氮是作物生长发育所必需的大量营养元素，在植物生理代谢中起重要作用，是植物体内蛋白质、氨基酸、核酸、磷脂、酶、叶绿素、维生素和植物激素等组成的成分^[1]。氮肥对作物产量的贡献可达 40%～50%，氮素供应不足将会降低作物的产量与品质^[2]。常用的氮肥主要有尿素、硝酸铵、硫酸铵等。尿素（脲）属于酰胺态氮肥，分子式为 CO（NH₂）₂，纯品为白色或淡黄色针状结晶，易溶于水，呈中性。全球对尿素的需求估计在 2020 年达到 1.878 亿 t，预计到 2026 年将达到 2.115 亿 t，以每年 2% 的速度增长，其中约 80% 的需求预计用于化肥使用^[3]。根据中国氮肥工业协会的数据， 2019 年中国合成氨总产量近 5760 万 t，氮肥产量 3960 万 t，其中尿素肥料产量为 2460 万 t^[4]。尿素中的理论氮为 46.66%，实际上尿素肥料氮含量为 46.0%～46.60%^[5]。根据国家推荐性标准 GB/ T2440—2017《尿素》，农业用（肥料）尿素总氮 （N）的质量分数≥ 46.0% 为优等品，≥ 45% 为合格品。

目前氮肥品种中，尿素氮含量高，价格相对较贵，市场上尿素假冒伪劣产品常有出现。假冒尿素的危害一是养分含量低，农民按尿素适用量施用会导致作物减产及品质下降；二是氯化铵假冒尿素，在部分忌氯作物上施用，会导致作物生产受到抑制；三是尿素伪品损害农民利益，影响了正规企业的生产经营，扰乱了氮肥市场秩序。

识别市场上的假冒和劣质尿素肥料产品非常重要。检查尿素肥料的外观和产品包装标签，观察速度快，但并不准确。确定肥料质量的可靠方法是根据尿素产品的标准测试氮、水分、缩二脲、颗粒强度和尺寸分布等参数。利用凯氏蒸馏滴定法定氮是测定尿素最常用的方法^[6-7]。ISO 19746： 2017^[8]规定了基于高效液相色谱（HPLC）测定尿素肥料中尿素含量的程序。AOAC（国际分析化学家协会）开发了 3 种方法测定肥料中的尿素，包括 AOAC 959.03（脲酶法）、983.01（液相色谱法）和 2003.14（液相色谱法）^[9-12]。这些理化性质测定方法检测周期长、成本高，且费时费力。

X 射线衍射仪（XRD）是分析和研究晶体物质的重要技术。其原理是：高速电子与靶材碰撞产生的 X 射线照射到晶体物质上时，因原子面间距与入射 X 射线波长数量级相当，故可将晶体视为衍射光栅。当一束 X 射线照射到物体上时，受到物体中原子的散射，每个原子都产生散射波，这些波互相干涉，就产生了衍射。根据晶体衍射公式—— 布拉格方程：2dsinθ=nλ，式中θ为 X 射线入射角度，λ 为 X 射线的波长，d 为晶面距，n 为反射能级。康凯等^[13]通过 XRD 测定了中草药的滑石粉，并将样品 XRD 图案的 3 个强峰与 ICDD（国际衍射数据中心）提供的滑石粉卡进行比较，以识别滑石粉的合格、不合格和假冒产品。崔晓慧等^[14]通过 XRD 技术分析了 Os Draconis 样品，建立了高质量的 Os Draconis 的 XRD 指纹。结果表明，如果与指纹的相似度超过 0.83，则可以识别出真正的 Os Draconis。XRD 系统可用于根据肥料样品的晶体结构分析其成分。Wissa 等^[15]使用 XRD 数据对佛罗里达州磷酸盐矿区的磷矿黏土和尾矿中的矿物种类进行了定量估计。从黏土样品中检测到的非黏土矿物种类为磷灰石、石英、白云石、波浪石、蔓越石和长石。磷灰石占所有非黏土矿物的 53%。通过 XRD 实验结果，Chauhan 等^[16]发现在印度市场和工业的一些磷肥样品中存在主要成分氟磷灰石、羟基磷灰石、氯磷灰石。Khan 等^[17]进行了 XRD 分析，研究了不同改性对纳米沸石复合肥结构稳定性的影响。发现 2θ角值处的强度峰值与硅酸铝钠的 CCDC No-01-074-1183 匹配良好。尿素具备晶体结构，用 XRD 方法对尿素进行物相鉴定具有可行性，但利用 XRD 对肥料尿素真假进行鉴定，尚未见相关报道。本实验采用 XRD 对 17 个不同来源的尿素真品进行分析，获得衍射峰的晶面间距 d 值、峰位 2θ角值、衍射强度等特征值，建立尿素 XRD 指纹图谱，在此基础上对尿素真伪样品进行分析，利用相关系数法、夹角余弦法进行相似度匹配，开展 XRD 鉴别方法的验证研究。本研究拟建立肥料尿素产品的 XRD 鉴别分析方法，为保障尿素产品质量及其产品监管提供重要的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试样品

建立 XRD 指纹图谱尿素样品代号 Z1 到 Z17，样品从市场和生产企业收集。样品中 N 含量为 46.4%～46.7%，符合尿素标准要求。用于方法验证的肥料样品共 11 个：未知肥料样品 6 个，编号分别为 Y1、Y2、Y3、Y4、Y5 和 Y6；N 含量分别为 18.60%、21.31%、46.42%、28.63%、14.99%、 28.77%，Y3 含氮量 46.42%，满足国家推荐性标准 GB/T2440—2017《尿素》的氮含量要求，可鉴定为尿素正品，其他样品含氮量不高于 28.63%，复合肥 Y5 氮含量最低，为 14.99%，Y2 氮含量为 21.3%，为硫酸铵，均不符合 GB/T2440—2017 《尿素》的氮含量要求。配制样品 5 个，编号分别为 H1、H2、H3、H4、H5，是尿素试剂与硫酸铵试剂的混合，质量比分别为 1∶5、2∶4、3∶3、 4∶2、5∶1。样品研磨并通过 0.149 mm 尼龙网筛分后，在 XRD 测量之前，样品在 110℃烘箱中干燥 24 h。

1.2 仪器设备

天平（XP205DR，瑞士 Mettler Toledo）；X 射线衍射仪（Empyrean，荷兰 Panalytical 公司）；元素分析仪（Vario Pyro Cube，德国 Elementar 公司）。

1.3 实验步骤

样品干燥后，用玛瑙研钵研磨，过 0.15 mm 筛，制成待测试样。取约 180 mg 试样，置于 XRD 仪器样品板的凹槽处，按照仪器操作程序采集图谱，每个样品 3 次重复测定，得到数据并计算平均数图谱。仪器工作条件：入射光源为铜靶辐射，靶管电压 40 kV，电流 30 mA，采用连续扫描方式，扫描步长 0.013°，2θ范围设置为 5.04°～64.97°，扫描速度 2θ为 7.9°/min。

1.4 数据分析

XRD 数据由 X'Pert 数据收集器获得，并由 X'Pert HighScore Plus 3.0 进行分析。对每个样品重复测定 3 次，每次测定扫描 3 次。计算平均值和标准差。利用 Origin 8.0 通过选择相对衍射强度为 ≥ 0.5% 的峰，绘制 XRD 图谱。

方法验证样品的数据与尿素 XRD 指纹图谱之间进行相似度分析，采用相关系数法和夹角余弦法进行。计算公式为：

$\text{相关系数}=\frac{\sum _{i=1}^n\left(x_i-{\stackrel{-}{x}}_i\right)\left(y_i-{\stackrel{-}{y}}_i\right)}{\sqrt{\sum _{i=1}^n{\left(x_i-{\stackrel{-}{x}}_i\right)}^2{\left(y_i-{\stackrel{-}{y}}_i\right)}^2}}$

$\text{夹角余弦}=\frac{\sum _{i=1}^n{x}_i{y}_i}{\sqrt{\sum _{i=1}^n{x}_i^2}\sqrt{\sum _{i=1}^n{y}_i^2}}$

式中，Xi 为验证样品 XRD 图谱中第 i 个峰位 2θ或晶面间距 d 值，Yi 为尿素 XRD 指纹图谱中第 i 个峰位 2θ或晶面间距 d 值，n 为各自图谱特征峰数目。验证样品图谱的 2θ和 d 值偏离尿素 XRD 指纹图谱相应数值的 3 倍标准偏差范围，视为无对应，相应数据以 0 表示。

以 2θ为聚类指数，对 11 个验证样品进行系统聚类分析，应用欧氏距离法测量样品之间的距离。

2 结果与分析

2.1 尿素 XRD 指纹图谱建立

测得 17 个尿素正品 XRD 图谱及其平均数图谱见图1。通过 HighScore plus 进行寻峰处理，得到尿素共有特征峰 11 个。当 2θ平均值为 22.25°时峰强度最大，衍射强度定为 100%，以此为基准，相对衍射强度 I/I₀ 在 2%～10% 之间对应的峰位有 5 个， 2θ平均值分别为 24.59°、29.29°、31.64°、35.50°、 37.07°。相对衍射强度 I/I₀ 在 0.5%～2% 之间对应的峰位个数有 5 个，2θ平均值分别为 40.48°、 41.54°、45.39°、49.53°、54.91°。统计 17 个尿素正品共有特征峰 2θ、晶面间距 d 和相对衍射强度 I/I₀ 的平均值，建立尿素 X 射线衍射特征数据，平均值与标准偏差的结果见表1，从而建立尿素 XRD 特征指纹图谱。

注：a 图为 17 个尿素样品的 XRD 衍射图，b 图为 17 个尿素平均数 XRD 衍射图（特征指纹图谱）。

注：数据以平均值±标准偏差表示（17个样品，每个样品 3次重复，n=51）。

2.2 方法验证

2.2.1 样品测定结果

图2a 为 5 个混合样品 XRD 的衍射图，尿素与硫酸铵混合样品 H1～H5 均出现了尿素特征峰数量，尿素含量愈高，峰强度增加越明显，相反，硫酸铵特征峰数量减少，强度降低。H1～H5 与正品尿素平均值 2θ匹配的共有峰的个数分别为 5、7、 11、11、11，未与正品尿素 2θ匹配的峰的个数分别为 20、15、12、8、6。

图2b 为 6 个化肥样品的 XRD 衍射图，Y1、 Y3、Y4、Y6 均在 2θ= 22.25 °附近出现相对强度 100% 的衍射峰，其中 Y3 与尿素平均图谱峰形峰位一致，Y2、Y5 与尿素平均图谱相差较大。Y1～Y6 与尿素正品平均值 2θ匹配的共有峰的个数分别为 7、3、11、5、1、5，未与正品尿素 2θ匹配的峰的个数分别为 20、19、0、8、 13、8。

2.2.2 相似度计算

以 17 个尿素正品共有峰 2θ和 d 值平均数为对照，采用相关系数法和夹角余弦法计算 11 个验证样品的相似度，11 批验证样品匹配度结果见表2，肥料尿素正品及伪品可明显区分。

2.3 验证样品的聚类分析

图3 为 11 个验证样本的聚类分析结果。当欧氏距离大于 10 时，11 个样本聚类在两组。Y3 和真尿素聚集在一起，其他样品聚集在一起。当距离设置为 8.5 时，11 个样品聚类在 4 组中，H1、 H2、H3 和 Y5 在同一组中，Y1、Y6、Y4、H5 和 H4 聚集在一起，Y2 为单个组，Y3 和尿素形成致密簇。

3 结论与讨论

尿素是重要的氮肥品种，传统的尿素产量质量及其真伪的鉴定主要依据国家推荐性标准 GB/T2440—2017《尿素》，需要测定氮养分等技术指标，但该方法检测周期长，费时、费力。尿素在常温下具有晶体结构，按其几何形态的对称程度属四方晶系，P42₁m（Z=2）空间群。在室温下晶胞参数：a=b=0.5576 nm，c=0.4692 nm，α=β=γ=90°^[19]。铜靶辐射产生的 X 射线波长与尿素晶体的原子面间距相近，尿素晶体可作为衍射光栅。当 X 射线照射到晶体表面时，晶体中每个原子都产生散射波，这些波相互干涉，结果就产生衍射，满足晶体衍射公式——布拉格方程：2dsinθ=nλ^[18-19]。

本研究探讨利用 XRD 建立了尿素真伪的鉴定技术。选择了 17 个肥料尿素正品，获得 XRD 图谱，确定共有特征峰 11 个，计算特征峰 2θ、晶面间距 d 和相对衍射强度 I/I₀ 的平均值，从而建立了尿素 XRD 特征指纹图谱。将该图谱与国际衍射数据中心（ICDD）尿素 PDF 卡片进行比对，结果非常一致（图1），表明建立的肥料尿素 XRD 特征指纹图谱可用。利用该指纹图谱对验证样品进行相似度分析，判别尿素真伪，指纹图谱相似度的计算方法包括：峰重叠率法（Nei 系数法）、马氏距离法、欧氏距离法、相关系数与夹角余弦法、程度相似度法等。王淑慧等^[20]通过 22 个优质信阳毛尖茶样品建立了信阳毛尖茶汤成分的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，利用相关系数法、夹角余弦法、Nei 系数法等 6 种相似度计算方法，对 19 个普通信阳毛尖茶 HPLC 图谱进行相似度分析，结果显示，用该指纹图谱相似度的方法能够对信阳毛尖茶进行分等定级。陈龙等^[21]通过 10 批正品阳起石建立了阳起石的 XRD 指纹图谱，利用相关系数法和夹角余弦法对 5 个阳起石掺混样品及伪品 XRD 图谱进行相似度分析，正品阳起石的相似度不低于 0.98，掺混样品相似度在 0.85～0.97 之间，伪品样品相似度低于 0.2，结果表明，相似度分析可将正品、伪品及掺混阳起石样品进行区分。通过前人的研究成果可见，利用 XRD 指纹图谱鉴别样品真伪是可行的。

为进一步验证本研究方法的可行性，把尿素与硫酸铵按照不同比例进行混合，利用 XRD 测定 5 个混合样品 H1～H5，得到 2θ和 d 值，与上述得到的尿素特征指纹图谱进行比对，5 个混合样品 H1～H5 能检测到尿素与硫酸铵相关特征峰。样品 XRD 图谱混入了硫酸铵的特征峰，与尿素纯品的匹配度明显下降，这可通过相似度分析来确证， H1～H5 的 2θ、d 值与尿素特征指纹图谱之间的相关系数值分别在-0.5911～0.8761、-0.3877～-0.2555 之间，夹角余弦值分别在 0.2327～0.9123、0.3324～0.6636 之间。相似度随尿素比例的增大而增大，随硫酸铵比例的增大而减小。

Y1～Y6 的 2θ、d 值与尿素特征指纹图谱之间的相关系数值分别在-0.8530～1.0000、-0.6713～1.0000 之间，夹角余弦值分别在 0.0356～1.0000、 0.1291～1.0000 之间。Y3 样品的匹配度均为 1.0000，鉴定为尿素正品，其他样品均不是尿素。Y5 和 Y2 样品相似度最低，2θ、d 值的相关系数低于-0.62，夹角余弦低于 0.17。Y5 和 Y2 样品与尿素正品 XRD 图谱（指纹图谱）匹配峰的个数均不超过 3 个，且这两个样品的 XRD 图谱在 2θ=22.25°时无最强峰，鉴定 Y5、Y2 是伪品（不含尿素样品）。氮含量测定证实了该结果，Y5 氮含量最低，Y2 为硫酸铵。 Y1、Y4、Y6 的 2θ、d 值与尿素特征指纹图谱之间的相关系数分别在-0.7316～-0.3761、-0.2764～-0.2236 之间；夹角余弦分别在 0.3030～0.3873、 0.4165～0.4987 之间。Y1、Y4、Y6 与尿素正品 XRD 图谱（指纹图谱）匹配峰的个数均不少于 5 个，且 3 个样品的 XRD 图谱在 2θ=22.25°时有最强峰，推断 Y1、Y4、Y6 为尿素掺混样品的可能性较大。相似度结果显示，尿素真品的相似度在 0.95 以上。不含尿素样品 2θ、d 值的相关系数均低于-0.62，夹角余弦低于 0.17。尿素掺混样品 2θ、 d 值的相关系数在-0.73～0.88 之间，夹角余弦在 0.23～0.91 之间。相关系数法显示的差异比夹角余弦法大，尿素掺混样品与伪品（不含尿素样品）相关系数值有重叠。本实验选取的尿素 XRD 指纹图谱特征峰共有 11 个。查阅相关系数检验临界值表显示，若自由度 df=9，相关系数值为 0.73，置信概率 P<0.01，则达极显著水平。根据统计学概率分布，结合本研究结果，可明显看出实测图谱 2θ、d 值与尿素指纹图谱相关系数在 0.73 以上，样品检测到含有尿素特征，相关系数在 0.95 以上，样品可判定为尿素纯品。聚类分析作为辅助验证方法，在距离数为 8.5 时，尿素混合样品 H4、H5 与尿素掺混样品 Y1、Y4、Y6 成组，尿素占比较低的混合样品 H1、H2、H3 与氮含量极低的 Y5 聚为一类，硫酸铵样品 Y2 单独一组，聚类分析结果和相似度分析一致。

本研究建立了尿素平均 XRD 指纹图谱，尿素 XRD 特征峰有 11 个，2θ值分别为 22.25°、24.59°、2 9.29°、31.64°、35.50°、37.07°、40.48°、41.54°、 45.39°、49.53°和 54.91°，2θ在 22.25°时峰值强度最高。基于相关系数和夹角余弦开展相似度分析，将实测图谱与尿素特征 XRD 指纹图谱相匹配，实测图谱 2θ、d 值与尿素指纹图谱相关系数在 0.95 以上鉴定为真尿素。该方法可准确区分正品尿素样品、掺混尿素样品及伪品。与传统鉴定尿素方法相比，XRD 方法鉴定尿素肥料是非破坏性、快速，准确的定性手段，为尿素鉴定开拓了新方向。但 XRD 作为昂贵的大型分析仪器普及率不高，该方法需要操作人员有较高的解析和判定图谱的能力，因此，该方法也存在一定的局限性。

参考文献