 AM 真菌的兼容性有关。而目前的研究大多为单个菌株对某一作物生长的影响。本研究选择目前生产上常用的柑橘砧木枳和资阳香橙为材料，同时接种 9 种不同 AM 真菌，比较它们对这两种柑橘砧木生长发育的影响，从而为利用 AM 真菌改善柑橘生长和物质积累提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试柑橘砧木为资阳香橙和枳。供试菌剂由广西农业科学院微生物所分离保存，具体菌株编号及名称见表1。供试基质为育苗有机质∶沙∶土按 2∶1∶1 混匀后装入灭菌袋中进行高压蒸汽灭菌，温度 121℃，时间 120 min。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

本试验包括柑橘砧木品种和接种两个因素。其中柑橘砧木品种为香橙和枳壳两种；接种处理包括接种丛枝菌根真菌和不接种丛枝菌根真菌。试验共有 20 个处理，每个处理设置 24 个生物学重复。

供试香橙和枳壳的种子经由 1‰高锰酸钾灭菌 2 min 后播种，发芽后选取 10 cm 高、生长一致的植株移栽于花盆（盆口直径 15 cm、盆高 12.5 cm、底部直径 11 cm）。先在花盆底部垫一张与底部大小一致的纸片，加入 1/2 已灭菌的基质。按照每个菌株的接种量为 300 个孢子 / 盆，在植株根部周围放 AM 真菌接种体，使其与根系充分接触，继续加入基质至花盆的 3/4，同时保证基质没过根系，按菌株编号挂上标签。对照组（CK）为加等量的灭菌基质。每 2 周供一次 Hoagland 营养液。

1.2.2 测定项目与方法

（1）生长性状：接种 30 d 后测定各处理的株高、茎径和叶片数。此后每 60 d 测定一次，共测定 3 次。株高测定用直尺测量土面到植株顶端的距离，茎径采用游标卡尺测定距土面 1 cm 处的茎粗，叶片数为除子叶外的所有成熟叶数量。

（2）根系侵染：在接种 150 d 后，采集老、嫩、粗和细 4 种不同的根系，清水冲洗后用 50% 酒精浸泡保存待测。

根系染色参考王幼珊等^[12] 的方法，并略作改进：将植株根系放入组织包埋盒中，加 20% KOH，90℃水浴 0.5 h，清水冲洗 3 次；加入碱性 H₂O₂ 脱色 2 h，清水冲洗 3 次；加 5% 冰乙酸，酸化 2 h；加 5% 墨水醋染液，66℃水浴染色 1 h，用清水漂洗 3～5 次，用清水浸泡 12 h以上脱色备用。

根系检测参考 Trouvelot 等^[13] 的方法，使用尼康 Eclipse Ci-L 和 DS-Ri2 观察菌根侵染。用 MYCOCALC 对结果进行计算，用 3 个参数描述菌根侵染状况：根系中的菌根侵染频率（F%）、根系中的菌根侵染强度（M%）和侵染根系中的丛枝丰度（a%）。

（3）生物量：接种 150 d 后，将植株清洗、阴干，然后将植株地上部分和地下部分装至信封袋于 105℃杀青 30 min、70℃烘干至恒重后称得干重。分别计算地上生物量及地下生物量^[14]。测得生物量后可计算出菌根依赖性（MD）^[15]。计算方法为：

根据 Nemec^[16] 的分类方法，可将植物对菌根的依赖程度分为 3 级：MD ≥ 300%，为高强度依赖；300%>MD ≥ 200%，为中等强度依赖； 200%>MD ≥ 100%，为弱依赖或无依赖。

（4）根系活力：接种 150 d 后称取 0.5 g 新鲜根系，用氯化三苯基四氮唑法（TTC）^[17]测定其根系活力。

（5）氮、磷含量：分别称取已研磨的烘干植物叶片和根系样品（测量生物量后的样品）各 0.1 g，分别用奈式比色法和钼锑抗吸光度法测定氮、磷含量，以质量分数 ω 计，数值以克每百克（g/100 g）表示。

1.2.3 数据整理与分析

使用 Excel 2019 进行数据整理，SPSS 25.0 进行统计分析，最小显著性差异（LSD）法进行多重比较，Origin 2021 作图。根据王佼等^[18]运用的模糊数学中隶属函数的方法，对各指标求其隶属值并累加综合比较。隶属函数值 =（X-Xmin）/（Xmax-Xmin），式中，X 为某一指标的测定值；Xmax 为某一指标测定值中的最大值；Xmin 为某一指标测定值中的最小值；将各指标隶属函数值进行累加并求其平均值，平均值越大，菌株促生长效果越好。

2 结果与分析

2.1 接种不同 AM 真菌对不同砧木生长的影响

由表2 可见，不同接种处理显著影响柑橘砧木的茎径（P<0.05），在同一接种处理下不同砧木的茎径也存在显著差异（P<0.05）。茎径在不同接种处理和不同砧木之间存在显著交互作用（P<0.05）。从不同接种处理来看，与 CK 相比，大部分接种处理能促进柑橘砧木茎径的生长，且随着植株的生长，促生长效果越明显。但也有少部分接种处理存在抑制作用。同一接种处理对不同砧木茎径生长有所差别，且差异显著。在接种第 30 和 90 d 时，同一接种处理，大部分枳壳的茎径生长优于香橙，但在接种第 150 d 时，大部分香橙的茎径生长优于枳壳，且差异显著。不同接种处理中，促进香橙茎径生长效果较好的是 R.c、R.i 和 G.r。接种 150 d 时与 CK 相比增加了 134.4%、130.5% 和 119.5%。而对枳壳茎径生长较好的菌株是 G.v、R.c 和 R.i。在接种 150 d 时比 CK 分别增加了 121.2%、97.1% 和 97.1%。

注：数据为各处理的平均值 ± 标准误差，同列不同小写字母表示同一砧木品种不同菌株差异显著（P<0.05）。下同。

由表3 可见，不同接种处理显著影响柑橘砧木的株高（P<0.05），同一接种处理不同砧木的株高也存在显著差异（P<0.05）。同时，株高在不同接种处理和不同砧木之间存在交互作用（P<0.05）。不同接种处理对砧木的株高存在促进和抑制作用。在接种 30 和 90 d 时大部分香橙的株高低于枳壳，但在接种 30 d 时有显著差异，而在接种 90 d 时差异不显著，在接种 150 d 时，大部分香橙的株高显著高于枳壳。不同接种处理中，对香橙株高生长促进作用较好的菌株是 R.i、R.c 和 A.s。与 CK 相比分别提高了 149.7%、137.3% 和 130.0%； 对枳壳株高生长促进作用较好的菌株是 G.v、R.c 和 A.e。与 CK 相比，分别提高了 232.8%、203.9% 和 112.1%。

由表4 可见，不同接种处理对柑橘砧木的叶片数存在显著差异（P<0.05），同一接种处理不同砧木的叶片数也同样存在显著差异（P<0.05）。且叶片数在不同的接种处理和不同的砧木之间存在交互作用（P<0.05）。同样，不同接种处理对砧木叶片数的生长存在促生和抑制两个作用，且随着植株的生长，其效果越来越明显。同一接种处理对不同砧木叶片数的影响也有不同。在接种 30 d 时，香橙的叶片数显著少于枳壳；接菌 90 d 时，大部分香橙的叶片数低于枳壳，但差异并不显著；到接菌 150 d 时，大部分香橙的叶片数显著多于枳壳。不同接种处理中，对香橙叶片数促生长效果较好的菌株是 R.i、A.s 和 G.r。与 CK 相比，分别增加了 165.6%、 141.9% 和 136.8%。对枳壳叶片促生长效果较好菌株的是 G.v、R.c 和 A.e，与 CK 相比，分别增加了 247.3%、230.0% 和 177.6%。

2.2 不同 AM 真菌对不同砧木的侵染

AM 真菌的孢子在宿主植物根际周围萌发形成根外菌丝，并侵染进入植株根内形成根内菌丝、泡囊以及丛枝等结构，其独特的丛枝结构是宿主植物和 AM 真菌之间养分和碳交换的主要场所。而根系侵染率和丛枝丰度等是宿主植物与 AM 真菌共生关系强弱的重要指标，侵染率越高说明其共生关系越好。在本试验中（表5），各菌株都能侵染香橙和枳壳，但不同菌株之间和不同砧木之间的侵染率、侵染强度及丛枝丰度均存在差异。在不同菌株中除了 A.s 和 R.c 两个菌株在香橙中侵染率较低外，其他菌株的侵染率均达到 75.00%；在枳壳中侵染率较低的菌株为 A.s 和 G.v；香橙中侵染强度和相对丛枝丰度普遍高于枳壳，且枳壳有 4 个菌株处理的根系相对丛枝丰度为 0.00%。其中，D.t 均能高度侵染香橙和枳壳，其侵染率和相对丛枝丰度均达到 75.00% 以上。

2.3 接种不同 AM 真菌对不同砧木干重的影响

由图1 可见，不同接种处理显著影响柑橘地上部和地下部干重（P<0.05），不同砧木之间的地上部和地下部干重也存在显著差异（P<0.05），同时柑橘砧木的干重在不同接种处理和不同砧木之间存在显著交互作用（P<0.05）。从不同接种处理来看，香橙有 7 个接种处理的地上部干重显著高于枳壳，仅有 A.e 和 C.l 的地上部干重低于枳壳。其中，香橙地上部干重较高的菌株是 R.c、D.t 和 R.i，较 CK 分别提高了 592%、 579% 和 562%。枳壳地上部干重较高的菌株是 G.v、 R.c 和 R.i，较 CK 分别提高了 775%、638% 和 558%； 从不同接种处理的地下部干重来看，香橙有 6 个处理的地下部干重高于枳壳，而 A.e、C.l 和 G.v 3个菌株低于枳壳。其中香橙的地下部干重较高的处理为 G.r、 R.c 和 D.t，与 CK 相比分别提高了 572%、572% 和 507%。枳壳地下部干重较高的是 G.v、R.c 和 R.i，较 CK 分别提高了 478%、376% 和 322%。

注：不同小写字母表示同一砧木不同接种处理间差异显著（P<0.05）。

2.4 不同 AM 真菌对不同砧木的菌根依赖性

由表6 可见，不同接种处理显著影响柑橘生物量，不同砧木的生物量也存在显著差异，同时生物量在不同接种处理和不同砧木之间存在显著交互作用。且不同接种处理和不同砧木之间菌根依赖性均存在差异，但总体来看，香橙的依赖性比枳壳高。香橙在接种 R.c、G.r 和 D.t 时的菌根依赖性最高， MD 指数分别为 682%、657% 和 650%，均为高强度依赖。而枳壳在接种 G.v、R.c 和 R.i 时的菌根依赖性最高，MD 指数分别为 718%、600% 和 534%，为高强度依赖。

2.5 接种不同 AM 真菌对不同砧木根系活力的影响

由表7 可见，不同砧木之间的根系活力差异显著，接种处理的香橙根系活力显著高于枳壳，而 CK 的根系活力却低于枳壳。从同一砧木不同接种处理来看，香橙接种处理的根系活力均显著高于 CK，其中根系活力最强的菌株是 G.r、C.l 和 G.v，与 CK 相比分别提高了 1391%、633% 和 573%。而枳壳只有少部分菌株的根系活力显著高于 CK，其中根系活力较高的菌株为 D.t、C.l 和 R.c，与 CK 相比分别提高了 68%、56% 和 16%。

2.6 接种不同 AM 真菌对不同砧木氮含量的影响

香橙和枳壳的叶片和根系中的氮含量在不同接种处理之间存在显著差异（P<0.05），但不同砧木之间根部氮含量存在显著差异（P<0.05），而叶片氮含量差异不显著。且叶片和根系的氮含量在不同接种处理和不同砧木之间存在显著交互作用（P<0.05）。从香橙的不同接种处理来看，地上部氮含量显著高于 CK 的菌株只有 A.e，根部氮含量显著高于 CK 的菌株同样也是 A.e。从枳壳的不同接种处理来看，所有接种处理的地上部氮含量均低于 CK，而大部分接种处理根部氮含量都高于 CK，其中较高的菌株为 R.c、G.v 和 D.t。

2.7 接种不同 AM 真菌对不同砧木磷含量的影响

地上部的磷含量在不同砧木之间不存在显著差异，但根部的磷含量在不同砧木之间差异显著，且香橙的根部磷含量显著高于枳壳（P<0.05）。除香橙地上部的磷含量在不同接种处理间不存在显著差异外，其他均在不同接种处理间存在显著差异。同时根部磷含量在不同接菌处理和不同砧木之间存在显著交互作用（P<0.05），但地上部磷含量不存在交互作用。从香橙的不同接种处理来看，地上部磷含量较 CK 高的菌株是 G.v、F.m 和 C.l，根部磷含量较 CK 高的菌株是 R.c。从枳壳的不同接种处理来看，地上部磷含量较 CK 高的菌株是 F.m、A.s 和 C.l，根部磷含量较 CK 高的菌株是 D.t、R.i 和 R.c。

2.8 不同砧木及不同 AM 真菌的隶属函数值分析

通过对种植 150 d 时的生长指标、生物量、氮磷含量、根系活力等指标进行隶属函数分析（表10），各处理中除了香橙的 A.e 和 C.l 两个接种处理的隶属函数平均值低于 CK 外，其他处理均高于 CK。这说明除了 A.e 和 C.l 两个菌株对香橙生长具有抑制作用外，其余菌株均能促进植株的生长发育。其中促进香橙生长发育较好的菌株为 G.r 和 R.c，促进枳壳生长较好的菌株为 R.c 和 G.v。

3 结论与讨论

已有研究表明，AM 真菌能促进柑橘对根系范围以外的矿物营养元素的吸收，从而促进其生长。柑橘根系根毛短且数量稀少，十分依赖与 AM 真菌形成共生来吸收土壤中的水分和矿质营养^[19]。而 AM 真菌对宿主植物具有一定的选择性^[20]，因此，要发挥菌根效应的关键之一就是要找到宿主植物和 AM 真菌的最优组合。

在本试验中不同砧木接种不同 AM 真菌的生长效应有所不同，主要表现为促进生长、抑制生长和无效应，这与吴强盛等^[21]的表述一致。通过隶属函数值分析来看，除 A.e、C.l 两个菌株对香橙存在抑制作用外，其余菌株均为促进作用。其中促进香橙生长较好的菌株为 G.r、R.c 和 R.i。促进枳壳生长较好的菌株为 R.c、G.v 和 D.t。然而，不同菌株促进不同指标生长，如 D.t 虽然对香橙幼苗株高、茎径和叶片数生长表现不突出，但在植株干重中表现出优势；R.c 虽能显著促进香橙幼苗株高和茎径的生长，但在叶片数中表现不突出。因此，可能存在某一 AM 真菌只促进植株某一指标，而不表现出对所有指标具有促生长作用（表10）。Wang 等^[22] 确定了球囊霉属是柑橘的优势 AM 真菌属。但在本试验中发现，香橙和枳壳的优势 AM 真菌属除了球囊霉属外，根孢囊霉属的促生效应也值得重点关注，此外，多样孢囊霉属对枳壳的促生效应也较明显。

本试验所供试的菌株均能侵染两个砧木，但不同的菌株之间侵染率有所差异，且对不同的砧木侵染率也有所不同。有研究发现接种 AM 真菌植株即使有较高的侵染率，却不能促进植株生长，甚至抑制生长。本试验的结果也证实了这一点，比如在本试验中供试的菌株 A.e 和 C.l 在香橙中的侵染率均高达 80% 以上，但抑制了香橙的生长发育。吴强盛等^[21]认为如果菌根自身的营养消耗大于给植物的供给，菌根可能由共生转为寄生，从而限制植物生长。相反，侵染率低的菌株同样具有良好的促生长作用，如 R.c 和 G.v 对香橙和枳壳的侵染率分别为 15% 和 30%，但均表现出较好的促生长作用。因此，菌根侵染率并不能评判菌根对植株的促生效应。

菌根依赖性是用来衡量植物对菌根真菌的生长效应。早在 1978 年 Menge 等^[15]研究了不同柑橘品种在不同磷条件下的菌根依赖性，发现不同柑橘品种对同一菌株的菌根依赖性有所差异。本试验结果与这一说法一致，其中香橙的平均菌根依赖性要高于枳壳。有的研究者认为菌根依赖性与磷素有关，但也有研究者发现其他营养元素如铜、锌、锰等也能改变菌根依赖性^[15]。还有研究者认为不同植物对同一菌根菌种的依赖性差异与不同植物的生长速率有关，认为枳苗的矮化性状也许可以作为估计不同株系枳菌根依赖性大小的依据^[23]。本试验还发现，香橙的根系活力显著强于枳壳，这一结果与菌根依赖性的结果成正相关关系。

大量研究表明，接种 AM 真菌能改善植株营养，促进根系对氮、磷的吸收，但在本试验中各接种处理和对照的磷含量差异不大，这可能是取样方式不当或其他原因造成的，应该做进一步的重复试验。综上所述，不同柑橘砧木的优势 AM 真菌不同，筛选出各砧木的优势菌为下一步的柑橘菌根种苗应用奠定基础。

参考文献