马铃薯（Solanum tuberosum L.）是茄科茄属一年生草本植物，是世界上仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物，具备很高的营养价值和药用价值，是目前最具发展前景的作物之一^[1-2]。云南省是我国种植马铃薯最大的省份之一，也是中国马铃薯优势特色产区^[3-4]。合作 88、丽薯 6 号、青薯 9 号作为云南省的主栽马铃薯品种，由于种植规模化、集约化、土地资源、气候条件等因素的限制，产生了严重的连作障碍问题，连作障碍已成为马铃薯产业可持续发展面临的重大难题之一。连作提高了真菌的丰富度和多样性指数^[5]，改变了土壤的真菌群落结构，使有益真菌的含量减少，有害真菌的含量增加，从而增加了土壤传播疾病^[6]。许自成等^[7]研究证实了连作明显增加了土壤真菌的丰富度和多样性，明显改变了烤烟根际土壤的真菌群落结构，且随着连作年限的增加影响越大。谭仲廷等^[8]表明，连作明显增加了百香果中子囊菌门和镰刀菌属等致病菌的相对丰度。吕昭和等^[9]研究证实连作升高了合作 88 马铃薯品种的真菌数量，且球囊霉属在连作 5 年的土壤中丰度最高，在连作 0 年的土壤中丰度最低。

合理的轮作可以降低病原菌数量，维持土壤微生物群落结构，有效抑制病害的发生。川明参与烤烟轮作能够大大减少部分病原真菌^[10]；大葱轮作可明显改善黄瓜根际微生物群落结构，提高细菌与放线菌群落的多样性和均匀度指数，降低真菌群落多样性和均匀度指数^[11]。马铃薯与赤小豆轮作中子囊菌门、担子菌门和被孢霉门的相对丰度都明显低于马铃薯连作土壤中的真菌门相对丰度^[12]。荞麦（Fagopyrum esculentum Moench.）是云南省种植较多的作物，有研究表明，烟草-荞麦轮作能够增加烟草根际多种有益菌的丰度，改善烟草土壤微生态环境，对缓解烟草的连作障碍具有积极作用^[13]。虎德钰等^[14]在对不同轮作方式对苜蓿土壤微生物数量影响的研究中发现，苜蓿荞麦轮作后真菌数量明显低于苜蓿与马铃薯、玉米、高粱、谷子作物之间轮作的真菌数量。张皓等^[15]在对不同轮作方式对半夏土壤物理性状分析的研究中表明，半夏-金荞麦轮作后的土壤物理性状明显优于与太子参、何首乌、苦参之间的轮作。但目前关于连作对云南地区这 3 个马铃薯品种及与苦荞轮作的研究还较少。因此，本研究通过高通量测序技术对云南地区 3 个马铃薯主栽品种的根际土壤真菌群落结构进行分析，研究在不同种植模式下根际土壤真菌群落的变化，旨在为缓解云南地区马铃薯连作障碍引起的微生物群落结构失衡，土壤生产力退化提供理论依据，同时为马铃薯主产区的生产实践提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于 2020—2021 年 4—9 月在云南省昆明市盘龙区云南农业大学试验基地（25°13′99″ N， 102°75′94″ E）进行，该区海拔 1937 m，年平均气温 14.9℃，极端最高气温 31.5℃，极端最低气温-7.8℃。年平均降水量约 1000.5 mm，月最大降水量 208.3 mm，日最大降水量 153.3 mm，降水主要集中在 5—9 月，土壤类型为红壤，其基本化学性状为全氮含量 1.79 g/kg、全磷含量 0.86 g/kg、全钾含量 37.51 g/kg、碱解氮含量 95.90 mg/kg、有效磷含量 52.11 mg/kg、速效钾含量 220.70 mg/kg。

1.2 试验材料与设计

试验采用的 3个马铃薯品种分别为合作 88、丽薯 6 号、青薯 9 号，种薯级别均为一级种；荞麦选用苦荞，品种为线荞。所有试验材料均由云南广汇种植有限公司提供。

试验采取盆栽形式，试验材料种植于外口直径 48 cm，内口直径 41 cm，高度 31 cm，底部直径 26 cm 的塑料盆中，共设连作和轮作 10 个处理，每个处理设 3 次重复（表1）。播种时马铃薯每盆播种 1 粒种薯（整薯播种），苦荞每盆播种 15 粒种子。播种时每盆施 30 g 硫酸钾型复合肥 （N∶P₂O₅∶K₂O=16∶6∶28）作为底肥，于马铃薯现蕾期结合培土每盆施追肥 15 g（所用肥料同底肥一致），所有处理施肥量及灌水量相同，其余管理方法与常规大田管理一致。

注：HZ88、LS6H、QS9H 和 KQ 分别表示马铃薯品种合作 88、丽薯 6 号、青薯 9 号和荞麦品种苦荞。下同。

1.3 取样

于每季收获马铃薯和苦荞时进行根际土取样，使用抖土法将植株边缘土壤抖掉，用刷子收集根系土壤装入自封袋，低温运送。土壤于实验室中过 2 mm 筛后保存于-80℃冰箱中，用于土壤总 DNA 的提取。

1.4 测定方法

使用 TGuide S96 磁珠法土壤基因组 DNA 提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，型号： DP812]对 0.5 g 土壤的总 DNA 进行提取。利用酶标仪（基因有限公司 Gene Compang Limited，型号： synergy HTX）对提取的 DNA 浓度进行检测。以 ITS1F5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2R 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′ 引物对真菌的 ITS1 区片段进行扩增。扩增程序为：95℃预变性 5 min，95℃变性 1 min，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，95℃变性 1 min，60℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共 8 个循环后，再次进行 95℃变性 1 min， 60℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共 20 个循环，72℃延伸 5 min。扩增结束后，采用浓度 1.8% 的琼脂糖对 PCR 扩增产物进行电泳检测，检查扩增效果。对于构建好的文库采用 Illumina Novaseq6000 二代高通量测序平台进行测序。土壤微生物测序服务委托北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.5 数据统计与分析

首先使用 Trimmomatic 0.33^[16] 对原始数据进行质量过滤，然后使用 Cutadapt 1.9.1^[17]进行引物序列的识别与去除，其后使用 USEARCH 10^[18] 对双端序列进行拼接，并使用 UCHIME 8.1^[19] 去除嵌合体，最终得到高质量的序列用于后续分析。使用 USEARCH 10.0^[18] 在相似性 97% 的水平上对序列进行聚类。利用 QIIME2（https：//qiime2. org/）对 Alpha 指数进行分析。以 UNITE（Release8.0，https：//unite.ut.ee/）为参考数据库对特征序列进行分类学注释，可得到每个特征对应的物种分类信息，进而在各水平（门，纲，目，科，属，种）统计各样品群落组成。利用 R 语言工具（ggplot 3.1.1）绘制 PCA 分析图、热图、微生物群落组成结构图等。采用 Excel 2019 进行数据整理，SPSS 25.0 进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 对根际土壤真菌多样性和丰富度指数的影响

对根际土壤真菌丰富度（ACE）、多样性 （Shannon）指数进行分析，其中 ACE 指数越大，真菌群落的丰富度越高；Shannon 指数越大，真菌群落的多样性越高。

由表2 可知，与第一季相比，除 C、G 处理的 ACE 与 Shannon 指数提高及 B 处理 ACE 指数提高以外，其余处理的真菌群落丰富度、多样性指数均处于下降趋势。云南 3 个马铃薯品种连作、轮作后真菌 ACE、Shannon 指数最高的分别是 C、G 处理，最低的分别是 D、F、J 处理。

2.2 对土壤真菌群落结构组成的影响

2.2.1 对根际土壤真菌门分类水平上群落组成及相对丰度的影响

云南地区 3 个马铃薯品种在门水平的真菌群落结构如图1 所示。其中，子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）的占比范围分别为 37%～82%、3%～20%、0.5%～54%、 2%～9%，是所有处理中占比最大的，属于优势菌门，在真菌群落结构中发挥主导作用。

与第一季相比，各处理第二季真菌门类相对丰度的变化存在差异（表3）。与第一季相比，第二季连作处理 A 显著增加了合作 88 土壤中 Ascomycota 丰度的 6.05%，增加了 Mortierellomycota 丰度的 4.30%，轮作处理 E 分别显著降低了 Ascomycota 和 Mortierellomycota 丰度的 45.68% 与 31.06%，轮作处理 H 显著降低了 Mortierellomycota 丰度的 45.01%，Ascomycota 丰度不显著； 连作处理 B 显著增加了丽薯 6 号土壤中 Ascomycota 丰度的 7.57%，显著降低了 Basidiomycota 丰度的5 7.74%，轮作处理 F 分别显著降低了 Ascomycota 和 Basidiomycota 丰度的 50.72% 和 68.09%，轮作处理 I 降低了 Ascomycota 丰度的 1.22%，显著降低了 Basidiomycota 丰度的 62.19%；连作处理 C 显著降低了青薯 9 号土壤中 Ascomycota 丰度的 13.85%，增加了 Basidiomycota 丰度的 11.35%，显著增加了罗兹菌门（Rozellomycota）丰度的 50.79%，轮作处理 G 分别显著降低了 Ascomycota、Basidiomycota、Rozellomycota 丰度的 25.86%、 22.12%、74.22%，轮作处理 J 显著增加了 Ascomycota 丰度的 14.37%，分别显著降低了 Basidiomycota、Rozellomycota 丰度的 52.59%、22.22%。

与连作相比，3 个马铃薯品种轮作的优势真菌门的相对丰度存在差异。与第二季合作 88 的连作处理 A 相比，轮作处理 E 和 H 中 Ascomycota、Basidiomycota 的丰度分别降低了 46.07% 和 9.11%（显著）、17.79% 和 1.69%（不显著）；与第二季丽薯 6 号的连作处理 B 相比，轮作处理 F 中 Ascomycota 的丰度显著降低 53.59%，处理 I 中 Ascomycota 的丰度显著降低 18.31%，Basidiomycota 显著增加 34.79%；与第二季青薯 9 号的连作处理 C 相比，轮作处理 G 中 Ascomycota、Basidiomycota 的丰度分别显著降低 9.44%、30.05%，处理 J 中 Basidiomycota 显著降低 32.90%、Ascomycota 显著增加 12.87%。此外，与合作 88、丽薯 6 号的连作相比，青薯9号连作后 Ascomycota 相对丰度显著降低， Basidiomycota、Mortierellomycota、Rozellomycota 相对丰度显著提高。

注：处理代号后的数字 1、2 分别表示第一季、第二季。下同。

注：大、小写字母不同分别表示第一季和第二季差异极显著（P <0.01）、显著（P <0.05）。下同。

2.2.2 对根际土壤真菌属分类水平上群落组成及相对丰度的影响

云南地区 3 个马铃薯品种在属水平上真菌群落结构如图2 所示。整体上癣囊腔菌（Plectosphaerella）、镰孢菌属（Fusarium）、子囊菌门中未分类属 （unclassified_Ascomycota）、孢霉属（Mortierella）是所有处理中的优势属，占比范围分别为 1%～47%、 3%～13%、0%～17%、1%～9%，在真菌属水平群落结构中发挥重要作用。

与第一季相比，3 个马铃薯品种第二季优势真菌属的相对丰度变化不同（表5）。与第一季相比，连作 A 分别增加了合作 88 马铃薯土壤中 Plectosphaerella、unclassified_Ascomycota、Mortierella 丰度的 44.85%（显著）、113.82%（显著）、1.60%（不显著），轮作 E 分别显著降低了 93.03%、87.04%、 40.43%，轮作 H 分别降低了 unclassified_Ascomycota、Mortierella 丰度的 7.14%（不显著）、45.53%，显著增加了 Plectosphaerella 丰度的 342.10%； 连作 B 分别显著降低了丽薯 6 号马铃薯土壤中 Plectosphaerella、Fusarium 丰度的 24.46%、44.86%，轮作 F 分别显著降低了 Plectosphaerella、Fusarium 丰度的 89.51%、62.71%，轮作 I 显著降低了 Fusarium 丰度的 61.63%，显著增加了 Plectosphaerella 丰度的 182.14%；连作 C 显著降低了青薯 9 号马铃薯土壤中 Plectosphaerella 丰度的 79.33%，显著增加了 Fusarium 丰度的 26.20%，轮作 G 显著降低了 Plectosphaerella 丰度的 92.52%，显著增加了 Fusarium 丰度的 21.65%，轮作 J 显著降低了 Fusarium 丰度的 59.17%，显著增加了 Plectosphaerella 丰度的 588.58%。

分别与第二季连作处理相比（表6），轮作处理 E 和 H 分别降低了合作 88 马铃薯土壤中 Plectosphaerella、炭疽菌属（Colletotrichum）、unclassified_ Ascomycota 的丰度的 94.27% 和 17.41%（ 显著）、 99.14% 和 28.02%（不显著）、94.64% 和 74.97%（显著），分别显著增加了 Fusarium 丰度的 130.10% 和 80.28%；轮作处理 F 和 I 分别显著降低了丽薯 6 号马铃薯土壤中 Plectosphaerella、Colletotrichum、unclassified_Ascomycota 丰度的 86.07% 和 45.17%、98.93% 和 46.34 %、97.34% 和 22.97%，降低了 Fusarium 丰度的 12.84% 和 1.24%；轮作处理 G 分别降低了青薯 9 号马铃薯土壤中 Plectosphaerella、Fusarium、Colletotrichum、unclassified_Ascomycota 丰度的 63.11%（显著）、19.71%（显著）、90.77%（不显著）、85.73%； 轮作处理 J 分别显著降低了 Fusarium 丰度的 54%，增加了 Plectosphaerella、Colletotrichum、unclassified_Ascomycota 丰度的 427.02%、658.46%、32.56%。此外，与合作 88、丽薯 6 号的连作处理相比，青薯 9 号连作后 Plectosphaerella、Colletotrichum 相对丰度显著降低， Fusarium、Mortierella 相对丰度显著提高。

2.3 对根际土壤真菌聚类热图的影响

对云南 3 个马铃薯品种在真菌属水平下的群落结构进行聚类热图分析（图3）。纵向聚类表示不同物种在各样品间丰度的相似情况，两物种间距离越近，枝长越短，说明这两个物种在各样品间的丰度越相似；横向聚类表示不同样品的各物种丰度的相似情况，与纵向聚类一样，两样品间距离越近，枝长越短，说明这两个样品的各物种丰度越相似。

从整体看，A、H 处理聚为一类，与 E 处理距离较远；B、I 处理聚为一类，与 F 处理距离较远； C、G 处理聚为一类，与 J 处理距离较远。说明 A 与 H、B 与 I、C 与 G 处理间物种丰度相似，但分别与 E、F、J 处理的物种丰度差异较大。图中 E 与 G、H 与 I 处理分别聚在一起，说明不同马铃薯品种的同种轮作方式物种丰度较相似。A 与 B 在图中聚为一类，与 C 距离较远，说明合作 88、丽薯 6 号连作后物种丰度相似，与青薯 9 号存在差异。

2.4 对根际土壤真菌主成分分析的影响

对根际土壤真菌主成分进行分析，两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似。由图4 可知，主成分 1（PC1）和主成分 2（PC2）分别解释真菌群落结构变异率为 66.88% 和 18.29%，所有土壤样品被划分为三部分。

图中 A与 B 之间散点距离较近，E 与 F 之间散点距离较近，但 A 与 E、B 与 F 之间的散点距离较远。说明合作 88 与丽薯 6 号马铃薯品种在连作后的真菌群落组成相似，但分别与合作 88 轮作后、丽薯 6 号轮作后的土壤真菌群落组成差异较大，说明轮作明显改变了马铃薯真菌群落组成。而图中 A 与 C、B 与 C 之间的散点距离较远，说明合作 88 与青薯 9 号马铃薯品种、丽薯 6 号与青薯 9 号马铃薯品种在连作后真菌群落组成存在差异。

3 结论与讨论

土壤微生物种类繁多、数量巨大，其群落结构在很大程度上决定着土壤的生物活性，被认为是土壤生态系统变化的预警指标，故越来越多的研究者开始关注土壤微生物多样性和群落结构的变化^[20]。连作改变了土壤细菌和真菌群落的结构和功能，在一定程度上降低了潜在有益微生物的相对丰度，增加潜在致病真菌的相对丰富度，增加了土壤传播疾病的潜在风险，而轮作能够增加土壤中潜在有益微生物，减少土壤中的致病真菌^[21]。

在本研究中（表2），连作增加了丽薯 6 号马铃薯品种的真菌丰富度指数，增加了青薯 9 号马铃薯品种的丰富度和多样性指数。与前人研究表明的连作显著增加马铃薯土壤的真菌菌群丰度以及 Shannon、Simpson 指数^[22-23]、连作增加了大豆土壤真菌的相对丰度和多样性的研究结果一致^[24]。而合作 88 马铃薯品种连作后的真菌丰富度和多样性指数较之前有所下降，这可能是因为云南地区 3 个马铃薯品种间存在差异，且连作年限太短的缘故。除 G 处理外，所有的轮作处理均降低了土壤真菌丰富度和多样性指数，说明轮作可以有效抑制真菌丰富度和多样性指数的增加。与 Xi 等^[25]表明的棉花-玉米轮作能够明显降低真菌群落多样性的研究结果一致。有学者研究发现，大豆长期连作后真菌丰度显著高于大豆轮作^[26]；与马铃薯连作相比，轮作土壤 Chao1 指数和 ACE 指数减少，且差异达显著水平^[27]；白菜-番茄轮作以及大豆-番茄轮作处理中真菌多样性显著低于番茄连作^[28]。在本研究中，与轮作相比，青薯 9 号马铃薯品种连作后真菌丰富度、多样性指数有所提高。

云南地区 3 个马铃薯主栽品种的连作、轮作土壤中真菌群落结构及其在门、属水平上的相对丰度差异较大，得出子囊菌门、担子菌门、壶菌门为主要优势菌门，癣囊腔菌属、镰孢菌属、炭疽菌属为优势真菌属的结果，与王雅琼等^[29]、赵存鹏等^[30]的研究结果一致。

有学者认为子囊菌门、担子菌门主要属于腐食性土壤真菌，参与需氧纤维素降解^[31]，并在分解和腐烂过程中增加疾病发病率。也有学者认为子囊菌门是一些传染性疾病的病原体和重要参与者，易引起根腐、茎腐、果（穗）腐和枝枯等病害^[29，32]。有研究表明^[32]轮作能够显著降低烤烟土壤中子囊菌门的相对丰度。在本研究中（表3），连作显著性增加了合作 88、丽薯 6 号马铃薯品种土壤中子囊菌门的相对丰度，而轮作在整体上降低了土壤中子囊菌门的相对丰度。虽然连作、轮作均降低了 3 个马铃薯品种土壤中担子菌门（除 C 处理外）的相对丰度，但轮作处理（除 H 处理外）对担子菌门的降低效果远大于连作处理，说明轮作可以减少土壤中的病原菌，改善土壤微环境，从而减轻作物病虫害。Qin 等^[33]研究证实马铃薯连作处理中的子囊菌的相对丰度显著高于其他轮作处理。本研究中 （表4），与 3 个马铃薯品种的连作处理（A、B、 C）相比，轮作处理显著降低了土壤中子囊菌门的丰度（除 J 处理外），降低了土壤中担子菌门的丰度（除Ⅰ处理外）。此外，在本研究中，与连作相比，轮作增加了云南 3 个马铃薯主栽品种中壶菌门的相对丰度（除Ⅰ处理外），与 Lyu 等^[28]表明的与番茄连作相比，轮作芹菜显著增加了壶菌门的相对丰度的研究结果一致。

有学者证实癣囊腔菌属和炭疽菌属是土壤中的有害病原体^[34-36]，炭疽菌属作为烟草的有害病原真菌，严重影响着烟草的正常生长发育^[10]。在本研究中（表5），连作极显著增加了合作 88 马铃薯品种的癣囊腔菌属相对丰度，显著增加了丽薯 6 号马铃薯品种炭疽菌属的相对丰度，这可能增加马铃薯某些病害的发病率。而 3 个马铃薯品种的 E、F、 G 轮作处理分别显著降低了癣囊腔菌属、炭疽菌属的相对丰度。Qin 等^[33]证实，马铃薯连作处理的癣囊腔菌属和炭疽菌属的丰度都显著高于马铃薯的轮作处理。在本研究中（表6），与连作处理相比，轮作（除 J 处理外）分别显著降低了 3 个马铃薯品种土壤中癣囊腔菌、子囊菌门中未分类属的丰度，降低了炭疽菌属的相对丰度。

连作使土壤中的病原菌富集，绝大部分为镰孢菌属等土传病害真菌^[37]，并随着连作年限的增加逐步发展为优势菌，从而引起马铃薯枯萎病等土传病害，最终使连作障碍更加严重^[38]。前人的研究表明大豆^[24]、棉花^[25]连作增加镰孢菌属的丰度，大豆连作、小麦连作、玉米连作后的潜在致病菌（镰孢菌属）的相对丰度显著高于轮作^[26]；马铃薯-玉米轮作后根际土壤中镰孢菌属相对丰度较马铃薯连作显著降低^[39]。在本研究中（表6），与丽薯 6 号、青薯 9 号的连作处理相比，轮作处理土壤中镰孢菌属的相对丰度均呈下降趋势，说明轮作后土壤中致病菌属丰度明显降低。

此外，连作对云南地区 3 个马铃薯主栽品种根际真菌群落结构的影响存在较大差异（表3、表5）。整体上，连作对合作 88、丽薯 6 号马铃薯产生的变化较相似，与青薯 9 号差别较大。具体表现为，连作均增加了合作 88、丽薯 6 号子囊菌门的丰度，降低了罗兹菌门、镰饱菌属、担子菌门中未分类属的丰度，青薯 9 号与其相反。图3、4 的研究结果也表明，合作 88 与丽薯 6 号马铃薯连作后真菌群落组成和丰度较相似，区别于青薯 9 号。造成这种差异的原因可能是不同的马铃薯品种对短期连作的耐受程度存在差异，从而导致对连作变化的响应不同，最终影响了土壤真菌群落结构，但长期连作对合作 88、丽薯 6 号、青薯 9 号马铃薯真菌群落结构的影响有待进一步探究。

综上所述，云南地区 3 个马铃薯主栽品种在真菌群落结构和相对丰度上差异较大，马铃薯轮作土壤中子囊菌门、担子菌门、癣囊腔菌属、炭疽菌属的相对丰度显著低于连作处理。相对于连作，马铃薯轮作减少了土壤中潜在病原真菌的数量，维持了土壤环境。

参考文献