氮、磷、钾是植物生长发育不可或缺的三大元素，植物所需要的磷大部分通过土壤吸收，而土壤中供植物吸收的磷素主要是有效磷。测定土壤中的有效磷含量可以及时了解土壤中磷的供应情况，从而进行针对性施肥，不仅保障了作物的生长发育，而且对控制土壤污染具有深远意义^[1-4]。

目前，土壤有效磷的测定方法有化学法^[5]、同位素示踪法、生物测定法等^[6]，其中化学方法中的 Olsen 法^[7]与其他方法相比应用最为广泛，该方法使用的是碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，但土壤中的有机质造成土壤浸提液有颜色，从而产生很强的背景吸收^[8]，会干扰有效磷的测定，其过程操作较为繁琐，使用试剂较多，检测效率低。有研究表明，测定结果受浸提液体积、振荡时间、振荡温度、显色温度等^[9-13]多方面影响，但是测定结果应是各个方面因素间的交互作用，只讨论单方面的影响难以得到准确的测定结果。因此，优化测定条件显得尤为重要。本实验基于 Olsen 法，采用正交实验法对测定条件进行优化，用碳酸氢钠溶液浸提土壤后，稀释酸化浸提液后直接使用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）进行测定，免去 Olsen 法中加入活性炭吸附有机质、加入显色剂显色等过程，优化了实验路径，避免了后续显色反应的各种操作对实验结果的影响，从而提高了测定的准确性。

正交实验法是目前常用的研究多因素多水平的一种实验设计方法，可分析多因素间的交互作用，是一种高效处理多因素优化问题的科学计算方法^[14]。在本研究中，通过以 Olsen 法为参考，确定以浸提液体积、振荡浸提时间、振荡浸提温度及稀释倍数为因素和水平，从而筛选最佳测定条件，使用电感耦合等离子体发射光谱仪进行测定，以期为今后准确测定土壤有效磷的方法提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

电感耦合等离子体发射光谱仪（PRODIGY 美国）、电子天平（CP513 江苏）、台式冷冻恒温振荡器（THZ-C-1 江苏）。

碳酸氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、盐酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、1000 mg/L 磷标准溶液（ 坛墨质检-标准物质中心）、土壤有效态成分标准物质 （GBW07412a、GBW07413a、GBW07414a、GBW07417a、GBW07459、GBW07460、GBW074461，地球物理地球化学勘查研究所）。

1.2 仪器工作条件

电感耦合等离子体发射光谱仪的工作参数和条件：观测方式为垂直；冷却气 19 L/min；辅助器 0.4 L/min；雾化器 1.0 L/min；泵速 25 r/min；RF 功率 1.1 kW；检测器温度-30℃。

1.3 实验方法

1.3.1 正交实验方案设计

Olsne 法中在浸提液体积 50 mL，振荡温度 （25±1）℃下振荡浸提 30 min，采用钼锑抗比色法不需要稀释。本正交实验基于 Olsne 法将浸提液体积设计为 40、50 和 60 mL 3 个水平，振荡浸提时间设计为 15、30 和 45 min 3 个水平，振荡浸提温度设计为 20、25 和 30℃ 3 个水平，稀释倍数设计为 1、2 和 4 倍 3 个水平。正交实验因素和水平见表1。

根据正交实验因素和水平可知，该实验为 3 水平 4 因素正交实验，查正交表为 L₉（3⁴），只需进行 9 组实验，设计方案见表2。

1.3.2 实验步骤

称取土壤有效态成分标准物质（GBW07412a） 2.5 g 于锥形瓶中，后加 40、50、60 mL 0.5 mol/L 的碳酸氢钠溶液，在恒温 20、25、30℃下以 200 r/min 振荡 15、30、45 min 后过滤。取滤液 10 mL 于 50 mL 离心管中加入 0、10、30 mL 的 1 mol/L 的盐酸溶液，缓慢加入防止产生的二氧化碳使浸提液逸出，待产生的气体全部消失，根据正交实验方案，完成 9 组实验后使用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）进行测定。

1.3.3 计算公式

$W_p=\frac{\left(c-c_0\right)\times V\times t_s}{m\times k}$

式中：W_p——有效磷含量，mg/kg；c——从标准曲线上获得的待测液的磷浓度，mg/L；c₀——从标准曲线上获得的空白溶液的磷浓度，mg/L；V——待测液体积， mL；t_s ——分取倍数；m——风干土样质量，g；k—— 由风干土样换算成烘干土样的水分换算系数，取 1。

2 结果与分析

2.1 正交实验结果

正交实验结果见表3，该土壤有效态成分标准物质（GBW07412a）的有效磷含量为（100±16）mg/kg，由表3 可知，实验 2、实验 3 和实验 9 的测定值均在认定值范围内，相比实验 3 与实验 9，实验 2 使用浸提液少，浸提时间短，因此，可作为最优实验条件。

均值 1、均值 2、均值 3分别代表水平 1、水平 2、水平 3下有效磷含量的平均值。极差反应各因素对实验指标的影响，极差越大则该因素对实验指标的影响越大。

分析表3 可知，影响土壤有效磷测定值的因素依次为浸提液体积 >振荡浸提温度 >振荡时间 >稀释倍数，最佳测定方法为实验 2，即浸提液体积 40 mL、振荡时间 30min、振荡浸提温度 30℃、稀释倍数 2 倍。

2.2 验证土壤有效磷最佳测定方法

2.2.1 标准曲线和检出限

用与样品等比例的碳酸氢钠和盐酸混合溶液将 1000 mg/L 的磷标准溶液逐级稀释为 0.1、0.5、1、 2、4、6、8、10 mg/L 的磷标准溶液。按照仪器工作条件依次测定，以磷标准溶液的浓度为横坐标，仪器的响应值为纵坐标绘制标准曲线。结果（图1） 显示，磷标准溶液的浓度与仪器的响应值在浓度 0～10 mg/L 范围内呈线性关系，线性回归方程为 y=8690.6x-30.034，相关系数为 0.9999。

对 11 份样品空白进行测定，计算标准偏差，以 3 倍标准偏差计算方法检出限，结果见表4。由表4 可知，方法检出限为 0.0435 mg/kg，以 4 倍检出限作为方法定量下限为 0.174 mg/kg。

2.2.2 精密度和准确度

对 7 个土壤有效态成分标准物质（GBW07412a、 GBW07413a、GBW07414a、GBW07417a、GBW07459、 GBW07460、GBW074461） 进行 12 次测定，计算测定值的相对误差及相对标准偏差，精密度和准确度结果见表5。由表5 可知，相对误差为 0.5%～6.2%，相对标准偏差为 1.8%～6.6% （n=12），表明该方法精密度较高，满足分析要求。测定值与认定值对比分析可知，测定结果均在认定值范围内，说明该方法准确度较高。

2.3 优化法与 Olsen 法的比较

优化法与 Olsen 法比较见表6，优化法所用浸提液少，不需要使用显色试剂，简化操作流程，更适合大批量的土壤有效磷的测定。

3 结论

在 Olsne 法的研究基础上，采用碳酸氢钠浸提-电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定土壤中的有效磷含量，使用正交实验法优化土壤有效磷测定条件，可知影响土壤有效磷测定值的因素依次为浸提液体积 >振荡浸提温度 >振荡时间 >稀释倍数，确定了浸提液体积 40 mL、振荡时间 30 min、振荡浸提温度 30℃、稀释倍数 2 倍（1 mol/L 的盐酸溶液稀释）的最优条件，对该条件及实验方法进行验证。结果表明，该方法有效磷含量在 0～10 mg/L 范围内线性良好，线性系数为 0.9999； 方法检出限为 0.0435 mg/kg； 精密度和准确度良好，土壤标准物质的测定结果均在认定值范围内，相对误差为 0.5%～6.2%，相对标准偏差（n=12）为 1.8%～6.6%。对比两种方法得出，采用碳酸氢钠浸提-电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定土壤中的有效磷含量，结果准确可靠，操作流程简单，减少试剂用量，可适用于批量土壤有效磷样品测试工作。

参考文献