旱地红壤是红壤耕地的主要利用方式之一，因光热资源丰富、地形地貌丰富多样，一直是南方发展农业多种经营、推进农业供给侧结构改革的重要土壤资源。然而，长期以来，受自然和人为等因素的影响，红壤酸、黏、瘦等特性越来越突出^[1-2]，农业生态系统脆弱，生物多样性锐减，严重制约了区域农业的可持续发展。生物炭因碳含量高且结构稳定、呈弱碱性的特性，兼具提高土壤有机碳含量，改善土壤理化性状，减少温室气体排放的功能^[3-5]，与旱地红壤酸、黏、瘦等障碍因子修复高度契合，对旱地红壤具有多种修复作用，被众多学者推荐为旱地红壤固碳、增加土壤养分和提高作物产量的优选改良剂^[6-7]。

细菌作为土壤微生物中数量最大、种群最多的类群，在土壤有机质形成与分解、养分循环与转化以及提升生态系统生产力等生态过程中发挥重要作用，是衡量土壤肥力、指示土壤质量和生态系统稳定健康的重要指标。生物炭一方面因较大的比表面积结构及对水肥的吸附作用为土壤微生物提供良好的栖息环境^[8]，另一方面，生物炭施用可以改善土壤理化特性、增加养分有效性等^[9]，进而影响微生物的数量和结构。但生物炭对土壤微生物的影响与土壤质地及肥力状况、土地利用方式、养分管理、试验条件（室内培养或者田间试验）以及生物炭施用量等密切相关^[10]。以往研究表明，较高用量生物炭的培肥增产效果明显，但在生产上经济效益不高^[11-12]，尤其是红壤区春蚀秋旱的气候特点，一次大量施用会致使 70% 以上的生物炭随径流水流失^[13]，不仅造成经济损失，而且造成第二次污染，上述问题也成为秸秆生物炭在红壤旱地推广应用的瓶颈。随着生物炭在农业领域的应用研究不断深入，其环境友好性和资源节约性潜力日益受到重视。

低量生物炭（如秸秆半量 / 全量炭化还田量） 连续施用不仅减少农民经济压力，而且在增加土壤有机碳含量、提高土壤 pH 和作物产量的效果也很明显^[4，14-15]。前期研究表明，红壤旱地每年施 750 或 1500 kg·hm^-2 生物炭对土壤有机碳含量具有持续稳定的促进效果^[16-17]。但是，低量生物炭连续施用对土壤微生物的影响研究较少，生物炭连续施用是否通过连续提供可利用的碳源和营养物质而增加微生物数量，或者因改变土壤理化性质而间接影响微生物结构组成，目前尚不清楚。因此，本文以 2013 年开展的长期定位试验为平台，研究低剂量生物炭长期连续施用下土壤细菌群落多样性及结构特征变化，探究其与土壤理化性质的关系，以期为生物炭利用的可持续性、红壤旱地土壤碳库稳定性的深入研究以及红壤旱地肥力稳定提升和酸化防治“共赢”提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验样地位于江西省红壤研究所旱博园 （116°20′24″E，28°15′30″N）内。该区为中亚热带季风气候，年均气温 17.5℃，年均降水量 1587 mm，年均蒸发量 1150 mm。试验地土壤为第四纪黏土母质发育而成的红壤，土壤（0～20 cm） 理化性质：pH（H₂O）5.0，有机质 12.18 g·kg^-1，全氮 1.64 g·kg^-1，全磷（P）1.01 g·kg^-1，全钾（K）7.73 g·kg^-1。

1.2 试验设计

该试验始于 2013 年，根据全国小麦、水稻等秸秆每公顷每季产量，按照秸秆炭化率 30% 计算得到的每公顷秸秆生物炭（500℃，4h） 量^[14]，当地秸秆产生量为 6000～7500 kg·hm^-2 时，可收集量约 4500 kg·hm^-2。按照秸秆全量炭化还田的用量约为 1500 kg·hm^-2，半量炭化还田量约为 750 kg·hm^-2。设置不施秸秆生物炭（对照，CK）、半量炭化还田（750 kg·hm^-2，C1）和全量炭化还田（1500 kg·hm^-2，C2）3 个处理，每个处理 3 次重复，随机区组排列，小区面积 21 m² （3.5 m×6 m）。

供试生物炭是秸秆于 350～500℃条件下厌氧烧制而成，其基本理化性质为：pH 10.35，有机碳 467.20 g·kg^-1，全氮 5.9 g·kg^-1，全磷 14.43 g·kg^-1，有效磷 4.7 mg·kg^-1，全钾 11.5 g·kg^-1，阳离子交换量（CEC）217 cmol·kg^-1。试验采用红薯-油菜轮作，每年 5—9 月种植红薯（苏薯 8 号），10— 次年 4 月种植油菜（丰油 730）。试验地各处理油菜季施肥，按 N 150 kg·hm^-2、P₂O₅ 60 kg·hm^-2、K₂O 75 kg·hm^-2 施加，分 2 次施用，基施 70% 氮肥、 80% 钾肥和全部磷肥，冬前追施剩余的氮肥和钾肥，各季作物栽培方式和田间管理措施按照当地习惯进行。

1.3 测定指标及方法

2021 年，油菜收获后，按五点取样法采集 0～20 cm 土层土壤样品，在室内剔除石砾、肉眼可见的植物残体及根系等杂质后，一部分自然风干磨碎过筛，另一部分土样密封并保存于 4℃冰箱中备用。土壤 pH、有机质、全氮、碱解氮、硝态氮、铵态氮等采用常规分析方法测定^[18]。土壤微生物生物量碳采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法测定^[19]。土壤溶解性有机碳采用水浸提法提取、总有机碳分析仪测定。

采用 Soil DNA Kit 试剂盒（OMEGA 公司，美国） 进行土壤 DNA 的提取。细菌样品测序引物是 515F/907R，引物序列为 515F（5'-GTGC CAGCMGCCGCGG-3'），907R（5'-CCGTCAAT TCMTTRAGTTT-3'）^[20]。土壤微生物总 DNA 提取和测序服务委托上海派森诺生物科技有限公司完成。

1.4 数据处理与分析

采用 QIIME 1.7.0 分析原始序列，用 FLASH 拼接成对的末端序列，通过 UPARSE 方法将序列在 97% 相似性水平下聚类并分配给操作分类单元（OTU），使用 16S rRNA Greengene13.8 数据库对各 OTU 代表序列进行物种注释。根据 OTU 表的结果，得到样品的物种组成比例情况。采用 R 4.2.2（R 语言程序包 ggplot2）进行土壤理化性质和土壤微生物数据统计分析和制图。

2 结果与分析

2.1 施用生物炭对土壤细菌群落结构和组成的影响

从门水平的分类来看（ 图1a），变形菌门 （Proteobacteria，29.22%～33.30%）、酸杆菌门 （Acidobacteria，22.74%～29.17%）、放线菌门 （Actinobacteria，8.55%～12.25%）、芽单胞菌门 （Gemmatimonadetes，6.03%～9.43%）、绿弯菌门 （Chloroflexi，5.87%～8.00%）和拟杆菌门（Bacteroidetes，3.41%～6.60%）6 个门类是所有处理中的优势菌群，其相对丰度之和约占土壤细菌总量的 90%。不同生物炭处理的土壤细菌优势菌群相对丰度存在差异（图1b），其中，C1 处理中放线菌门的相对丰度较 CK 显著提高了 24.73%（F=5.75， P<0.05），而绿弯菌门的相对丰度较 CK 显著降低了 18.90%（F=5.46，P<0.05）；C2 处理中拟杆菌门的相对丰度较 CK 显著降低了 39.03%（F=25.61， P<0.001）。

注：（a）相对丰度，（b）优势细菌相对丰度；不同小写字母表示不同处理同一物种间的差异显著（P<0.05）。

图2 结果显示，不同处理土壤细菌种类数量大小为：C2（共有细菌种类 3761 种）>C1（共有细菌种类 3756 种）=CK（共有细菌种类 3756 种）。CK 处理和 C1、C2 两种生物炭措施处理之间共有细菌种类 37 种（ 占总体的 0.38%）， CK 和 C1 处理之间共有细菌种类 413 种（占总体的 4.20%），CK 和 C2 处理之间共有细菌种类 469 种（占总体的 4.77%），C1 和 C2 处理之间共有细菌种类 484 种（占总体的 4.92%）。CK 处理特有细菌种（2837 种，占总体的 28.84%）高于 C1 处理特有细菌种（2822 种，占总体的 26.68%） 和 C2 处理特有细菌种（2771 种，占总体的 28.17%）。

主成分分析结果表明（图3），第一、二主成分贡献率分别为 50.49%、23.61%。具体而言，CK 处理投射点分布在第三和第四象限，C1 处理投射点分布在第一象限，C2 处理投射点分布在第二和第三象限，且不同生物炭处理下土壤细菌组成结构间存在显著差异（R=0.52，P=0.02），C1 和 C2 处理的细菌群落显著不同于 CK，说明土壤微生物群落组成差异较大，微生物群落结构相似程度低。

2.2 施用生物炭对土壤理化性质的影响

由图4 可知，与 CK 相比，C1 和 C2 处理的土壤 pH 分别提高了 0.11 和 0.29 个单位，且 C2 处理显著高于 CK（F=12.15，P<0.05，图4a）；C1 和 C2 处理土壤有机质含量相比 CK 处理分别显著增加 8.70% 和 11.97%，且 C1 和 C2 处理显著高于 CK （F=11.77，P<0.05，图4b），而 C1 和 C2 处理间无显著差异；C1 和 C2 处理土壤碳氮比相比 CK 处理分别显著增加 7.85% 和 8.21%，且 C1 和 C2 处理显著高于 CK（F=24.98，P<0.05，图4j），而 C1 和 C2 处理间无显著差异；C1 和 C2 处理土壤硝态氮相比 CK 处理分别显著降低 10.57% 和 38.63%，且 C2 处理显著低于 CK（F=32.52，P<0.05，图4e）。与 CK 相比，施用生物炭处理对土壤溶解性有机碳（F=0.71，P=0.53，图4c）、微生物量碳（F=1.86，P=0.24，图4d）、铵态氮 （F=2.91，P=0.13，图4f）、碱解氮（F=1.03，P=0.41，图4h）和全氮（F=0.68，P=0.54，图4i）均无显著性差异。

注：不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

2.3 土壤理化性质对细菌群落结构的驱动作用

将土壤 pH、有机质、溶解性有机碳、微生物量碳、全氮、碱解氮、硝态氮、铵态氮和碳氮比理化性质与土壤门水平细菌优势种群进行相关性分析（图5），结果表明，土壤 pH 与 Bacteroidetes （R=-0.89，P<0.01） 和厚壁菌门（Firmicutes）（R=-0.62，P<0.05）呈显著负相关；土壤有机质与 Bacteroidetes（R=-0.78，P<0.01）和 Firmicutes（R=-0.62，P<0.05）呈显著负相关；土壤溶解性有机碳与浮霉菌门（Planctomycetes）（R=0.65，P<0.05）和装甲菌门（Armatimonadetes）（R=0.69，P<0.05）呈显著正相关；土壤硝态氮与 Proteobacteria（R=-0.67，P<0.05） 和 Armatimonadetes（R=-0.71，P<0.05）呈显著负相关，而与 Bacteroidetes（R=0.92，P<0.001） 和 Firmicutes（R=0.87，P<0.01）呈显著正相关；土壤铵态氮与 Chloroflexi（R=-0.69，P<0.05）呈显著负相关；土壤碳氮比与 Bacteroidetes（R=-0.74，P<0.05）呈显著负相关，而与 Planctomycetes（R=0.63，P<0.05） 呈显著正相关。

将土壤门水平细菌群落结构与相应环境因子进行冗余分析（RDA），结果表明，第一、二主成分贡献率分别为 42.72% 和 26.10%，土壤硝态氮（R² =0.77， P<0.01）和 pH（R² =0.54，P<0.05）是影响土壤门水平细菌群落结构变化的主要环境因子（图6）。

注：有机质（OM）、溶解性有机碳（DOC）、微生物量碳（MBC）、全氮（TN）、碱解氮（AN）、硝态氮（NO₃^--N）、铵态氮（NH₄ ⁺-N）。下同。

3 讨论

3.1 生物炭对土壤理化性质的影响

生物炭具有疏松多孔的结构、较高的比表面积和较高的含碳量^[21-22]，施入土壤可改善土壤理化性质，提高土壤肥力^[17，23]。本研究中，与不施生物炭相比，两种生物炭用量（750 和 1500 kg·hm^-2）连续施用 8 年后，能明显提高土壤 pH、有机质和土壤碳氮比，且提高幅度随生物炭施用量的增加而增加，这与以往研究结果一致^[24-26]。生物炭大多呈碱性，且灰分含量较高，可以有效降低土壤交换性 H⁺ 含量，显著提高土壤 pH^[27]。而生物炭独特的表面特性对氮、磷、钾等有很强的吸附作用，降低了土壤养分淋溶损失，同时施入的生物炭会使自身含有的营养元素及微量元素释放到土壤中，进而提高了土壤中全氮等养分含量^[28]。值得提出的是，生物炭处理土壤中铵态氮和硝态氮含量低于对照处理，可能是因为生物炭的多孔结构吸附固持的养分缓慢释放而被植物更好地吸收利用^[29-30]，进而造成作物收获期土壤硝态氮含量显著降低。同时，生物炭施用还可影响土壤微生物活性和结构，从而改变土壤碳、氮循环转化过程，加速有机养分的分解转化，有利于土壤溶解性有机碳、碱解氮含量的增加，但不同生物炭用量对土壤碳、氮累积转化的影响还存在差异^[10，31]。生物炭对土壤有机质、pH 和矿质氮等理化性质的长期影响因生物炭施用量、土壤类型、作物种类等因素而异，其内在作用机制有待进一步研究。

3.2 生物炭对土壤细菌群落结构的影响

本研究中连续施用生物炭后土壤细菌 OTUs 数目有所增加，这与况帅等^[32]和殷全玉等^[33]研究相类似。然而，与不施生物炭处理相比，施生物炭处理土壤中特有细菌种群数量减少，是因为施用生物炭可能促进细菌种间竞争，进而抑制某些菌群的生长^[34]。同时，因生物炭的组分及结构特异性，不同微生物群落对添加生物炭的响应存在差异^[35-36]，因此，生物炭的施用会引起土壤微生物群落结构及多样性的变化^[37]。研究表明，生物炭可以短暂提高细菌多样性和丰度，而随着时间的推移以及重复添加生物炭对细菌群落多样性影响较小^[33]，本研究中生物炭对细菌群落多样性无显著影响（数据未列出）。

本研究中，变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门和拟杆菌门是各处理土壤细菌群落的优势菌门，这与以往研究结果相同^[33，38]。生物炭处理可以增加放线菌门的相对丰度，这与大部分研究结果类似^[39-40]。生物炭的添加为降解顽固碳源的微生物提供了生长机会，放线菌可以有效地降解复杂的芳香类化合物，因此可以增加土壤中放线菌门丰度^[41]。而本研究中拟杆菌门和绿弯菌门丰度的降低可能与施用生物炭后土壤的微环境改变有关。研究认为，生物炭的组分含量大多不能被微生物直接利用^[42]，施用生物炭对微生物群落结构的影响主要是通过改变土壤的养分状况、化学性质等间接途径实现^[40，43]。研究表明，芽单胞菌门与土壤 pH 呈极显著正相关，变形菌门与土壤全氮呈极显著正相关^[44]。本研究中，细菌群落与土壤化学性质参数的冗余分析结果表明，土壤 pH 和硝态氮是影响细菌群落结构的主要因素，土壤有机质、土壤碳氮比和土壤铵态氮也对细菌群落有很大影响。细菌群落结构受多种营养限制，与气候条件和土壤理化性质都有关系^[45]。反之，土壤微生物还是土壤养分转化与循环的动力，不同的细菌类群在土壤中的功能差异显著，拟杆菌门具有分解难降解物质转化为有机物的作用，生物炭虽富含稳定的难分解碳元素，但生物炭连续施用后土壤溶解性有机碳等其他活性有机碳及易分解有机碳组分显著增加，可能是抑制拟杆菌门生长的原因；绿弯菌门和放线菌门参与土壤根际环境的碳、氮等代谢过程^[46]，本试验中，生物炭连续施用直接或间接增加了土壤总碳、全氮含量，改变土壤碳氮比，增加了适应环境的一些特异微生物的种群，而氮素的输入相对不足可能需要微生物分泌更多的氮循环酶来维持土壤生态平衡，进而引起拟杆菌门、绿弯菌门以及放线菌门等相关细菌丰度的改变。本研究发现生物炭对部分土壤细菌相对丰度的影响并未随生物炭用量的增加而加强，土壤铵态氮、硝态氮含量降低，全氮含量增加并未提高有利于土壤氮素固定的绿弯菌门的相对丰度^[33]，说明生物炭影响细菌群落的生态过程较为复杂，而生物炭连续施用对养分的持留作用与细菌丰度改变所带来反面影响这二者的强弱关系也还有待进一步研究，今后将进一步研究生物炭施用量对旱地红壤细菌群落结构的影响。另一方面生物炭对于提升旱地土壤养分有效性和改良微生态具有明显的效果，但本文仅对土壤细菌进行了高通量测序分析，而未涉及其他种类的微生物，还需要深入研究生物炭连续施用对特定功能微生物的影响。

4 结论

总体上，连续施用生物炭均显著提高土壤 pH、碳氮比和有机质含量，而显著降低土壤硝态氮含量；施用生物炭对细菌数量没有显著性影响，但 PCA 分析结果表明，生物炭处理显著改变了细菌群落结构；生物炭处理对细菌优势菌群相对丰度影响明显，显著提高了放线菌门的相对丰度，显著降低了绿弯菌门、拟杆菌门的相对丰度；细菌与环境因素分析表明，土壤硝态氮和 pH 是细菌群落结构变异的主要因子，施用生物炭后土壤理化性质的改变与土壤细菌群落分布具有显著相关性，可为生物炭改良旱地红壤微生物多样性以及群落结构提供数据支撑。

参考文献