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工业化和城市化的迅速发展导致了我国大量的耕地土壤受到重金属污染，其中镉（Cd）污染最为严重和普遍[1-5]。重金属污染会损害土壤品质，破坏土壤生态功能，降低作物产量，并随食物链不断积累放大，从而威胁人类健康，潜在危害极大[6-8]。重金属会影响土壤微生物的种类、活性、数量和结构等指标，从而破坏它们的生态功能[9-10]。目前在重金属对根际微生物群落的影响方面研究较少。植物根际生活着大量的土壤微生物，真菌作为根际微生物组的重要组成部分，与植物病害密切相关[11-13]。因此，研究重金属 Cd 胁迫对植物根际真菌群落的影响具有重要的现实意义。
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番茄（Lycopersicon esculentum）是全世界的主要设施作物之一，是继马铃薯和洋葱之后全球第三大生产和消费的蔬菜[14]，我国番茄的播种面积占蔬菜总播种面积的 4.7%[15-16]。在我国云南昆明某地重金属 Cd 污染农田土壤的田间调查时发现，番茄萎蔫病发病率较高，严重影响当地的农业发展。已有研究表明，非生物胁迫（干旱胁迫）极易导致剑麻受到黑曲霉菌的侵染而患茎腐病[17]，但目前未见重金属胁迫是否会导致植物根际富集病原菌的相关报道。基于 Cd 污染导致番茄富集了某种病原真菌而患萎蔫病的假设，本研究采用高通量测序的方法探索番茄在不同浓度 Cd 胁迫下的根际真菌群落结构与多样性，并分离差异菌和验证其致病性，本研究可为安全利用中、轻度重金属污染农田土壤提供科学依据。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料
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供试品种为大红番茄合作 903，产自上海虹桥天龙种业有限公司。供试土壤取自云南省昆明市东川区小江沿岸的番茄地（0～10 cm 土层），干燥过 1 mm 筛备用。土壤理化性质：铵态氮 596.25 mg/kg，有效磷 18.44 mg/kg，速效钾 265.46 mg/kg， pH 值 7.89，Cd 含量 21.86 mg/kg。
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1.2 试验设计
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以东川原始土壤作为对照（CK）组，并在此基础上配置 Cd（26、30、34、38 mg/kg）污染土壤 （分别用 Cd1、Cd2、Cd3、Cd4 表示），置于含水率为 20%～25% 的条件下稳定 15 d，土壤风干过筛后分别装入塑料盆中，每盆 1 kg。筛选颗粒饱满的番茄种子，75% 酒精浸泡 3 min，再用 5% NaClO 溶液浸泡 5 min，无菌水冲洗 5 次，完成种子表面消毒并播种。待种子发芽后，移栽长势一致的番茄幼苗，3 株/盆，每组处理 3 个重复。85 d 后收集番茄根际土壤，一份放入-80℃冰箱中保存，用于土壤总 DNA 的提取；一份用于测定重金属 Cd 的可交换态（EX-Cd）、碳酸盐结合态（CB-Cd）和总含量 （Total Cd），按照 Tessier 提取程序进行[18]。
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1.3 土壤真菌群落的 Illumina Miseq 测序
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根据制造商的方案，使用试剂盒（ 型号 D3142，广州美基生物科技有限公司，中国）进行土壤样品的 DNA 提取。后续利用 NanoDrop 微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。按照 Toju 等[19] 的说法，相比于其他可变区， ITS2 区（ 包括 ITS3_KYO2 和 ITS3_KYO2） 可以检测到更多的物种。因此，本工作选择的引物为 ITS3_KYO2（GATGAAGAACGYAGYRAA）和 ITS4 （TCCTCCGCTTATTGATATGC）。PCR 扩增后，使用 AMPure XP Beads 对第二轮扩增产物进行纯化，用 ABI StepOnePlus RealTime PCR System（Life Technologies，美国）进行定量，根据 Novaseq 6000 的 PE250 模式 pooling 上机测序。广州基迪奥生物科技有限公司负责 Illumina Miseq 测序工作。Alpha 和 Beta 多样性、物种组成和相关性热图等数据通过 OmicShare 工具在线平台（www.omicshare.com/tools）分析。
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1.4 真菌的分离
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取 0.1 g 番茄根际土壤于 10 mL 离心管中并添加 5 mL 生理盐水配置成悬浮液。进行梯度稀释后均匀涂布于 R2A 琼脂培养基平板上，划线分离纯化真菌菌株。通过 ITS 序列进行初步鉴定（派森诺生物科技有限公司，中国上海）。
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1.5 真菌的致病性测定
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利用水培法探究真菌对番茄的致病性[20]。番茄种子按 1.2 所述进行表面消毒后置于无菌石英砂中育苗，黑暗环境培育 6 d。后续移入装有 850 mL 1/2 霍格兰营养液（pH=7.0±0.2）的实验室专用植物水培盒中定植。12 d 后，加入 1% 培养好的织球壳菌 （R-2）孢子悬浮液。每组 4 个平行，共计 8 个处理。15 d 后收获植物，测量根长、株高、鲜重。
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1.6 数据分析
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试验数据采用 SPSS 26.0 进行统计分析，表示为具有标准偏差的平均值。应用单因素方差分析来评估不同处理对分析参数的影响，使用沃勒-邓肯（P<0.05）检验各处理之间的差异，独立样本 T 检验用于比较两组数据，利用 Origin 2022 和 OmicShare 工具绘制所有图表。
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2 结果与分析
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2.1 土壤中镉的形态分布及番茄生物量
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利用盆栽试验探究番茄根际真菌对 Cd 胁迫的响应规律，收获后测定其根际土壤中的 Cd 含量，主要包括总镉、有效态镉和碳酸盐结合态镉。图1a 展示了 Cd 在根际土壤中的分布情况， Total Cd 含量为 20～40 mg/kg，EX-Cd 和 CB-Cd 含量在 1～15 mg/kg 之间。随着植物可利用组分 EX-Cd 和 CB-Cd 的增加，Cd 对番茄生物量产生的负面影响不显著（图1b）。相比于 CK，各形态 Cd 的引入甚至轻微增加了地上部分的重量。这可能是因为金属离子激活参与细胞分裂素代谢的酶，从而加速植物生长[21]。总的来说，番茄对 Cd 的耐受能力较强，可能需要超过 50 mg/kg 的 Cd 污染才能显著改变番茄的生物量，Zhao 等[22] 报告了类似的研究结果。
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图1 番茄根际土壤中镉的形态分布和生物量
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注：小写字母不同表示各处理间差异显著（P<0.05）。
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2.2 镉胁迫影响番茄根际土壤真菌群落多样性
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真菌 OTU 丰富度的稀疏曲线几乎达到饱和，这表明测序工作满足真菌群落分析的数据要求（图2a）。表1 展示了番茄根际真菌群落多样性指数，辛普森 （Simpson）和香农（Shannon）指数并未发生变化，但是 Chao 和 ACE 指数明显降低，说明 Cd 胁迫影响番茄根际真菌类群的存活，显著降低真菌丰富度。采用基于 unweighted-Unifrac 距离的 PCoA 法在 OTU 水平上分析根际真菌群落结构（图2b），两个轴上的总解释率分别为 17.58% 和 16.20%。CK 和 Cd1 两组是低浓度 Cd 污染的代表，两组在二维图上的距离较近； 而 Cd2、Cd3 和 Cd4 3 个处理组的菌群结构较为相似，说明 Cd 胁迫在一定程度上改变了番茄根际土壤真菌的群落结构。综上所述，Cd 胁迫会降低番茄根际土壤真菌群落的多样性，影响其组成和群落结构。
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图2 不同处理下土壤真菌群落的稀释曲线和主坐标分析
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注：表中数据为平均值 ± 标准差（n=3），不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。
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2.3 镉胁迫对番茄根际土壤真菌组成的影响
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遭受 Cd 胁迫的番茄根际土壤中共检测出 7 个真菌门（图3a），主要是子囊菌门（Ascomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和毛霉门（Mucoromycota）。在原始土壤中，子囊菌门、壶菌门和毛霉门所占比例分别为 59.74%、19.93% 和 1.15%；而在 Cd4 处理组中占比分别达到了 96.19%、0.50% 和 0.32%。子囊菌门是丰度变化最为显著的物种（图3d），也是唯一产生显著性组间差异的类群。这些都表明 Cd 胁迫显著改变了番茄根际土壤真菌群落的相对丰度，选择性富集了子囊菌门的微生物，且富集程度随 Cd 浓度的增加而增加。进一步来说，类似富集现象在属和种水平上更为明显。如图3b 所示，相比于 CK 处理组，织球壳属（Plectosphaerella）真菌的丰度在所有 Cd 处理组中都增加了，并从 Cd2 处理组中开始明显富集。不仅如此，织球壳属还是与 3 种 Cd 形态唯一呈明显正相关关系的类群（图3e）。种水平上的物种组成图（图3c）与相关性热图（图3f）显示了同样的选择效应，即黄瓜织球壳菌（Plectosphaerellacucumerina）是 Cd 胁迫富集的具体真菌类群。由此可见，Cd 胁迫明显改变了番茄根际土壤真菌的组成与丰度，驱动番茄重新组装根际微生物群落。
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2.4 真菌的纯培养
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在本研究工作中，总共分离纯化出 10 株真菌。序列比对结果表明，命名为 R-2 的菌株序列与已经报道的 Plectosphaerellacucumerina 的 ITS 序列同在一个组，同源性为 99.23%～100.00%；R-2 在 GeneBank 数据库中的序列号为 MW260110.1。所属分类地位为子囊菌门、盘菌亚门、粪壳菌纲、肉座菌亚纲、织球壳科、织球壳属。菌株 R-2 在 R2A 培养基上的生长情况如图4 所示，7 d 菌落直径达 5.1 cm，边缘整齐，存在少量气生菌丝。现有研究已表明，黄瓜织球壳菌能造成多种农作物的萎蔫病[23]，尤其是在大棚番茄中较为常见。
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图3 镉胁迫对番茄根际土壤真菌群落在不同分类水平上的影响
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注：a、b 和 c 分别代表门、属和种水平上排名前 10 的真菌物种；d 代表优势菌门 Ascomycota 在各处理组之间的变化；e 和 f 分别代表真菌丰度在属和种水平上与 Cd 的相关性。Ascomycota：子囊菌门；Chytridiomycota：壶菌门；Chlorophyta：绿藻门；Mucoromycota：毛霉门；Anthophyta：黄藻门；Nematoda：线虫门；Basidiomycota：担子菌门；Mortierellomycota：被孢霉门；Ciliophora：纤毛亚门；Bryophyta：苔藓植物门；Plectosphaerella：织球壳属；Fusarium：镰刀菌属；Clonostachys：枝穗孢属；Cladosporium: 枝孢菌属；Actinomucor：放射毛霉属；Acremonium：枝顶孢霉属； Stephanonectria：阶菌属；Alternaria：链格孢菌属；Pratylenchus：短体线虫属；Asterarcys：未列明属类。Plectosphaerellacucumerina：黄瓜织球壳菌；Clonostachys rosea：粉红粘帚霉菌；Cladosporium sphaerospermum：球孢枝孢菌；Actinomucor elegans：雅致放射毛霉菌；Stephanonectriakeithii：未列明菌类；Fusarium solani：茄腐皮镰刀菌；Pratylenchusgoodeyi：未列明菌类；Mangifera indica：未列明菌类；Periconiabyssoides：黑团孢菌； Stachybotryschartarum：黑葡萄穗霉菌。其中，未列明菌类指暂无明确文献记录或没有具体中文名的微生物。* 表示 P <0.05，** 表示 P <0.01， *** 表示 P <0.001。
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图4 黄瓜织球壳菌 R-2 在 R2A 培养基上的菌落生长情况
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2.5 真菌致病性测定
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水培试验表明，与 CK 处理组相比，浸染 R-2 的植株较为矮小，生物量明显降低（图5a）。在试验后期，根表面逐渐变黄、粗糙，主根难以伸长，侧根和次生根较少（图5b）。R-2 处理组中番茄植株的株高、根长和鲜重都显著降低，生长受到明显抑制。具体来说，CK 处理组的株高、根长和鲜重分别是 12.6 cm、18.3 cm 和 2.0232 g，浸染 R-2 处理组的株高、根长和鲜重分别是 9.9 cm、9.7 cm 和 1.3194 g，分别降低了 21.43%、46.99% 和 34.79%。前人研究表明，由黄瓜织球壳菌引起的番茄萎蔫病症状在开花期和坐果期后显现，根系容易变黑腐烂，病株少果或果实难以成熟[24]。在实际的农业生产中，该菌极易导致番茄患病减产，使种植者遭受巨大的经济损失。水培结果证实，Cd 胁迫下番茄根际土壤中富集到的真菌 R-2 即使在幼苗期也具有较强的致病性，显著抑制番茄的正常生长发育。
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图5 水培验证 R-2 的致病性
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注：CK 和 R-2# 分别表示空白对照组和接种 R-2 的处理组；采用独立样本 T 检验表示两组处理差异显著，* 表示 P<0.05，** 表示 P<0.01，*** 表示 P<0.001。
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3 讨论
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3.1 空白土壤中 Cd 的含量
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如图1 所示，CK 处理组中土壤总 Cd 含量的设置并非处于零点，主要考虑了两个实际因素：（1） 东川土壤是现实污染土壤，具备实际研究价值。（2） 实际污染土壤中的微生物经历了较长时间的环境选择，具有较好的耐镉特性，后续富集到的有益微生物可能能够应用到实际生产中。基于上述考虑，本研究选择了现实污染的土壤作为对照处理组，Cd 依然是整个试验设置中最主要的选择压力。
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3.2 镉胁迫介导番茄根际富集病原真菌
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根际真菌群落作为植物的病原体、分解者和互惠互利者，在植物生产力和健康方面发挥重要作用[25-26]。在田间条件下，植物同时受到真菌病害和多种非生物胁迫。研究表明，干旱胁迫会增加鹰嘴豆干根腐病（Rhizoctonia bataticola 引起）、黑根腐病（Fusarium solani 引起）和枯萎病（Fusarium oxysporum 引起）的发生率[27-28]；盐胁迫和干旱会使蚕豆更易遭受镰刀菌属的侵袭[29]。但是，有关重金属胁迫对植物根际真菌群落的影响研究还比较缺乏。因此，本研究以模式植物番茄为研究对象，并利用盆栽试验探究 Cd 胁迫对番茄真菌群落多样性的影响。高通量测序结果表明，Cd 胁迫显著降低番茄根际土壤真菌群落的多样性，改变物种组成和丰富度。这与前人研究结果一致，Cd 污染扰乱土壤微生物活性，显著改变土壤微生物群落的组成[10]。环境因子相关性分析表明，黄瓜织球壳菌对 Cd 的响应较为积极，与 3 种形态的 Cd 呈显著正相关关系。物种组成上也体现了黄瓜织球壳菌的富集，种水平上，其在 CK～Cd4 处理组中的存在比例分别为 1.18%、2.89%、19.61%、12.89% 和 21.39%。高浓度的 3 个处理组（Cd2～Cd4）中织球壳菌的丰度显著高于低浓度处理组（CK～Cd1），虽然丰度在 Cd3 处理中减少了，可能是由于样品误差所致，但整体的富集趋势依然存在。将高浓度和低浓度组中的织球壳菌丰度进行统计学分析，发现其在高浓度处理组中显著富集（CK+Cd1 VS Cd2+Cd3+Cd4 为 2.04 VS 19.94，P=0.039）。因此，番茄遭受 Cd 胁迫显著富集了黄瓜织球壳菌。
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3.3 番茄根际富集黄瓜织球壳菌的方式
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植物受到胁迫时会主动分泌特异性化合物[30]和植物激素[31-32]以选择和确立植物微生物组。过氧化物酶活性升高[33]和类黄酮含量增加[34-35]是植物面临重金属胁迫的常见反应。研究发现，番茄的根系分泌因子（过氧化物酶）会吸引致病性尖孢镰刀菌趋向寄主植物根部生长[36]，暴露在损伤、盐和病原体攻击等胁迫下的番茄根系分泌物对土壤中的木霉属真菌也有较强的吸引力[37]，根结线虫对番茄根系分泌物中的类黄酮响应较为明显[38]。因此，当番茄受到重金属 Cd 胁迫时，可能依靠过氧化物酶-类黄酮系统抵御 Cd 的毒害，而这两种他感物质的分泌吸引了黄瓜织球壳菌在番茄根际大量定殖，具体机制有待进一步研究。早期报道显示，黄瓜织球壳菌的寄主范围广泛，可侵染番茄[24]、地黄[39]和草莓[40]等多种作物，造成根腐和萎蔫症状，严重损害作物品质及产量。水培结果验证了该菌的致病性，即使在幼苗期也能显著降低番茄的生物量，影响植株的正常生长和根系伸长。这些都表明 Cd 胁迫会诱导番茄富集“萎蔫病”的致病真菌—黄瓜织球壳菌。
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4 结论
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我国农田土壤重金属污染严重，危害了土壤生态安全和人类健康。本研究以番茄为研究对象，利用盆栽试验并联合高通量测序技术，首次明确报道了重金属胁迫下植物选择性富集病原真菌的现象，可为农田重金属污染的微生态风险评估及农业生产提供科学依据。
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摘要
植物根际真菌群落与植物的健康紧密相关，且我国农田土壤重金属镉（Cd）污染严重，因此，探究 Cd 胁迫对农作物根际真菌群落的影响具有重要的现实意义。通过盆栽试验，采用 Illumina 高通量测序技术研究 Cd 胁迫对番茄根际土壤真菌群落的影响。结果表明，Cd 胁迫明显改变了番茄根际土壤真菌的组成和结构，显著降低了 Chao 和 ACE 指数，增加了子囊菌门（Ascomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和毛霉门（Mucoromycota）等优势菌门的丰度。Spearman 相关性分析表明，Cd 胁迫会导致“萎蔫病”的致病真菌黄瓜织球壳菌（Plectosphaerella cucumerina）的显著富集。为了验证富集真菌的致病性，分离黄瓜织球壳菌的纯培养（菌株命名：R-2）。水培试验表明，R-2 显著降低了番茄幼苗的株高（21.43%）、根长（46.99%）和鲜重（34.79%），验证了 R-2 是植物病原菌。总体而言，发现 Cd 胁迫会导致番茄根际富集植物病原真菌这一现象，可为中、轻度 Cd 污染农田土壤的安全生产提供科学依据。
Abstract
Rhizosphere fungal communities are intimately related to plant health. Soil contamination with the heavy metal cadmium（Cd）is a serious problem in China，so it is vital to explore the effects of Cd stress on tomato rhizosphere fungal communities. Pot experiments and Illumina high-throughput sequencing technologies were used to investigate the effects of Cd stress on tomato rhizosphere fungal assemblages. Results showed that Cd stress altered the composition and structure of soil fungus in tomato roots，significantly lowered the Chao and ACE indexes and boosted the abundance of dominant phylum such as Ascomycota，Chytridiomycota，and Mucoromycota. According to Spearman correlation analysis，Cd stress significantly enriched Plectosphaerella cucumerina，which often cause“wilt sickness.”Plectosphaerella cucumerina（R-2） was isolated to determine its pathogenicity. Hydroponic experiments showed that the inoculation of R-2 significantly reduced the plont height，root length and plant height by 21.43%，46.99% and 34.79%，respectively，in comparison with control， confirming that R-2 is a phytopathogenic pathogen. Overall，above-mentioned results suggested that Cd stress caused the enrichment of phytopathogenic fungi Plectosphaerella cucumerina in the rhizosphere of tomato，which may give a scientific basis for guaranteeing the safety of farming systems in agricultural soils damaged with moderate and mild heavy metals Cd.
Keywords
rhizosphere microbiome ； tomato ； cadmium contamination ； soil ； rhizosphere fungi ； plant health